ഇപ്പോഴത്തെ വിലാസം: OX11 0DE, UK, ഡയമണ്ട് ബിൽഡിംഗ്, ഹാർവെൽ സയൻസ് ആൻഡ് ഇന്നൊവേഷൻ പാർക്ക്, ഡയറ്റ്കോട്ട്, ഓക്സ്ഫോർഡ്ഷയർ, UK, ഡയമണ്ട് ലൈറ്റ് സോഴ്സ് കമ്പനി ലിമിറ്റഡ്, ഇലക്ട്രോണിക് ബയോളജിക്കൽ ഇമേജിംഗ് സെന്റർ.
പർപ്പിൾ ഫോട്ടോട്രോഫിക് ബാക്ടീരിയയുടെ പ്രധാന ഫോട്ടോസിന്തറ്റിക് ഘടകമാണ് പ്രതിപ്രവർത്തന കേന്ദ്രമായ ലൈറ്റ്-ഹാർവെസ്റ്റിംഗ് കോംപ്ലക്സ് 1 (RC-LH1). റോഡോപ്സ്യൂഡോമോണസ് പാലസ്ട്രിസിൽ നിന്ന് RC-LH1 സമുച്ചയത്തിന്റെ രണ്ട് ക്രയോ-ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി ഘടനകൾ ഞങ്ങൾ അവതരിപ്പിച്ചു. RC-LH114-W സമുച്ചയത്തിന്റെ 2.65-Å റെസല്യൂഷൻ ഘടനയിൽ RC ചുറ്റുമുള്ള 14 സബ്യൂണിറ്റ് LH1 ലൂപ്പുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഇത് പ്രോട്ടീൻ W തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു, അതേസമയം പ്രോട്ടീൻ-W ഇല്ലാത്ത സമുച്ചയം RC കൊണ്ട് ചുറ്റപ്പെട്ട പൂർണ്ണമായും RC ഘടനയാണ്. അടച്ച 16 സബ്യൂണിറ്റ് LH1 ലൂപ്പ്. ഈ ഘടനകളുടെ താരതമ്യം RC-LH1 സമുച്ചയത്തിലെ ക്വിനോണിന്റെ ചലനാത്മകതയെക്കുറിച്ചുള്ള ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകുന്നു, RC QB സൈറ്റിൽ ക്വിനോൺ ബൈൻഡ് ചെയ്യുമ്പോൾ മുമ്പ് നിർണ്ണയിക്കാത്ത അനുരൂപമായ മാറ്റങ്ങളും സഹായ ക്വിനോൺ ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകളുടെ സ്ഥാനവും ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു, അവ RC-ലേക്ക് കൈമാറാൻ സഹായിക്കുന്നു. W പ്രോട്ടീന്റെ അതുല്യമായ ഘടന LH1 ലൂപ്പ് അടയ്ക്കുന്നത് തടയുന്നു, അതുവഴി ക്വിനോൺ/ക്വിനോലോൺ കൈമാറ്റം ത്വരിതപ്പെടുത്തുന്നതിന് ഒരു ചാനൽ സൃഷ്ടിക്കുന്നു.
പ്രകാശസംശ്ലേഷണം നൽകുന്ന ഊർജ്ജം ഭൂമിയിലെ മിക്കവാറും എല്ലാ ജീവജാലങ്ങളെയും നിലനിർത്താൻ കഴിയും, കൂടാതെ ഇതിന് സോളാർ ബയോടെക്നോളജിക്ക് വലിയ സാധ്യതയുണ്ട്. ആഗോള പ്രകാശസംശ്ലേഷണം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുമ്പോൾ, പർപ്പിൾ ഫോട്ടോട്രോഫിക് ബാക്ടീരിയകൾ വിവിധ ഊർജ്ജ രീതികളും ഉപാപചയ കഴിവുകളും പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു. അവയ്ക്ക് പ്രകാശസംശ്ലേഷണം ഒഴിവാക്കാനും ഇരുട്ടിൽ ഹെറ്ററോട്രോഫിക് ബാക്ടീരിയകളായി വളരാനും നൈട്രജനും കാർബൺ ഡൈ ഓക്സൈഡും പരിഹരിക്കാനും ഹൈഡ്രജൻ ഉത്പാദിപ്പിക്കാനും ആരോമാറ്റിക് സംയുക്തങ്ങളെ നശിപ്പിക്കാനും കഴിയും (1-3). ഈ പ്രക്രിയകൾക്ക് ഊർജ്ജം നൽകുന്നതിന്, പ്രകാശം വേഗത്തിലും കാര്യക്ഷമമായും രാസ ഊർജ്ജമാക്കി മാറ്റണം. ലൈറ്റ്-ട്രാപ്പിംഗ് ആന്റിന കോംപ്ലക്സ് പ്രകാശം ആഗിരണം ചെയ്ത് കുടുങ്ങിയ ഊർജ്ജത്തെ പ്രതിപ്രവർത്തന കേന്ദ്രത്തിലേക്ക് (RC) മാറ്റുമ്പോൾ ഈ പ്രക്രിയ ആരംഭിക്കുന്നു, അതുവഴി ചാർജ് വേർതിരിക്കൽ ആരംഭിക്കുന്നു (4 - 7). പർപ്പിൾ ഫോട്ടോട്രോഫിക് ബാക്ടീരിയയിലെ പ്രകാശസംശ്ലേഷണത്തിന്റെ അടിസ്ഥാന യൂണിറ്റ് ടൈപ്പ് 2 RC കൊണ്ടാണ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്, പ്രകാശ-കൊയ്ത്ത് സമുച്ചയം 1 (LH1) കൊണ്ട് ചുറ്റപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് RC-LH1 കോർ കോംപ്ലക്സ് രൂപപ്പെടുത്തുന്നു. വളഞ്ഞ αβ ഹെറ്ററോഡൈമറുകളുടെ ഒരു നിരയാണ് LH1 രൂപപ്പെടുന്നത്, അവയിൽ ഓരോന്നും രണ്ട് ബാക്ടീരിയൽ ക്ലോറോഫിൽ (BChl) a തന്മാത്രകളെയും ഒന്നോ രണ്ടോ കരോട്ടിനോയിഡുകളെയും (8-12) ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു. ഏറ്റവും ലളിതമായ LH1 ആന്റിനയിൽ RC (9-13) നെ ഒരു ക്ലോസ്ഡ് ലൂപ്പിൽ വലയം ചെയ്യുന്ന 16 അല്ലെങ്കിൽ 17 αβ ഹെറ്ററോഡൈമറുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, എന്നാൽ മറ്റ് കോർ കോംപ്ലക്സുകളിൽ, ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ പെപ്റ്റൈഡുകൾ ചുറ്റുമുള്ള LH1 ന്റെ തുടർച്ചയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു, അതുവഴി RC യും സൈറ്റോക്രോം bc1 കോംപ്ലക്സും തമ്മിലുള്ള ക്വിനോൾ/ക്വിനോൺ വ്യാപനം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു (11, 13-15). പർപ്പിൾ ഫോട്ടോട്രോഫിക് സസ്യമായ റോഡോപ്സ്യൂഡോമോണസ് (Rps.) പ്രകാശസംശ്ലേഷണത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്ന ഊർജ്ജവും ഇലക്ട്രോൺ കൈമാറ്റവും മനസ്സിലാക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു മാതൃകാ ജീവിയാണ്. Rps ന്റെ ആദ്യ ക്രിസ്റ്റൽ ഘടന. പാലസ്ട്രിസ് RC-LH1 സമുച്ചയത്തിന്റെ മാതൃക RC ആണ്, ചുറ്റും 15 ഹെറ്ററോഡൈമെറിക് LH1 ലൂപ്പുകൾ ഉണ്ട്, അവ "പ്രോട്ടീൻ W" (14) എന്ന അജ്ഞാത പ്രോട്ടീൻ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു. പ്രോട്ടീൻ-W പിന്നീട് RPA4402 ആയി തിരിച്ചറിഞ്ഞു, ഇത് മൂന്ന് പ്രവചിക്കപ്പെട്ട ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ ഹെലിസുകൾ (TMH) ഉള്ള ഒരു സ്വഭാവമില്ലാത്ത 10.5kDa പ്രോട്ടീനാണ് (16). RC-L, M (pufL, pufM), LH1α, β (pufA, pufB) ഉപയൂണിറ്റുകൾ എന്നിവ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ജീനുകൾക്ക് ഉപയോഗിക്കുന്ന നാമകരണവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നതിന് rpa4402 ജീൻ എൻകോഡിംഗ് പ്രോട്ടീൻ W നെ pufW എന്ന് പുനർനാമകരണം ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, RC-LH1 ന്റെ ഏകദേശം 10% ൽ മാത്രമേ പ്രോട്ടീൻ-W ഉള്ളൂ, ഇത് Rps. പാലുസ്ട്രിസ് രണ്ട് വ്യത്യസ്ത RC-LH1 കോംപ്ലക്സുകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തുന്നു. ഇവിടെ, രണ്ട് കോർ കോംപ്ലക്സുകളുടെ ഉയർന്ന റെസല്യൂഷൻ ക്രയോ-EM (ക്രയോ-EM) ഘടനകൾ ഞങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു, ഒന്ന് പ്രോട്ടീൻ W ഉം 14 αβ ഹെറ്ററോഡൈമറുകളും, മറ്റൊന്ന് പ്രോട്ടീൻ W ഉം അടച്ച 16 ഹെറ്ററോഡൈമർ LH1 ലൂപ്പും ഇല്ലാതെ. Rps. പാലുസ്ട്രിസിന്റെ RC-LH1 കോംപ്ലക്സിനെ മനസ്സിലാക്കുന്നതിലെ ഒരു ഘട്ട മാറ്റത്തെ ഞങ്ങളുടെ ഘടന പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, കാരണം ഓരോ വേരിയന്റിന്റെയും ഏകതാനമായ ജനസംഖ്യ ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ ഓരോ പെപ്റ്റൈഡും ബന്ധിത പിഗ്മെന്റുകളും അനുബന്ധ ലിപിഡുകളും ക്വിനോണുകളും വ്യക്തമായി നൽകുന്നതിന് മതിയായ റെസല്യൂഷനുമുണ്ട്. ഈ ഘടനകളുടെ താരതമ്യം കാണിക്കുന്നത് ഇതുവരെ മറ്റൊരു RC-LH1 സമുച്ചയത്തിലും കണ്ടെത്തിയിട്ടില്ലാത്ത മൂന്ന് TMH പ്രോട്ടീനുകൾ-W, ക്വിനോൺ/ക്വിനോലോൺ കൈമാറ്റം ത്വരിതപ്പെടുത്തുന്നതിന് ഒരു ക്വിനോൺ ചാനൽ സൃഷ്ടിക്കുന്നു എന്നാണ്. നിരവധി സംരക്ഷിത ലിപിഡ്, ക്വിനോൺ ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ ക്വിനോണിന്റെയും RC യുടെയും സംയോജനത്തിനുശേഷം ഒരു പുതിയ രൂപാന്തര മാറ്റം ഞങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്, ഇത് ഓക്സിജൻ അടങ്ങിയ ഫോട്ടോട്രോഫിക് ജീവികളുടെ ഫോട്ടോസിസ്റ്റം II (PSII) RC-ക്ക് അനുയോജ്യമായിരിക്കാം. പർപ്പിൾ ഫോട്ടോട്രോഫിക് ബാക്ടീരിയയുടെ RC-LH1 കോർ കോംപ്ലക്സിലെ ക്വിനോൺ/ക്വിനോലോൺ ബൈൻഡിംഗിന്റെയും കൈമാറ്റത്തിന്റെയും ചലനാത്മകതയെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ പുതിയ ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകുന്നു.
Rps. palustris-ൽ കാണപ്പെടുന്ന രണ്ട് കോംപ്ലക്സുകളെക്കുറിച്ചുള്ള വിശദമായ പഠനം സുഗമമാക്കുന്നതിന്, ബയോകെമിക്കൽ രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ ഓരോ RC-LH1-ഉം വേർതിരിക്കുന്നു. pufW ജീൻ (16) ഇല്ലാത്ത സ്ട്രെയിനിൽ നിന്ന് പ്രോട്ടീൻ W-കുറവുള്ള കോംപ്ലക്സ് (ഇനിമുതൽ ΔpufW എന്ന് വിളിക്കുന്നു) ശുദ്ധീകരിച്ചു, ഒരു RC-LH1 കോംപ്ലക്സ് മാത്രമേ ഉത്പാദിപ്പിക്കാൻ കഴിയൂ. പ്രോട്ടീൻ W-അടങ്ങിയ കോംപ്ലക്സ് ഒരു സ്ട്രെയിനിൽ നിന്നാണ് ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നത്. ഈ സ്ട്രെയിനിന്റെ പ്രോട്ടീൻ W അതിന്റെ സി-ടെർമിനസിൽ 10x ഹിസ് ടാഗ് ഉപയോഗിച്ച് പരിഷ്കരിക്കുന്നു, അങ്ങനെ പ്രോട്ടീൻ W-അടങ്ങിയ കോംപ്ലക്സിനെ ലോഹത്തെ നിശ്ചലമാക്കുന്നതിലൂടെ ഏറ്റവും കുറവുള്ള പ്രോട്ടീൻ W-യുമായി ഫലപ്രദമായി സംയോജിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. സമുച്ചയം ഫലപ്രദമായി വേർതിരിക്കപ്പെടുന്നു (16) അഫിനിറ്റി ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി (IMAC).
ചിത്രം 1-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, രണ്ട് സമുച്ചയങ്ങളിലും ഒരു LH1 ആന്റിനയാൽ ചുറ്റപ്പെട്ട മൂന്ന് ഉപ-യൂണിറ്റ് RC (RC-L, RC-M, RC-H) അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. പ്രോട്ടീൻ-W ഇല്ലാത്ത സമുച്ചയത്തിന്റെ 2.80-A ഘടന 16 αβ ഹെറ്ററോഡൈമറുകൾ കാണിക്കുന്നു, ഇത് RC-യെ പൂർണ്ണമായും ചുറ്റിപ്പറ്റിയുള്ള ഒരു അടച്ച LH1 ലൂപ്പ് ഉണ്ടാക്കുന്നു, ഇനി മുതൽ RC-LH116 സമുച്ചയം എന്ന് വിളിക്കുന്നു. പ്രോട്ടീൻ-W-അടങ്ങിയ സമുച്ചയത്തിന്റെ 2.65Å ഘടനയിൽ പ്രോട്ടീൻ-W തടസ്സപ്പെടുത്തിയ 14-ഹെറ്ററോഡൈമർ LH1 ഉണ്ട്, ഇനി മുതൽ RC-LH114-W എന്ന് വിളിക്കുന്നു.
(A, B) സംയുക്തത്തിന്റെ ഉപരിതല പ്രതിനിധാനം. (C, D) ദണ്ഡുകളിൽ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ബോണ്ടഡ് പിഗ്മെന്റുകൾ. (E, F) സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് പ്രതലത്തിൽ നിന്ന് നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന സമുച്ചയങ്ങളിൽ കാർട്ടൂണുകളിൽ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകളും LH1 ഉപയൂണിറ്റുകളും ഉണ്ട്, കൂടാതെ പ്രോട്ടീൻ-W വിടവിൽ നിന്ന് ഘടികാരദിശയിൽ അക്കമിട്ടിരിക്കുന്നു [Rba നമ്പറിംഗുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. sphaeroides complex (13)]. LH1-α-യ്ക്ക്, പ്രോട്ടീൻ ഉപയൂണിറ്റിന്റെ നിറം മഞ്ഞയാണ്; LH1-β-യ്ക്ക്, പ്രോട്ടീൻ ഉപയൂണിറ്റിന്റെ നിറം നീലയാണ്; പ്രോട്ടീൻ-W-ക്ക്, പ്രോട്ടീൻ ചുവപ്പാണ്; RC-H-ന്, ഇത് സിയാൻ ആണ്; RC-L-ന്, ഇത് ഓറഞ്ച് ആണ്; RC-M-ന്, മജന്തയാണ്. സഹഘടകങ്ങളെ ദണ്ഡുകളാൽ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, പച്ച BChl, BPh a തന്മാത്രകളെയും, പർപ്പിൾ കരോട്ടിനോയിഡുകളെയും, മഞ്ഞ UQ10 തന്മാത്രകളെയും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. (G, H) RC-LH114-W സമുച്ചയം (G), RC-LH116 സമുച്ചയം (H) എന്നിവയുടെ തുല്യ മേഖലയിലെ പ്രോട്ടീൻ-W വിടവിന്റെ മാഗ്നിഫൈഡ് വ്യൂ. കോഫാക്ടറുകൾ സ്പേസ് ഫില്ലിംഗിന്റെ രൂപത്തിലും, ചേലേറ്റഡ് ക്വിനോൺ നീല നിറത്തിലും പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. പ്രോട്ടീൻ-W വിടവ് (G)-ൽ നീല ഡാഷ്ഡ് ലൈൻ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ LH116 റിംഗിൽ ക്വിനോൺ/ക്വിനോലോൾ വ്യാപിക്കുന്ന ചെറിയ ദ്വാരങ്ങൾ (H)-ൽ കറുത്ത ഡാഷ്ഡ് ലൈൻ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു.
ചിത്രം 1 (A, B) എന്നിവ LH1αβ ഹെറ്ററോഡൈമറുകളുടെ തുറന്നതോ അടച്ചതോ ആയ ശ്രേണികളാൽ ചുറ്റപ്പെട്ട RC കാണിക്കുന്നു, അവയിൽ ഓരോന്നും രണ്ട് BChl ഉം ഒരു കരോട്ടിനോയിഡും ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 1, C, D). മുൻ പഠനങ്ങൾ Rps എന്നത് LH1 സമുച്ചയമാണെന്ന് തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. സ്പിരുലിന സാന്തിന്റെ ബയോസിന്തറ്റിക് പാതയിൽ, ഈ ഇനങ്ങളിൽ കരോട്ടിനോയിഡുകളുടെ മിശ്രിത ജനസംഖ്യ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു (17). എന്നിരുന്നാലും, സ്പൈറോപൈറോക്സാന്തിൻ പ്രബലമായ കരോട്ടിനോയിഡാണ്, അതിന്റെ സാന്ദ്രത തൃപ്തികരമാണ്. അതിനാൽ, എല്ലാ LH1 ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകളിലും സ്പൈറോക്സാന്തിനെ മാതൃകയാക്കാൻ ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു. ആൽഫയും ബീറ്റ പോളിപെപ്റ്റൈഡുകളും ചെറിയ മെംബ്രൻ പുറം മേഖലകളുള്ള ഒറ്റ TMH-കളാണ് (ചിത്രം 1, A, B, E, F). സി-ടെർമിനസിൽ 17 അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ സാന്ദ്രത നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ലെങ്കിലും, രണ്ട് സമുച്ചയങ്ങളിലും ആൽഫ പോളിപെപ്റ്റൈഡ് Met1 മുതൽ Ala46 വരെ പിളർന്നു. RC-LH116-ൽ β പോളിപെപ്റ്റൈഡ് Gly4-ൽ നിന്ന് Tyr52 ആയും, RC-LH114-W-ൽ Ser5-ൽ നിന്ന് Tyr52 ആയും കുറഞ്ഞു. 3 അല്ലെങ്കിൽ 4 N-ടെർമിനൽ അല്ലെങ്കിൽ 13 C-ടെർമിനൽ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ സാന്ദ്രത നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ല (ചിത്രം S1). വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് സ്ട്രെയിനിൽ നിന്ന് തയ്യാറാക്കിയ മിക്സഡ് RC-LH1 കോംപ്ലക്സിന്റെ മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി വിശകലനം, കാണാതായ പ്രദേശം ഈ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഹെറ്ററോളോജസ് പിളർപ്പിന്റെ ഫലമാണെന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം S1, S2). α-Met1 ന്റെ N-ടെർമിനൽ ഫോർമിലേഷനും നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (f). α-പെപ്റ്റൈഡിൽ fMet1 മുതൽ Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 വരെയുള്ള അവശിഷ്ടങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നുവെന്നും β-പെപ്റ്റൈഡിൽ Ser2 മുതൽ Ala53 വരെയുള്ള അവശിഷ്ടങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നുവെന്നും വിശകലനം കാണിച്ചു, ഇത് കുറഞ്ഞ താപനില EM സാന്ദ്രത മാപ്പുമായി നല്ല യോജിപ്പിലാണ്.
α-His29, β-His36 എന്നിവയുടെ ഏകോപനം BChls-നെ മുഖാമുഖം കാണിക്കുന്നു; ഓരോ αβ ഹെറ്ററോഡൈമറും അതിന്റെ അയൽക്കാരുമായി ഒത്തുചേർന്ന് RC-ന് ചുറ്റും ഒരു തുറന്ന ലൂപ്പ് (RC-LH114-W) അല്ലെങ്കിൽ ഒരു അടച്ച ലൂപ്പ് (RC-LH116) ഉണ്ടാക്കുന്നു. എക്സൈറ്റോൺ കപ്പിൾഡ് പിഗ്മെന്റ് അറേ (ചിത്രം 1, C, D). RC-LH114-W ന്റെ 877 nm ബാൻഡുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, RC-LH116 ന്റെ 880 nm അബ്സോർപ്ഷൻ റെഡ് ഷിഫ്റ്റ് 3 nm ആണ് (ചിത്രം 2A). എന്നിരുന്നാലും, വൃത്താകൃതിയിലുള്ള ഡൈക്രോയിസം സ്പെക്ട്രം ഏതാണ്ട് സമാനമാണ് (ചിത്രം 2B), ഇത് തുറന്നതും അടച്ചതുമായ ലൂപ്പുകൾക്കിടയിൽ വ്യക്തമായ വ്യത്യാസമുണ്ടെങ്കിലും, BChls-ന്റെ പ്രാദേശിക പരിസ്ഥിതി വളരെ സമാനമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ആഗിരണം റെഡ് ഷിഫ്റ്റ് കുറഞ്ഞ താപ ചലനത്തിന്റെയും അടച്ച ലൂപ്പിലെ വർദ്ധിച്ച സ്ഥിരതയുടെയും (18, 19), അടച്ച ലൂപ്പ് മൂലമുണ്ടാകുന്ന പിഗ്മെന്റ് കപ്ലിങ്ങിലെ മാറ്റത്തിന്റെയും (20, 21) അല്ലെങ്കിൽ ഈ രണ്ട് ഇഫക്റ്റുകളുടെയും സംയോജനത്തിന്റെ ഫലമായിരിക്കാം (11).
(എ) അൾട്രാവയലറ്റ്/ദൃശ്യം/സമീപ-ഇൻഫ്രാറെഡ് ആഗിരണം സ്പെക്ട്രം, ഇവയുടെ കൊടുമുടികൾ അവയുടെ അനുബന്ധ പിഗ്മെന്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് അടയാളപ്പെടുത്തി 775 nm-ൽ BPh കൊടുമുടിയിലേക്ക് സാധാരണവൽക്കരിക്കുന്നു. (ബി) 805 nm-ൽ BChl ആഗിരണം ലേക്ക് സാധാരണവൽക്കരിക്കുന്ന വൃത്താകൃതിയിലുള്ള ഡൈക്രോയിസം സ്പെക്ട്രം. (സി, ഡി) RC-LH114-W കോംപ്ലക്സ് (C) യുടെയും RC-LH116 കോംപ്ലക്സ് (D) യുടെയും സമയ-പരിഹരിച്ച ആഗിരണം സ്പെക്ട്രയിൽ നിന്ന് തിരഞ്ഞെടുത്ത ΔA സ്പെക്ട്ര. മികച്ച താരതമ്യത്തിനായി, എല്ലാ സ്പെക്ട്രകളെയും 0.2 ps-ൽ −A യുടെ ∆A ആയി സാധാരണവൽക്കരിക്കുന്നു. (ഇ) UQ2 ന്റെ വിവിധ സാന്ദ്രതകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ വികിരണത്തിനുശേഷം സൈറ്റോക്രോം c2 ഓക്സിഡേഷന്റെ നിരക്ക് (അസംസ്കൃത ഡാറ്റയ്ക്കായി ചിത്രം S8 കാണുക). (എഫ്) താഴ്ന്ന, ഇടത്തരം അല്ലെങ്കിൽ ഉയർന്ന തീവ്രതയുള്ള പ്രകാശത്തിൽ വളരുന്ന കോശങ്ങളിൽ (യഥാക്രമം 10, 30 അല്ലെങ്കിൽ 300μMm-2 s-1), ശുദ്ധീകരിച്ച സമുച്ചയത്തിലെ പ്രോട്ടീൻ W, RC-L ഉപയൂണിറ്റുകൾ, വേർതിരിച്ച മെംബ്രൺ അനുപാതം. SDS-പോളിയാക്രിലാമൈഡ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസും ഇമ്മ്യൂണോഅസ്സേയും ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ നില നിർണ്ണയിക്കുക (അസംസ്കൃത ഡാറ്റയ്ക്കായി ചിത്രം S9 കാണുക). ശുദ്ധീകരിച്ച RC-LH114-W സമുച്ചയവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട അനുപാതം നിർണ്ണയിക്കുക. സമുച്ചയത്തിന്റെ RC-L ന്റെ പ്രോട്ടീൻ-W ന്റെ സ്റ്റോയിക്കിയോമെട്രിക് അനുപാതം 1:1 ആണ്.
RC-LH114-W യുടെ വികലമായ αβ14 ലൂപ്പിൽ 1 സ്ഥാനത്തുള്ള BChls (ചിത്രം 1, A, C, E) RC-LH116 ലെ തുല്യമായ BChls നെ അപേക്ഷിച്ച് 6.8Å കൂടുതൽ RC പ്രൈമറി ദാതാവിനോട് (P) അടുത്താണ് (ചിത്രം 1, B, D, F, ചിത്രം S3); എന്നിരുന്നാലും, രണ്ട് സമുച്ചയങ്ങളുടെയും ക്ഷണികമായ ആഗിരണം ചലനാത്മകത കാണിക്കുന്നത് RC-LH114-W, RC-LH116 എന്നിവയ്ക്ക്, LH1 മുതൽ RC വരെയുള്ള ഉത്തേജന ഊർജ്ജ കൈമാറ്റ സമയ സ്ഥിരാങ്കങ്ങൾ 40 ±4 ഉം 44±3 ps ഉം ആണെന്നാണ് (ചിത്രം 2). , C, D, ചിത്രം S4, പട്ടിക S2). RC-യിലെ ഇലക്ട്രോണിക് കൈമാറ്റത്തിലും കാര്യമായ വ്യത്യാസമില്ല (ചിത്രം S5 ഉം അനുബന്ധ സപ്ലിമെന്ററി ടെക്സ്റ്റും). LH1 നും RC-P നും ഇടയിലുള്ള ഊർജ്ജ കൈമാറ്റ സമയത്തിന്റെ അടുത്ത പൊരുത്തക്കേട് രണ്ട് LH1 ലൂപ്പുകളിലെ മിക്ക BChl ന്റെയും സമാനമായ ദൂരം, ആംഗിൾ, പൊട്ടൻഷ്യൽ എനർജി എന്നിവ മൂലമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ സംശയിക്കുന്നു. ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ ദൂരത്തിലെത്താൻ LH1 ഊർജ്ജ പാറ്റേൺ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യുന്നത് സബ്ഒപ്റ്റിമൽ സൈറ്റുകളിൽ നിന്ന് RC-ലേക്ക് നേരിട്ടുള്ള ഊർജ്ജ കൈമാറ്റത്തേക്കാൾ വേഗത്തിലല്ലെന്ന് തോന്നുന്നു. RC-LH114-W ലെ ഓപ്പൺ-ലൂപ്പ് LH1 ലൂപ്പ് ഘടനാപരമായ വിശകലനത്തിനായി താഴ്ന്ന താപനില സാഹചര്യങ്ങളിൽ അപ്രധാനമായ താപ ചലനത്തിന് വിധേയമായേക്കാം, കൂടാതെ RC 1 ന്റെ സ്ഥാനത്ത് βBChls ന്റെ പിഗ്മെന്റേഷൻ ദൂരത്തിൽ നിന്ന് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ദൈർഘ്യമേറിയ αβ14 റിംഗ് കൺഫോർമേഷൻ ഉണ്ട്.
RC-LH116 സമുച്ചയത്തിൽ 32 BChls ഉം 16 കരോട്ടിനോയിഡുകളും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ അതിന്റെ മൊത്തത്തിലുള്ള ക്രമീകരണം തെർമോക്രോമേഷ്യം (Tch.) പിഡ്പിഡം [പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റ ബാങ്ക് (PDB) ID 5Y5S] (9), തിയോർഹോഡോവിബ്രിയോ (Trv.) 970 സ്ട്രെയിൻ (PDB ID 7C9R) (12), പച്ച ആൽഗകൾ (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) എന്നിവയിൽ നിന്ന് ലഭിച്ചതിന് സമാനമാണ്. വിന്യാസത്തിനുശേഷം, αβ ഹെറ്ററോഡൈമറുകളുടെ സ്ഥാനങ്ങളിൽ ചെറിയ വ്യതിയാനങ്ങൾ മാത്രമേ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളൂ, പ്രത്യേകിച്ച് 1-5, 15, 16 (ചിത്രം S6). പ്രോട്ടീൻ-W യുടെ സാന്നിധ്യം LH1 ന്റെ ഘടനയിൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു. അതിന്റെ മൂന്ന് TMH-കൾ ചെറിയ ലൂപ്പുകളാൽ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, സമുച്ചയത്തിന്റെ ല്യൂമെൻ വശത്ത് N-ടെർമിനലും സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് വശത്ത് C-ടെർമിനലും (ചിത്രങ്ങൾ 1A, 3, A മുതൽ D വരെ). പ്രോട്ടീൻ-W പ്രധാനമായും ഹൈഡ്രോഫോബിക് ആണ് (ചിത്രം 3B), കൂടാതെ TMH2 ഉം TMH3 ഉം LH1αβ-14 മായി സംവദിച്ച് ഒരു ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ ഉപരിതലം ഉണ്ടാക്കുന്നു (ചിത്രം 3, B, E മുതൽ G വരെ). ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ മേഖലയിലെ Phe, Leu, Val അവശിഷ്ടങ്ങൾ പ്രധാനമായും ഈ ഇന്റർഫേസിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ഈ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഹൈഡ്രോഫോബിക് അമിനോ ആസിഡുകളും αβ-14 പിഗ്മെന്റുകളും കൊണ്ട് അടുക്കിയിരിക്കുന്നു. സങ്കീർണ്ണമായ അറയുടെ ഉപരിതലത്തിൽ W-Thr68 ഉം β-Trp42 ഉം തമ്മിലുള്ള ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ട് ഉൾപ്പെടെ ചില ധ്രുവ അവശിഷ്ടങ്ങളും പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന് കാരണമാകുന്നു (ചിത്രം 3, F, G). സൈറ്റോപ്ലാസത്തിന്റെ ഉപരിതലത്തിൽ, Gln34 αβ-14 കരോട്ടിനോയിഡുകളുടെ കീറ്റോ ഗ്രൂപ്പിനോട് ചേർന്നാണ്. കൂടാതെ, n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) തന്മാത്ര പരിഹരിക്കപ്പെട്ടു, അതിന്റെ ഹൈഡ്രോഫോബിക് വാൽ പ്രോട്ടീൻ-W നും αβ-14 നും ഇടയിലുള്ള ഇന്റർഫേസിലേക്ക് വ്യാപിപ്പിച്ചു, കൂടാതെ ലിപിഡ് വാൽ ശരീരത്തിൽ സ്ഥിതിചെയ്യാം. പ്രോട്ടീൻ W, RCH എന്നിവയുടെ സി-ടെർമിനൽ റെസല്യൂഷൻ മേഖലകൾ വളരെ അടുത്താണെന്നും എന്നാൽ നിർദ്ദിഷ്ട ഇടപെടലുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന്റെ പരിധിയിൽ വരുന്നില്ലെന്നും ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 1, A, E). എന്നിരുന്നാലും, ഈ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളുടെയും പരിഹരിക്കപ്പെടാത്ത സി-ടെർമിനൽ അമിനോ ആസിഡുകളിൽ ഇടപെടലുകൾ ഉണ്ടാകാം, ഇത് RC-LH114-W സമുച്ചയത്തിന്റെ അസംബ്ലി സമയത്ത് പ്രോട്ടീൻ-W റിക്രൂട്ട്‌മെന്റിന് ഒരു സംവിധാനം നൽകിയേക്കാം.
(എ) കാർട്ടൂൺ രൂപത്തിൽ LH1αβ14 ഉള്ള ഇന്റർഫേസിനെ അഭിമുഖീകരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ-ഡബ്ല്യുവിന്, വടി ആകൃതിയിലുള്ള ഒരു സൈഡ് ചെയിൻ (ചുവപ്പ്) ഉണ്ട്, ഇത് ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് പൊട്ടൻഷ്യൽ ഡയഗ്രാമിന്റെ ഒരു ഭാഗത്ത് പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു (0.13 എന്ന കോണ്ടൂർ ലെവലുള്ള സുതാര്യമായ ചാരനിറത്തിലുള്ള പ്രതലം). (ബി) ഹൈഡ്രോഫോബിക് നിറമുള്ള പ്രതലത്താൽ പ്രതിനിധീകരിക്കപ്പെടുന്ന പ്രോട്ടീൻ-ഡബ്ല്യു. ധ്രുവ, ചാർജ്ജ് ചെയ്ത പ്രദേശങ്ങൾ സയാൻ നിറത്തിലും, ഹൈഡ്രോഫോബിക് പ്രദേശങ്ങൾ വെള്ള നിറത്തിലും, ശക്തമായി ഹൈഡ്രോഫോബിക് പ്രദേശങ്ങൾ ഓറഞ്ചിലും പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. (സി, ഡി) കാർട്ടൂണിൽ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ-ഡബ്ല്യു, അതിന്റെ ഓറിയന്റേഷൻ (എ) (സി) ലെ പോലെ തന്നെയാണ്, കൂടാതെ 180° (ഡി) കറങ്ങുന്നു. ക്രമത്തിലെ സ്ഥാനം അനുസരിച്ച്, വേർതിരിച്ചറിയാവുന്ന അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഒരു മഴവില്ല് വർണ്ണ സ്കീം സ്വീകരിക്കുന്നു, അവിടെ N-ടെർമിനൽ നീലയും C-ടെർമിനൽ ചുവപ്പുമാണ്. (ഇ) (എ) യിലെ അതേ കാഴ്ചയിൽ പ്രോട്ടീൻ-ഡബ്ല്യു, പ്രോട്ടീൻ-ഡബ്ല്യു:എൽഎച്ച്1 ന്റെ ഇന്റർഫേസിലെ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഘടിപ്പിച്ച അടയാളങ്ങളുള്ള വടികളാൽ പ്രതിനിധീകരിക്കപ്പെടുന്നു. (F) കാർട്ടൂൺ പ്രാതിനിധ്യത്തിൽ (E) ഉം LH1αβ14 ഉം ആപേക്ഷികമായും, ബാർ പ്രാതിനിധ്യത്തിലെ ഇന്റർഫേസ് അവശിഷ്ടങ്ങളുമായി ആപേക്ഷികമായും പ്രോട്ടീൻ-W 90° തിരിക്കുന്നു. ബീറ്റാ പോളിപെപ്റ്റൈഡിൽ നിന്നുള്ള ഓവർഹാംഗിംഗ് അവശിഷ്ടങ്ങൾ ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്നു. ചിത്രം 1 ന്റെ നിറവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ഒരു ബാറായി കോഫാക്ടറിനെ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, വിഘടിപ്പിച്ച β-DDM ചാരനിറത്തിലും, ഓക്സിജൻ ചുവപ്പിലും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. (G) ലേബൽ ചെയ്ത ആൽഫ പോളിപെപ്റ്റൈഡിന്റെ പ്രമുഖ അവശിഷ്ടങ്ങൾക്കൊപ്പം (F) ലെ കാഴ്ച 180° തിരിക്കുന്നു.
പ്രോട്ടീൻ-W ഒരു αβ ഹെറ്ററോഡൈമറിനെ (ചിത്രം 1F-ൽ 15-ാമത്തേത്) മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നു, അതുവഴി ലൂപ്പ് ക്ലോഷർ തടയുകയും ആദ്യത്തെ മൂന്ന് αβ ഹെറ്ററോഡൈമറുകൾ ചരിയുകയും ചെയ്യുന്നു. ഫിലിം നോർമലുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ആദ്യത്തെ αβ-1 ഹെറ്ററോഡൈമറിന്റെ പരമാവധി ചെരിവ് കോൺ 25° മുതൽ 29° വരെയാണെന്ന് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം 1, A, E), ഇത് RC A ഷാർപ്പ് കോൺട്രാസ്റ്റ്-LH116-ൽ αβ-1 ന്റെ 2° മുതൽ 8° വരെ ചെരിവ് മൂലമാണ് രൂപപ്പെട്ടത് (ചിത്രം 1, B, F). രണ്ടാമത്തെയും മൂന്നാമത്തെയും ഹെറ്ററോഡൈമറുകൾ യഥാക്രമം 12° മുതൽ 22° വരെയും 5° മുതൽ 10° വരെയും ചരിഞ്ഞിരിക്കുന്നു. RC-യുടെ സ്റ്റെറിക് തടസ്സം കാരണം, αβ-1 ന്റെ ചരിവിൽ αβ യുടെ രണ്ടാമത്തെ ജോഡി ഉൾപ്പെടുന്നില്ല (ഇത് ചിത്രം 1F-ലെ 16-ാമത്തെ αβ ന് സമാനമാണ്), അങ്ങനെ LH1 വളയത്തിൽ വ്യക്തമായ വിടവ് രൂപപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 1, A, E). രണ്ട് αβ ഹെറ്ററോഡൈമറുകളുടെ അഭാവം, നാല് BChl ഉം രണ്ട് കരോട്ടിനോയിഡുകളും നഷ്ടപ്പെടുന്നതിനൊപ്പം, കരോട്ടിനോയിഡുകളൊന്നും വളച്ചൊടിച്ച αβ-1 ഉപയൂണിറ്റുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നില്ല, അതിന്റെ ഫലമായി 13 കരോട്ടിനോയിഡുകൾ വെജിറ്റേറിയനും 28 BChl ഉം അടങ്ങിയ LH114-W വളയം ഉണ്ടാകുന്നു. αβ1 മുതൽ 7 വരെയുള്ള മേഖലകളിലെ രണ്ട് സമുച്ചയങ്ങളുടെയും പ്രാദേശിക റെസല്യൂഷൻ എസ്റ്റിമേറ്റുകൾ LH1 ലൂപ്പിന്റെ ബാക്കിയുള്ളവയേക്കാൾ കുറവാണ്, ഇത് RC QB സൈറ്റിനോട് ചേർന്നുള്ള LH1 ഉപയൂണിറ്റിന്റെ അന്തർലീനമായ പ്ലാസ്റ്റിസിറ്റിയെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കാം (ചിത്രം 4).
ചിത്രം 1 (B, D) ന്റെ അതേ മുകളിലെ കാഴ്ച/വശ കാഴ്ച (A, B) (A, C) യിൽ നിന്നും അറയുടെ ഉപരിതലത്തിൽ നിന്നുമാണ് RC-LH114-W (A, B) യുടെയും RC-LH116 (C, D) യുടെയും ചിത്രങ്ങൾ കാണിച്ചിരിക്കുന്നത്. നിറമുള്ള കീകൾ വലതുവശത്ത് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
1:14 എന്ന സ്റ്റോയിക്കിയോമെട്രിക് അനുപാതമുള്ള മറ്റൊരു സ്വഭാവ സവിശേഷതയായ കോർ കോംപ്ലക്സ് റോഡോകോക്കസ് സ്ഫെറോയിഡുകൾ (Rba.) RC-LH1-PufX ഡൈമർ (13) ആണ്. എന്നിരുന്നാലും, പ്രോട്ടീൻ W, PufX എന്നിവയ്ക്ക് വ്യക്തമായ ഒരു ഹോമോളജി ഇല്ല, കൂടാതെ അവയുടെ LH1 ഘടനകളിൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു. Rps. palustris LH116αβ-16 ന് സമാനമായ സ്ഥാനത്ത് RC-H ഉപയൂണിറ്റിന്റെ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് വശവുമായി (13) സംവദിക്കുന്ന N-ടെർമിനൽ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ഡൊമെയ്‌നുള്ള ഒരൊറ്റ TMH ആണ് PufX. RC-LH1 നും സൈറ്റോക്രോം bcl കോംപ്ലക്‌സിനും ഇടയിലുള്ള ക്വിനോൺ/ക്വിനോലോൺ കൈമാറ്റത്തിനായി PufX ഒരു ചാനൽ സൃഷ്ടിക്കുന്നു, കൂടാതെ എല്ലാ Rba. സ്ഫെറോയിഡുകൾ കോർ കോംപ്ലക്‌സിലും (13) ഉണ്ട്. മോണോമർ-മോണോമർ ഇന്റർഫേസ് Rba യിലാണെങ്കിലും. RC-LH114-W-ൽ പ്രോട്ടീൻ W-യുടെ ബൈൻഡിംഗ് സ്ഥാനത്താണ് സ്ഫെറോയിഡുകൾ RC-LH1-PufX ഡൈമർ സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്, കൂടാതെ PufX, പ്രോട്ടീൻ-W എന്നിവയാൽ പ്രേരിതമായ വിടവ് തുല്യ സ്ഥാനത്താണ് (ചിത്രം S7A). RC-LH114-W-ലെ വിടവ് സ്യൂഡോമോണസ് റോസിയ LH1-ന്റെ സാങ്കൽപ്പിക ക്വിനോൺ ചാനലുമായി (8) വിന്യസിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് പ്രോട്ടീൻ W അല്ലെങ്കിൽ PufX-മായി ബന്ധമില്ലാത്ത പെപ്റ്റൈഡുകളാൽ രൂപം കൊള്ളുന്നു (ചിത്രം S7B). കൂടാതെ, Blc-യിലെ ക്വിനോൺ ചാനൽ. ഒരു γ ഉപയൂണിറ്റ് (7) ഒഴിവാക്കി രൂപം കൊള്ളുന്ന മരതക പച്ച LH1 സമാനമായ സ്ഥാനത്താണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത് (ചിത്രം S7C). വ്യത്യസ്ത പ്രോട്ടീനുകൾ മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, RC-LH1 സമുച്ചയത്തിൽ ഒരു പൊതു സ്ഥാനത്ത് ഈ ക്വിനോൺ/ക്വിനോലോൾ ചാനലുകൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നത് കൺവേർജന്റ് പരിണാമത്തിന്റെ ഒരു ഉദാഹരണമായി തോന്നുന്നു, ഇത് പ്രോട്ടീൻ W സൃഷ്ടിച്ച വിടവ് ഒരു ക്വിനോൺ ചാനലായി പ്രവർത്തിച്ചേക്കാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
LH114-W ലൂപ്പിലെ വിടവ്, പ്രോട്ടീനുകളിലേതുപോലെ ഒരു പ്രോട്ടീൻ സുഷിരം വഴി രണ്ട് ഡൊമെയ്‌നുകളെ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുപകരം, RC-LH114-W കോംപ്ലക്‌സിന്റെയും ബൾക്ക് മെംബ്രണിന്റെയും (ചിത്രം 1G) ആന്തരിക ഇടത്തിനിടയിൽ ഒരു തുടർച്ചയായ മെംബ്രൻ മേഖല രൂപപ്പെടാൻ അനുവദിക്കുന്നു. RC-LH116 കോംപ്ലക്‌സ് ഒരു അടച്ച Tch-ന് സമാനമാണ്. സൂചി പോലുള്ള സമുച്ചയം (22) (ചിത്രം 1H). മെംബ്രണിലൂടെയുള്ള ക്വിനോണിന്റെ വ്യാപനം ഇടുങ്ങിയ പ്രോട്ടീൻ ചാനലിലൂടെയുള്ള വ്യാപനത്തേക്കാൾ വേഗതയേറിയതായതിനാൽ, തുറന്ന LH114-W ലൂപ്പിന് അടച്ച LH116 ലൂപ്പിനേക്കാൾ വേഗത്തിലുള്ള RC വിറ്റുവരവ് അനുവദിക്കാൻ കഴിയും, കൂടാതെ RC-യിലേക്കുള്ള ക്വിനോണിന്റെ വ്യാപനം കൂടുതൽ പരിമിതപ്പെടുത്തിയേക്കാം. പ്രോട്ടീൻ W RC വഴിയുള്ള ക്വിനോണുകളുടെ പരിവർത്തനത്തെ ബാധിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കുന്നതിന്, ubiquinone 2 (UQ2) ന്റെ ഒരു നിശ്ചിത സാന്ദ്രതയിൽ (ചെറിയ ഐസോപ്രീൻ വാൽ ഉള്ള സ്വാഭാവിക UQ10 ന്റെ അനലോഗ്) ഒരു സൈറ്റോക്രോം ഓക്‌സിഡേഷൻ പരിശോധന നടത്തി (ചിത്രം 2E). ചേലേറ്റഡ് ക്വിനോണിന്റെ സാന്നിധ്യം വ്യക്തമായ മൈക്കിളിസ് സ്ഥിരാങ്കത്തിന്റെ കൃത്യമായ നിർണ്ണയത്തിന് തടസ്സമാകുന്നുണ്ടെങ്കിലും (RC-LH114-W ഉം RC-LH116 ഉം യഥാക്രമം 0.2±0.1μM ഉം 0.5±0.2μM ഉം ആണ്), RC-LH114-W ന്റെ പരമാവധി നിരക്ക് (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) RC-LH116 നേക്കാൾ 28±5% കൂടുതലാണ് (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
കോർ കോംപ്ലക്‌സിന്റെ ഏകദേശം 10% ൽ പ്രോട്ടീൻ-W ഉണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ ആദ്യം കണക്കാക്കി (16); ഇവിടെ, കുറഞ്ഞ വെളിച്ചം, ഇടത്തരം വെളിച്ചം, ഉയർന്ന വെളിച്ചം എന്നിവയുള്ള വളർച്ചാ കോശങ്ങളുടെ ഒക്യുപൻസി നിരക്കുകൾ യഥാക്രമം 15±0.6%, 11±1%, 0.9±0.5 എന്നിവയാണ് (ചിത്രം 2F). മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിയുടെ അളവ് താരതമ്യം കാണിക്കുന്നത് ഹിസ്റ്റിഡിൻ ടാഗ് ചേർക്കുന്നത് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് സ്‌ട്രെയിനുകളുമായി (P = 0.59) താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ പ്രോട്ടീൻ-W യുടെ ആപേക്ഷിക സമൃദ്ധി കുറച്ചിട്ടില്ല എന്നാണ്, അതിനാൽ ഈ ലെവലുകൾ പരിഷ്കരിച്ച പ്രോട്ടീൻ-W യുടെ ഒരു ആർട്ടിഫാക്റ്റ് അല്ല (ചിത്രം S10). എന്നിരുന്നാലും, RC-LH1 കോംപ്ലക്‌സിലെ പ്രോട്ടീൻ-W യുടെ ഈ കുറഞ്ഞ ഒക്യുപൻസി ചില RC-കളെ ത്വരിതപ്പെടുത്തിയ നിരക്കിൽ ഫ്ലിപ്പ് ചെയ്യാൻ അനുവദിച്ചേക്കാം, അതുവഴി RC-LH116 കോംപ്ലക്‌സിലെ മന്ദഗതിയിലുള്ള ക്വിനോൺ/ക്വിനോലോൺ കൈമാറ്റം ലഘൂകരിക്കുന്നു. ഉയർന്ന പ്രകാശ ഒക്യുപൻസി നിരക്ക് സമീപകാല ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സ് ഡാറ്റയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധിച്ചു, ഇത് ശക്തമായ വെളിച്ചത്തിൽ pufW ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വർദ്ധിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം S11) (23). RC-LH1 സമുച്ചയത്തിൽ pufW ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും പ്രോട്ടീൻ-W സംയോജനവും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം ആശയക്കുഴപ്പമുണ്ടാക്കുന്നതാണ്, കൂടാതെ പ്രോട്ടീന്റെ സങ്കീർണ്ണമായ നിയന്ത്രണത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കാം.
RC-LH114-W-ൽ, 6 കാർഡിയോലിപിൻ (CDL), 7 ഫോസ്ഫാറ്റിഡൈൽകോളിൻ (POPC), 1 ഫോസ്ഫാറ്റിഡൈൽഗ്ലിസറോൾ (POPG), 29 β-DDM തന്മാത്രകൾ വേർതിരിച്ച് അതിൽ മാതൃകയാക്കി 6 CDL-കൾ, 24 POPC-കൾ, 2 POPG-കൾ, 12 βDDM-കൾ. RC-LH116 (ചിത്രം 5, A, B). ഈ രണ്ട് ഘടനകളിലും, CDL ഏതാണ്ട് സമുച്ചയത്തിന്റെ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് വശത്താണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്, അതേസമയം POPC, POPG, β-DDM എന്നിവ കൂടുതലും ലുമിനൽ വശത്താണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്. RC-LH114-W സമുച്ചയത്തിന്റെ αβ-1 മുതൽ αβ-6 വരെയുള്ള മേഖലയിൽ രണ്ട് ലിപിഡ്, ഡിറ്റർജന്റ് തന്മാത്രകളെ വേർതിരിച്ചു (ചിത്രം 5A), കൂടാതെ അഞ്ചെണ്ണം RC-LH116-ന്റെ തുല്യ മേഖലയിൽ വേർതിരിച്ചു (ചിത്രം 5B). സമുച്ചയത്തിന്റെ മറുവശത്ത് കൂടുതൽ ലിപിഡുകൾ കണ്ടെത്തി, പ്രധാനമായും CDL, RC നും αβ-7 നും αβ-13 നും ഇടയിൽ അടിഞ്ഞുകൂടി (ചിത്രം 5, A, B). ഘടനാപരമായി പരിഹരിക്കപ്പെട്ട മറ്റ് ലിപിഡുകളും ഡിറ്റർജന്റുകളും LH1 വളയത്തിന് പുറത്താണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്, കൂടാതെ നന്നായി പരിഹരിക്കപ്പെട്ട അസൈൽ ശൃംഖലകൾ LH1 ഉപയൂണിറ്റുകൾക്കിടയിൽ വ്യാപിക്കുന്നു, RC-LH114-W-ൽ β-DDM എന്ന് താൽക്കാലികമായി നിയുക്തമാക്കിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ RC-LH114-W-ൽ β-DDM എന്ന് നിർവചിച്ചിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ RC-ൽ β-DDM എന്ന് നിർവചിച്ചിരിക്കുന്നു. β-DDM, POPC-LH116 എന്നിവയുടെ മിശ്രിതം. നമ്മുടെ ഘടനയിലെ ചേലേറ്റിംഗ് ലിപിഡുകളുടെയും ഡിറ്റർജന്റുകളുടെയും സമാന സ്ഥാനങ്ങൾ അവ ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രസക്തമായ ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകളാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം S12A). Tch-ലെ തുല്യ തന്മാത്രകളുടെ സ്ഥാനങ്ങൾക്കും നല്ല സ്ഥിരതയുണ്ട്. സൗമ്യവും Trv-യും. സ്ട്രെയിൻ 970 RC-LH1s (ചിത്രം S12, B മുതൽ E വരെ) (9, 12), ലിപിഡ് ഹെഡ് ഗ്രൂപ്പിന്റെ ഹൈഡ്രജൻ-ബോണ്ടിംഗ് അവശിഷ്ടങ്ങൾ എന്നിവ സീക്വൻസ് അലൈൻമെന്റിൽ (ചിത്രം S13) വളരെ നല്ല സംരക്ഷണം കാണിച്ചു, ഇത് RC (24) യുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന കൺസർവഡ് CDL, ഈ സൈറ്റുകൾ RC-LH1 സമുച്ചയത്തിൽ സംരക്ഷിക്കപ്പെടാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
(A ഉം B ഉം) RC-LH114-W (A) ഉം RC-LH116 (B) ഉം പെപ്റ്റൈഡുകളെ കാർട്ടൂണുകളാലും, പിഗ്മെന്റുകളെ വടികളാലും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, ചിത്രം 1 ലെ വർണ്ണ സ്കീം ഉപയോഗിക്കുന്നു. ലിപിഡുകൾ ചുവപ്പിലും, ഡിറ്റർജന്റുകൾ ചാരനിറത്തിലും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. RC QA, QB സൈറ്റുകളുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന UQ മഞ്ഞയാണ്, അതേസമയം ഒറ്റപ്പെട്ട UQ നീലയാണ്. (C ഉം D ഉം) ലിപിഡുകൾ ഒഴിവാക്കി (A) ഉം (B) ഉം പോലെയുള്ള അതേ കാഴ്ചകൾ. (E മുതൽ G വരെ) പരസ്പരം സ്വാധീനിക്കുന്ന സൈഡ് ചെയിനുകളുള്ള RC-LH116 ൽ നിന്നുള്ള Q1(E), Q2(F), Q3(G) എന്നിവയുടെ വലുതാക്കിയ കാഴ്ച. ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകളെ കറുത്ത ഡാഷ്ഡ് ലൈനുകളായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
RC-LH116-ൽ, ചാർജ് വേർതിരിക്കൽ പ്രക്രിയയിൽ ഇലക്ട്രോൺ കൈമാറ്റത്തിൽ പങ്കെടുക്കുന്ന RC QA, QB UQ എന്നിവ അവയുടെ ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകളിൽ വിഘടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, RC-LH114-W-ൽ, QB ക്വിനോൺ പരിഹരിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല, അത് താഴെ വിശദമായി ചർച്ച ചെയ്യും. QA, QB ക്വിനോണുകൾക്ക് പുറമേ, രണ്ട് ചേലേറ്റഡ് UQ തന്മാത്രകൾ (RC, LH1 വളയങ്ങൾക്കിടയിൽ സ്ഥിതിചെയ്യുന്നു) അവയുടെ നന്നായി പരിഹരിച്ച ഹെഡ് ഗ്രൂപ്പുകൾക്കനുസരിച്ച് RC-LH114-W ഘടനയിൽ അനുവദിച്ചിരിക്കുന്നു (യഥാക്രമം Q1, Q2 എന്നിവയിൽ സ്ഥിതിചെയ്യുന്നു). സ്ഥലം). ചിത്രം 5C). രണ്ട് ഐസോപ്രീൻ യൂണിറ്റുകൾ Q1-ലേക്ക് നിയോഗിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ സാന്ദ്രത മാപ്പ് Q2-ന്റെ പൂർണ്ണമായ 10 ഐസോപ്രീൻ വാലുകളെ പരിഹരിക്കുന്നു. RC-LH116-ന്റെ ഘടനയിൽ, മൂന്ന് ചേലേറ്റഡ് UQ10 തന്മാത്രകൾ (Q1 മുതൽ Q3 വരെ, ചിത്രം 5D) പരിഹരിക്കപ്പെട്ടു, കൂടാതെ എല്ലാ തന്മാത്രകൾക്കും വാലിൽ ഉടനീളം വ്യക്തമായ സാന്ദ്രതയുണ്ട് (ചിത്രം 5, D മുതൽ G വരെ). രണ്ട് ഘടനകളിലും, Q1, Q2 എന്നിവയുടെ ക്വിനോൺ ഹെഡ് ഗ്രൂപ്പുകളുടെ സ്ഥാനങ്ങൾക്ക് മികച്ച സ്ഥിരതയുണ്ട് (ചിത്രം S12F), അവ RC-യുമായി മാത്രമേ സംവദിക്കുകയുള്ളൂ. RC-LH114-W യുടെ W വിടവിന്റെ പ്രവേശന കവാടത്തിലാണ് Q1 സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത് (ചിത്രം 1G, 5, C, D, E), കൂടാതെ Q2 QB ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റിന് സമീപമാണ് (ചിത്രം 5, C, D), F). സംരക്ഷിത L-Trp143, L-Trp269 അവശിഷ്ടങ്ങൾ Q1, Q2 എന്നിവയോട് വളരെ അടുത്താണ്, കൂടാതെ സാധ്യതയുള്ള π-സ്റ്റാക്കിംഗ് ഇടപെടലുകൾ നൽകുന്നു (ചിത്രം 5, E, F, ചിത്രം S12). Q1 ന്റെ വിദൂര ഓക്സിജനിൽ നിന്നുള്ള L-Gln88, 3.0 Å, ശക്തമായ ഒരു ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ട് നൽകുന്നു (ചിത്രം 5E); ഏറ്റവും വിദൂര ബന്ധം ഒഴികെയുള്ള എല്ലാ RC-കളിലും ഈ അവശിഷ്ടം സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു (ചിത്രം S13). മറ്റ് മിക്ക ആർ‌സികളിലും (ചിത്രം എസ് 13) എൽ-സെർ 91, ത്രെഷറിന് പകരം യാഥാസ്ഥിതികമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു (ചിത്രം എസ് 13), ക്യു 1 ന്റെ മീഥൈൽ ഓക്സിജനിൽ നിന്ന് 3.8 ആങ്‌സ്ട്രോമുകൾ ആണ്, കൂടാതെ ദുർബലമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ നൽകിയേക്കാം (ചിത്രം 5 ഇ). ക്യു 3 ന് ഒരു പ്രത്യേക ഇടപെടൽ ഉള്ളതായി തോന്നുന്നില്ല, പക്ഷേ ആർ‌സി-എം ഉപയൂണിറ്റിനും എൽ‌എച്ച് 1-α ഉപയൂണിറ്റ് 5 മുതൽ 6 വരെ (ചിത്രം 5, ഡി, ജി) ഇടയിലുള്ള ഹൈഡ്രോഫോബിക് മേഖലയിലാണ് ഇത് സ്ഥിതിചെയ്യുന്നത്. ത്രെഷോൾഡ്, സ്ട്രെയിൻ 970, ബ്ലാക് എന്നിവയിലും ത്രെഷോൾഡ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. ഐറിസ് ഘടന (9, 10, 12) ആർ‌സി-എൽ‌എച്ച് 1 സമുച്ചയത്തിലെ ഒരു സംരക്ഷിത സഹായ ക്വിനോൺ ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റിലേക്ക് വിരൽ ചൂണ്ടുന്നു (ചിത്രം എസ് 12 ജി). RC-LH116 ലെ അഞ്ച് വിഘടിപ്പിച്ച UQ-കൾ, ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി (HPLC) നിർണ്ണയിക്കുന്ന ഓരോ സമുച്ചയത്തിന്റെയും 5.8±0.7 എന്ന അനുപാതവുമായി നല്ല യോജിപ്പിലാണ്, അതേസമയം RC-LH114-W ലെ മൂന്ന് വിഘടിപ്പിച്ച UQ-കൾ 6.2±0.3 എന്ന അളന്ന മൂല്യത്തേക്കാൾ കുറവാണ് (ചിത്രം S14) ഘടനയിൽ പരിഹരിക്കപ്പെടാത്ത UQ തന്മാത്രകളുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
കപട-സമമിതി L, M പോളിപെപ്റ്റൈഡുകൾ എന്നിവയിൽ ഓരോന്നിലും അഞ്ച് TMH-കൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഒരു BChl ഡൈമർ, രണ്ട് BChl മോണോമറുകൾ, രണ്ട് ബാക്ടീരിയോഫേജ് (BPh) മോണോമറുകൾ, ഒരു നോൺ-ഹീം ഇരുമ്പ്, ഒന്നോ രണ്ടോ UQ10 തന്മാത്രകൾ എന്നിവ സംയോജിപ്പിക്കുന്ന ഒരു ഹെറ്ററോഡൈമർ രൂപപ്പെടുന്നു. ടെർമിനൽ കെറ്റോൺ ഗ്രൂപ്പിലെ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിലൂടെയും Rps-ൽ അതിന്റെ അറിയപ്പെടുന്ന ശേഖരണത്തിലൂടെയും, കരോട്ടിനോയിഡുകൾ M-സബ്യൂണിറ്റിൽ സംയോജിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, ഇതിനെ cis-3,4-dehydrorohodopin എന്ന് വിളിക്കുന്നു. സ്പീഷീസ് (25). RC-H ന്റെ പുറം മെംബ്രൺ ഡൊമെയ്ൻ ഒരൊറ്റ TMH വഴി മെംബ്രണിലേക്ക് നങ്കൂരമിട്ടിരിക്കുന്നു. മൊത്തത്തിലുള്ള RC ഘടന അനുബന്ധ സ്പീഷീസുകളുടെ (Rba) മൂന്ന് ഉപയൂണിറ്റ് RC-ക്ക് സമാനമാണ് (ഉദാഹരണത്തിന് RBa). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl, BPh എന്നിവയുടെ മാക്രോസൈക്കിളുകൾ, കരോട്ടിനോയ്ഡ് ബാക്ക്ബോൺ, നോൺ-ഹീം ഇരുമ്പ് എന്നിവ ഈ ഘടനകളുടെ റെസല്യൂഷൻ പരിധിക്കുള്ളിൽ ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്നു, അതുപോലെ QA സൈറ്റിലെ UQ10 ഹെഡ് ഗ്രൂപ്പും RC-LH116 ലെ QB ക്വിനോണും (ചിത്രം S15).
വ്യത്യസ്ത QB സൈറ്റിലെ ഒക്യുപ്പൻസി നിരക്കുകളുള്ള രണ്ട് RC ഘടനകളുടെ ലഭ്യത, QB ക്വിനോൺ ബൈൻഡിംഗിനൊപ്പം സ്ഥിരമായ രൂപാന്തര മാറ്റങ്ങൾ പരിശോധിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു പുതിയ അവസരം നൽകുന്നു. RC-LH116 സമുച്ചയത്തിൽ, QB ക്വിനോൺ പൂർണ്ണമായും ബന്ധിതമായ "പ്രോക്സിമൽ" സ്ഥാനത്താണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത് (26), എന്നാൽ RC-LH114-W യുടെ വേർതിരിവിൽ QB ക്വിനോൺ ഇല്ല. RC-LH114-W-ൽ QB ക്വിനോൺ ഇല്ല, ഇത് ആശ്ചര്യകരമാണ്, കാരണം ഘടനാപരമായി പരിഹരിച്ച QB ക്വിനോണുള്ള RC-LH116 സമുച്ചയത്തേക്കാൾ കൂടുതൽ സജീവമാണ്. രണ്ട് LH1 വളയങ്ങൾ ആറ് ക്വിനോണുകളെയാണ് ചേലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതെങ്കിലും, അടച്ച RC-LH116 വളയത്തിൽ അഞ്ചെണ്ണം ഘടനാപരമായി പരിഹരിക്കപ്പെടുന്നു, അതേസമയം തുറന്ന RC-LH114-W വളയത്തിൽ മൂന്നെണ്ണം മാത്രമേ ഘടനാപരമായി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിട്ടുള്ളൂ. ഈ വർദ്ധിച്ച ഘടനാപരമായ ക്രമക്കേട് RC-LH114-W QB സൈറ്റുകളുടെ വേഗത്തിലുള്ള മാറ്റിസ്ഥാപിക്കൽ, സമുച്ചയത്തിലെ വേഗതയേറിയ ക്വിനോൺ ചലനാത്മകത, LH1 ലൂപ്പ് കടക്കുന്നതിനുള്ള വർദ്ധിച്ച സാധ്യത എന്നിവയെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കാം. RC-LH114-W യുടെ RC QB സൈറ്റിൽ UQ യുടെ അഭാവം കൂടുതൽ സങ്കീർണ്ണവും കൂടുതൽ സജീവവുമായ ഒരു സമുച്ചയത്തിന്റെ ഫലമായിരിക്കാം എന്ന് ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു, കൂടാതെ RC-LH114-W യുടെ QB സൈറ്റ് UQ വിറ്റുവരവിൽ ഉടനടി മരവിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. നിർദ്ദിഷ്ട ഘട്ടം (QB സൈറ്റിലേക്കുള്ള പ്രവേശനം അടച്ചിരിക്കുന്നു) ഈ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ രൂപാന്തരീകരണത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു.
QB ഇല്ലാതെ, UQ10 ബൈൻഡിംഗുമായി പൊരുത്തപ്പെടാത്ത ഒരു സ്ഥാനത്തേക്ക് L-Phe217 ന്റെ അനുബന്ധ ഭ്രമണം, കാരണം അത് വാലിന്റെ ആദ്യ ഐസോപ്രീൻ യൂണിറ്റുമായി ഒരു സ്പേഷ്യൽ കൂട്ടിയിടിക്ക് കാരണമാകും (ചിത്രം 6A). കൂടാതെ, വ്യക്തമായ പ്രധാന രൂപാന്തര മാറ്റങ്ങൾ വ്യക്തമാണ്, പ്രത്യേകിച്ച് ഹെലിക്സ് ഡി (TMH D നും E നും ഇടയിലുള്ള ലൂപ്പിലെ ചെറിയ ഹെലിക്സ്) അവിടെ L-Phe217 QB ബൈൻഡിംഗ് പോക്കറ്റിലേക്കും L-Tyr223 ന്റെ ഭ്രമണത്തിലേക്കും മാറ്റുന്നു (ചിത്രം 6A ) M-Asp45 ഫ്രെയിംവർക്കുമായുള്ള ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ട് തകർക്കുന്നതിനും QB ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റിന്റെ പ്രവേശന കവാടം അടയ്ക്കുന്നതിനും (ചിത്രം 6B). ഹെലിക്സ് അതിന്റെ അടിത്തട്ടിൽ പിവറ്റുകൾ ചെയ്യുന്നു, L-Ser209 ന്റെ Cα 0.33Å മാറ്റുന്നു, അതേസമയം L-Val221Cα 3.52Å മാറ്റുന്നു. TMH D യിലും E യിലും നിരീക്ഷിക്കാവുന്ന മാറ്റങ്ങളൊന്നുമില്ല, അവ രണ്ട് ഘടനകളിലും സൂപ്പർഇംപോസിബിൾ ആണ് (ചിത്രം 6A). നമുക്കറിയാവുന്നിടത്തോളം, സ്വാഭാവിക ആർ‌സിയിലെ ക്യുബി സൈറ്റ് അടയ്ക്കുന്ന ആദ്യത്തെ ഘടനയാണിത്. പൂർണ്ണമായ (ക്യുബി-ബൗണ്ട്) ഘടനയുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, ക്വിനോൺ കുറയ്ക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, ക്വിനോണിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്നതിന് ഒരു രൂപാന്തര മാറ്റം ആവശ്യമാണെന്ന് കാണിക്കുന്നു. ക്വിനോൺ ഹെഡ് ഗ്രൂപ്പുമായി ഒരു π-സ്റ്റാക്കിംഗ് ഇടപെടൽ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് L-Phe217 കറങ്ങുന്നു, കൂടാതെ ഹെലിക്സ് പുറത്തേക്ക് മാറുന്നു, ഇത് എൽ-ഗ്ലൈ222 ന്റെ അസ്ഥികൂടവും എൽ-ടൈർ223 ന്റെ സൈഡ് ചെയിനും സ്ഥിരതയുള്ള ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ട് ഘടനയുള്ള ഒരു ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ട് ശൃംഖല രൂപപ്പെടുത്താൻ അനുവദിക്കുന്നു (ചിത്രം 6, എ, സി).
(എ) ഹോളോഗ്രാമിന്റെ ഓവർലാപ്പിംഗ് കാർട്ടൂൺ (എൽ ചെയിൻ, ഓറഞ്ച്/എം ചെയിൻ, മജന്ത), അപ്പോ (ചാരനിറം) ഘടന, അതിൽ കീ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഒരു വടി പോലുള്ള പ്രാതിനിധ്യത്തിന്റെ രൂപത്തിൽ പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. യുക്യു 10 ഒരു മഞ്ഞ ബാർ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. ഡോട്ട് ഇട്ട രേഖ മുഴുവൻ ഘടനയിലും രൂപപ്പെട്ട ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. (ബി, സി) അപ്പോളിപോപ്രോട്ടീനിന്റെയും മുഴുവൻ റിംഗ് ഘടനയുടെയും ഉപരിതല പ്രാതിനിധ്യം, യഥാക്രമം നീല നിറത്തിൽ എൽ-ഫെ217 ന്റെയും ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ എൽ-ടൈർ223 ന്റെയും സൈഡ് ചെയിൻ ഓക്സിജനെ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. എൽ ഉപയൂണിറ്റ് ഓറഞ്ച് നിറമാണ്; എം, എച്ച് ഉപയൂണിറ്റുകൾക്ക് നിറമില്ല. (ഡി, ഇ) അപ്പോളിപോപ്രോട്ടീൻ (ഡി), മുഴുവൻ (ഇ) ആർസി ക്യുബി സൈറ്റുകളും [യഥാക്രമം (എ) പ്രകാരം നിറം] തെർമോഫിലസ് തെർമോഫിലസ് പിഎസ്ഐഐ (പച്ച, നീല പ്ലാസ്റ്റിക് ക്വിനോൺ ഉപയോഗിച്ച്; പിഡിബി ഐഡി: 3WU2) വിന്യസിക്കുക (58).
അപ്രതീക്ഷിതമായി, LH1 ഇല്ലാത്ത QB കുറവുള്ള RC-കളുടെ നിരവധി ഘടനകൾ ലഭ്യമാണെങ്കിലും, ഈ പഠനത്തിൽ നിരീക്ഷിച്ച അനുരൂപമായ മാറ്റങ്ങൾ മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടില്ല. Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28), Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) എന്നിവയിൽ നിന്നുള്ള QB ശോഷണ ഘടന ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇവയെല്ലാം അവയുടെ മൊത്തത്തിലുള്ള QB ഘടനയ്ക്ക് ഏതാണ്ട് സമാനമാണ്. 3PRC-യുടെ സൂക്ഷ്മ പരിശോധനയിൽ LDAO (ലോറൈൽ ഡൈമെഥൈൽ അമിൻ ഓക്സൈഡ്) ഡിറ്റർജന്റ് തന്മാത്രകൾ QB സ്ഥാനത്തിന്റെ പ്രവേശന കവാടത്തിൽ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതായി കണ്ടെത്തി, ഇത് ഒരു അടച്ച രൂപാന്തരീകരണത്തിലേക്ക് പുനഃക്രമീകരിക്കുന്നത് തടഞ്ഞേക്കാം. 1EYS അല്ലെങ്കിൽ 1OGV-യിൽ ഒരേ സ്ഥാനത്ത് LDAO വിഘടിപ്പിക്കുന്നില്ലെങ്കിലും, ഈ RC-കൾ ഒരേ ഡിറ്റർജന്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് തയ്യാറാക്കുന്നത്, അതിനാൽ അതേ ഫലം ഉണ്ടാക്കിയേക്കാം. Rba-യുടെ ക്രിസ്റ്റൽ ഘടന. സൈറ്റോക്രോം c2 (PDB ID: 1L9B) യുമായി സഹ-ക്രിസ്റ്റലൈസ് ചെയ്ത സ്ഫെറോയിഡ്സ് RC യ്ക്കും ഒരു അടച്ച QB സൈറ്റ് ഉള്ളതായി തോന്നുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, RC-M പോളിപെപ്റ്റൈഡിന്റെ N-ടെർമിനൽ മേഖല (Q ഹെലിക്സിലെ ടൈർ അവശിഷ്ടത്തിന്റെ H ബോണ്ട് വഴി QB ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുമായി സംവദിക്കുന്നു) ഒരു അസ്വാഭാവിക രൂപാന്തരീകരണം സ്വീകരിക്കുന്നു, കൂടാതെ QB രൂപാന്തര മാറ്റം കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെടുന്നില്ല (30). RC-LH114-W ഘടനയിൽ M പോളിപെപ്റ്റൈഡിന്റെ ഇത്തരത്തിലുള്ള രൂപഭേദം നമ്മൾ കണ്ടിട്ടില്ല എന്നതാണ് ആശ്വാസകരമായ കാര്യം, ഇത് RC-LH116 RC യുടെ N-ടെർമിനൽ മേഖലയ്ക്ക് ഏതാണ്ട് സമാനമാണ്. ഡിറ്റർജന്റ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള LH1 ആന്റിന ഇല്ലാതാക്കിയ ശേഷം, PDB യിലെ അപ്പോളിപോപ്രോട്ടീൻ RC-കൾ പരിഹരിക്കപ്പെട്ടു, ഇത് RC യും ചുറ്റുമുള്ള LH1 റിങ്ങിന്റെ ആന്തരിക ഉപരിതലവും തമ്മിലുള്ള വിടവിലെ ആന്തരിക ക്വിനോൺ പൂളുകളും ലിപിഡുകളും ഇല്ലാതാക്കി (31, 32). വിഘടിപ്പിക്കാവുന്ന QB ക്വിനോൺ ഒഴികെയുള്ള എല്ലാ സഹഘടകങ്ങളെയും RC നിലനിർത്തുന്നതിനാൽ അത് പ്രവർത്തനക്ഷമമായി തുടരുന്നു, ഇത് സ്ഥിരത കുറഞ്ഞതും തയ്യാറെടുപ്പ് പ്രക്രിയയിൽ പലപ്പോഴും നഷ്ടപ്പെടുന്നതുമാണ് (33). കൂടാതെ, RC-യിൽ നിന്ന് LH1 ഉം സ്വാഭാവിക ചാക്രിക ലിപിഡുകളും നീക്കം ചെയ്യുന്നത് ചാർജ്-വേർതിരിക്കപ്പെട്ട P+QB-സ്റ്റേറ്റിന്റെ ആയുസ്സ് കുറയ്ക്കുന്നത് പോലുള്ള പ്രവർത്തനങ്ങളെ സ്വാധീനിക്കുമെന്ന് അറിയാം (31, 34, 35). അതിനാൽ, RC-യെ ചുറ്റിപ്പറ്റിയുള്ള പ്രാദേശിക LH1 വളയത്തിന്റെ നിലനിൽപ്പ് "അടഞ്ഞ" QB സൈറ്റ് നിലനിർത്താനും അതുവഴി QB-ക്ക് സമീപമുള്ള പ്രാദേശിക പരിസ്ഥിതി സംരക്ഷിക്കാനും കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു.
അപ്പോളിപോപ്രോട്ടീനും (QB ക്വിനോൺ ഇല്ലാതെ) പൂർണ്ണ ഘടനയും QB സൈറ്റിന്റെ വിറ്റുവരവിന്റെ രണ്ട് സ്നാപ്പ്ഷോട്ടുകൾ മാത്രമേ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നുള്ളൂവെങ്കിലും, ഒരു പരമ്പര സംഭവങ്ങളേക്കാൾ, ഹൈഡ്രോക്വിനോൺ ഉപയോഗിച്ച് റീബൈൻഡിംഗ് തടയുന്നതിന് ബൈൻഡിംഗ് ഗേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമെന്ന സൂചനകളുണ്ട്. അപ്പോളിപോപ്രോട്ടീനിന്റെ QB സൈറ്റിനടുത്തുള്ള ക്വിനോളോളിന്റെയും ക്വിനോണിന്റെയും പ്രതിപ്രവർത്തനം വ്യത്യസ്തമായിരിക്കാം, ഇത് RC യുടെ നിരസിക്കലിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. ക്വിനോണുകളുടെ ബൈൻഡിംഗിലും കുറയ്ക്കലിലും കോൺഫോർമേഷണൽ മാറ്റങ്ങൾ ഒരു പങ്കു വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് വളരെക്കാലമായി നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. ഡാർക്ക് അഡാപ്റ്റേഷനുശേഷം ക്വിനോണുകൾ കുറയ്ക്കാനുള്ള ഫ്രോസൺ RC-കളുടെ കഴിവ് തകരാറിലാകുന്നു (36); എക്സ്-റേ ക്രിസ്റ്റലോഗ്രാഫി കാണിക്കുന്നത് ഈ കേടുപാടുകൾ QB ക്വിനോണുകൾ സജീവമായ പ്രോക്സിമൽ സ്ഥാനത്ത് നിന്ന് ഏകദേശം 4.5 Å അകലെ ഒരു "ഡിസ്റ്റൽ" കൺഫോർമേഷനിൽ കുടുങ്ങിക്കിടക്കുന്നതിനാലാണ് (26), 37). ഈ ഡിസ്റ്റൽ ബൈൻഡിംഗ് കൺഫോർമേഷൻ അപ്പോളിപോപ്രോട്ടീനും പൂർണ്ണ റിംഗ് ഘടനയും തമ്മിലുള്ള ഇന്റർമീഡിയറ്റ് അവസ്ഥയുടെ ഒരു സ്നാപ്പ്ഷോട്ടാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു, ഇത് ക്വിനോണുമായുള്ള പ്രാരംഭ ഇടപെടലിനെയും QB സൈറ്റ് തുറക്കുന്നതിനെയും പിന്തുടരുന്നു.
ചില ഫോട്ടോട്രോഫിക് ബാക്ടീരിയകളുടെയും സയനോബാക്ടീരിയകളുടെയും, ആൽഗകളുടെയും, സസ്യങ്ങളുടെയും PSII സമുച്ചയത്തിൽ കാണപ്പെടുന്ന ടൈപ്പ് II RC-ക്ക് ഘടനാപരവും പ്രവർത്തനപരവുമായ സംരക്ഷണമുണ്ട് (38). ചിത്രം 6 (D, E)-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഘടനാപരമായ വിന്യാസം PSII RC-കളും ബാക്ടീരിയൽ RC സമുച്ചയത്തിന്റെ QB സൈറ്റും തമ്മിലുള്ള സമാനതയെ ഊന്നിപ്പറയുന്നു. ക്വിനോൺ ബൈൻഡിംഗിന്റെയും റിഡക്ഷന്റെയും അടുത്ത ബന്ധമുള്ള സിസ്റ്റങ്ങൾ പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു മാതൃകയാണ് ഈ താരതമ്യം. ക്വിനോണുകളുടെ PSII റിഡക്ഷനോടൊപ്പം (39, 40) അനുരൂപമായ മാറ്റങ്ങളും ഉണ്ടാകുമെന്ന് മുൻ പ്രസിദ്ധീകരണങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. അതിനാൽ, RC-യുടെ പരിണാമ സംരക്ഷണം കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, ഓക്സിജൻ അടങ്ങിയ ഫോട്ടോട്രോഫിക് സസ്യങ്ങളിലെ PSII RC-യുടെ QB സൈറ്റിനും മുമ്പ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെടാത്ത ഈ ബൈൻഡിംഗ് സംവിധാനം ബാധകമായേക്കാം.
Rps ΔpufW (ലേബൽ ചെയ്യാത്ത pufW ഇല്ലാതാക്കൽ) ഉം PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W ഉം സ്വാഭാവിക pufW ലോക്കസിൽ നിന്ന് പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു) സ്ട്രെയിനുകളിൽ നിന്ന് പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു. പാലസ്ട്രിസ് CGA009 ഞങ്ങളുടെ മുൻ കൃതിയിൽ (16) വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട്. ഈ സ്ട്രെയിനുകളും ഐസോജെനിക് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് പാരന്റും ഫ്രീസറിൽ നിന്ന് PYE (ഓരോന്നിനും 5 ഗ്രാം ലിറ്റർ -1) (LB-യിൽ -80 °C-ൽ സംഭരിച്ചിരിക്കുന്നു, 50% (w/v) ഗ്ലിസറോൾ) പ്രോട്ടീൻ, യീസ്റ്റ് സത്ത്, സക്സിനേറ്റ് എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു) അഗാർ [1.5% (w/v)] പ്ലേറ്റിൽ ചെറിയ എണ്ണം കോശങ്ങൾ സ്ട്രീക്ക് ചെയ്തുകൊണ്ട് വീണ്ടെടുക്കപ്പെട്ടു. വായുരഹിത സാഹചര്യങ്ങളിൽ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഇരുട്ടിൽ രാത്രി മുഴുവൻ പ്ലേറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് OSRAM 116-W ഹാലോജൻ ബൾബുകൾ (RS Components, UK) നൽകിയ വെളുത്ത വെളിച്ചം (~50 μmolm-2 s-1) ഉപയോഗിച്ച് ഒരു കോളനി പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നതുവരെ 3 മുതൽ 5 ദിവസം വരെ പ്രകാശിപ്പിച്ചു. ഒരു കോളനിയിൽ 10 മില്ലി M22+ മീഡിയം (41) കുത്തിവയ്ക്കുകയും 0.1% (w/v) കാസമിനോ ആസിഡുകൾ (ഇനി മുതൽ M22 എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്നു) ചേർക്കുകയും ചെയ്തു. കുറഞ്ഞ ഓക്സിജൻ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഇരുട്ടിൽ 34°C താപനിലയിൽ 180 rpm-ൽ 48 മണിക്കൂർ കുലുക്കി കൾച്ചർ വളർത്തി, തുടർന്ന് 70 മില്ലി കൾച്ചർ അതേ സാഹചര്യങ്ങളിൽ 24 മണിക്കൂർ കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു. 1 മില്ലി വോളിയമുള്ള ഒരു സെമി-എയറോബിക് കൾച്ചർ ഉപയോഗിച്ച് 30 മില്ലി യൂണിവേഴ്സൽ സ്ക്രൂ-ടോപ്പ് സുതാര്യമായ ഗ്ലാസ് കുപ്പിയിൽ 30 മില്ലി M22 മീഡിയം കുത്തിവയ്ക്കുകയും അണുവിമുക്തമായ കാന്തികബലം സ്റ്റിറിംഗ് വടി ഉപയോഗിച്ച് 48 മണിക്കൂർ അസൈലേഷൻ (~50μmolm-2 s-1) ഉപയോഗിച്ച് വികിരണം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. തുടർന്ന് 30 മില്ലി കൾച്ചറിൽ ഏകദേശം 1 ലിറ്റർ കൾച്ചർ അതേ സാഹചര്യങ്ങളിൽ കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു, തുടർന്ന് 72 മണിക്കൂർ ~200 μmolm-2 s-1-ൽ പ്രകാശിതമായ 9 ലിറ്റർ കൾച്ചർ കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു. 7132 RCF-ൽ 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി കോശങ്ങൾ വിളവെടുത്തു, 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ന്റെ ~10 ml-ൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു, ആവശ്യമുള്ളത് വരെ -20°C-ൽ സൂക്ഷിച്ചു.
ഉരുക്കിയതിനുശേഷം, വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്ത കോശങ്ങളിലേക്ക് ഡിയോക്സിറൈബോണ്യൂക്ലീസ് I (മെർക്ക്, യുകെ), ലൈസോസൈം (മെർക്ക്, യുകെ), രണ്ട് റോച്ചെ ഹോളോഎൻസൈം പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്റർ ഗുളികകൾ (മെർക്ക്, യുകെ) എന്നിവയുടെ ചില പരലുകൾ ചേർക്കുക. 20,000 psi ഫ്രഞ്ച് പ്രഷർ സെല്ലിൽ (അമിൻകോ, യുഎസ്എ), കോശങ്ങൾ 8 മുതൽ 12 തവണ വരെ തടസ്സപ്പെട്ടു. 18,500 RCF-ൽ 4°C-ൽ 15 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി പൊട്ടാത്ത കോശങ്ങളും ലയിക്കാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങളും നീക്കം ചെയ്ത ശേഷം, 113,000 RCF-ൽ 43,000°C-ൽ 2 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി പിഗ്മെന്റഡ് ലൈസേറ്റിൽ നിന്ന് മെംബ്രൺ അവക്ഷിപ്തമാക്കി. ലയിക്കുന്ന അംശം ഉപേക്ഷിച്ച് 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ന്റെ 100 മുതൽ 200 മില്ലി വരെ നിറമുള്ള മെംബ്രൺ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്ത് ദൃശ്യമായ അഗ്രഗേറ്റുകൾ ഉണ്ടാകുന്നതുവരെ ഏകീകൃതമാക്കുക. സസ്പെൻഡ് ചെയ്ത മെംബ്രൺ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) യിൽ 2% (w/v) β-DDM അടങ്ങിയ 4°C താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇരുണ്ട സ്ഥലത്ത് മൃദുവായി ഇളക്കി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. തുടർന്ന് 70°C താപനിലയിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്ത് 4°C താപനിലയിൽ 150,000 RCF ലയിപ്പിച്ച് ലയിക്കാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്തു.
ΔpufW സ്ട്രെയിനിൽ നിന്നുള്ള ലയിക്കുന്ന മെംബ്രൺ, മൂന്ന് കോളം വോള്യങ്ങൾ (CV) ബൈൻഡിംഗ് ബഫർ [20 mM tris-HCl (pH 8.0) 0.03% (w / v) β-DDM] അടങ്ങിയ 50 ml DEAE സെഫാരോസ് അയോൺ എക്സ്ചേഞ്ച് കോളത്തിൽ പ്രയോഗിച്ചു. രണ്ട് CV ബൈൻഡിംഗ് ബഫറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് കോളം കഴുകുക, തുടർന്ന് 50 mM NaCl അടങ്ങിയ രണ്ട് ബൈൻഡിംഗ് ബഫറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് കോളം കഴുകുക. 1.75 CV-യിൽ 150 മുതൽ 300 mM NaCl (ബൈൻഡിംഗ് ബഫറിൽ) എന്ന ലീനിയർ ഗ്രേഡിയന്റ് ഉപയോഗിച്ച് RC-LH116 കോംപ്ലക്സ് എല്യൂട്ടഡ് ചെയ്തു, ശേഷിക്കുന്ന ബൈൻഡിംഗ് കോംപ്ലക്സ് 0.5 CV-യിൽ 300 mM NaCl അടങ്ങിയ ഒരു ബൈൻഡിംഗ് ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് എല്യൂട്ടഡ് ചെയ്തു. 250 നും 1000 nm നും ഇടയിലുള്ള അബ്സോർബൻസ് സ്പെക്ട്രം ശേഖരിക്കുക, ആഗിരണം അനുപാതം (A880/A280) 1 ൽ കൂടുതലുള്ള ഭിന്നസംഖ്യ 880 മുതൽ 280 nm വരെ നിലനിർത്തുക, ബൈൻഡിംഗ് ബഫറിൽ രണ്ടുതവണ നേർപ്പിക്കുക, തുടർന്ന് DEAE കോളത്തിൽ അതേ നടപടിക്രമം വീണ്ടും ഉപയോഗിക്കുക. 1.7 ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A280 അനുപാതങ്ങളും 3.0 ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A805 അനുപാതങ്ങളും ഉപയോഗിച്ച് ഭിന്നസംഖ്യകളെ നേർപ്പിക്കുക, അയോൺ എക്സ്ചേഞ്ചിന്റെ മൂന്നാം റൗണ്ട് നടത്തുക, 2.2 ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A280 അനുപാതങ്ങളും 5.0 ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A805 അനുപാതങ്ങളും ഉള്ള ഭിന്നസംഖ്യകൾ നിലനിർത്തുക. ഭാഗികമായി ശുദ്ധീകരിച്ച സമുച്ചയം ഒരു അമിക്കോൺ 100,000 മോളിക്യുലാർ വെയ്റ്റ് കട്ട്-ഓഫ് (MWCO) സെൻട്രിഫ്യൂഗൽ ഫിൽട്ടറിൽ (മെർക്ക്, യുകെ) ~2 മില്ലി ആയി കേന്ദ്രീകരിച്ചു, 200 mM NaCl ബഫർ അടങ്ങിയ ഒരു സൂപ്പർഡെക്സ് 200 16/600 സൈസ് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ കോളത്തിൽ (GE ഹെൽത്ത്‌കെയർ, യുഎസ്) ലോഡ് ചെയ്‌തു, തുടർന്ന് അതേ ബഫറിൽ 1.5 CV-യിൽ എല്യൂട്ടുചെയ്‌തു. സൈസ് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ ഫ്രാക്ഷന്റെ അബ്‌സോർപ്ഷൻ സ്പെക്ട്ര ശേഖരിക്കുക, 2.4-ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A280 അനുപാതങ്ങളും 5.8 മുതൽ 100 ​​A880-ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A805 അനുപാതങ്ങളും ഉപയോഗിച്ച് അബ്‌സോർപ്ഷൻ സ്പെക്ട്രയെ കേന്ദ്രീകരിക്കുക, ക്രയോ-TEM ഗ്രിഡ് തയ്യാറാക്കലിനോ സംഭരണത്തിനോ അവ ഉടൻ ഉപയോഗിക്കുക. ആവശ്യമുള്ളതുവരെ -80°C-ൽ സൂക്ഷിക്കുക.
PufW-His സ്ട്രെയിനിൽ നിന്നുള്ള ലയിക്കുന്ന മെംബ്രൺ, IMAC ബഫറിലെ (GE Healthcare) 200 mM NaCl ഉം 0.03% (w/w) ഉം അടങ്ങിയ 20 ml HisPrep FF Ni-NTA സെഫറോസ് കോളത്തിൽ (20 mM tris-HCl (pH 8.0) പ്രയോഗിച്ചു. v) β-DDM]. അഞ്ച് സിവികൾ IMAC ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് കോളം കഴുകി, തുടർന്ന് 10 mM ഹിസ്റ്റിഡിൻ അടങ്ങിയ അഞ്ച് സിവികൾ IMAC ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് കോളം കഴുകി. 100 mM ഹിസ്റ്റിഡിൻ അടങ്ങിയ അഞ്ച് IMAC ബഫറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് കോളത്തിൽ നിന്ന് കോർ കോംപ്ലക്സ് നീക്കം ചെയ്തു. അമിക്കോൺ 100,000 MWCO ഫിൽറ്റർ (മെർക്ക്, യുകെ) ഘടിപ്പിച്ച ഒരു സ്റ്റിർഡ് ടാങ്കിൽ RC-LH114-W കോംപ്ലക്സ് അടങ്ങിയ അംശം ~10 ml ആയി കേന്ദ്രീകരിച്ച്, ബൈൻഡിംഗ് ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 20 തവണ നേർപ്പിച്ച ശേഷം 25 ml-ലേക്ക് ചേർക്കുന്നു. DEAE സെഫാറോസ് നിരയിൽ, ബഫറുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന നാല് CV-കൾ മുൻകൂട്ടി ഉപയോഗിക്കുന്നു. നാല് സിവി ബൈൻഡിംഗ് ബഫറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് കോളം കഴുകുക, തുടർന്ന് 0 മുതൽ 100 ​​mM NaCl (ബൈൻഡിംഗ് ബഫറിൽ) വരെയുള്ള ലീനിയർ ഗ്രേഡിയന്റിൽ എട്ട് സിവികളിൽ കോംപ്ലക്സ് എല്യൂട്ടുചെയ്യുക, 100 mM ബൈൻഡിംഗ് ബഫർ അടങ്ങിയ ശേഷിക്കുന്ന നാല് സിവികൾ. സോഡിയം ക്ലോറൈഡിൽ എല്യൂട്ടുചെയ്‌ത അവശിഷ്ട കോംപ്ലക്സുകൾ 2.4-ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A280 അനുപാതവും 4.6-ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A805 അനുപാതവും സംയോജിപ്പിച്ച് ഒരു അമിക്കോൺ 100,000 MWCO സെൻട്രിഫ്യൂഗൽ ഫിൽട്ടറിൽ ~2 മില്ലിയിലേക്ക് കേന്ദ്രീകരിച്ച് 1.5 CV IMAC മുൻകൂട്ടി നിറച്ചു. ബഫർ സൂപ്പർഡെക്സ് 200 16/600 വലുപ്പ ഒഴിവാക്കൽ കോളം സന്തുലിതമാക്കി, തുടർന്ന് 1.5 CV-യിൽ കൂടുതൽ അതേ ബഫറിൽ എല്യൂട്ടുചെയ്‌തു. വലുപ്പ-ഒഴിവാക്കൽ ഭിന്നസംഖ്യകളുടെ അബ്സോർപ്ഷൻ സ്പെക്ട്ര ശേഖരിച്ച്, 2.1-ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A280 അനുപാതങ്ങളും 4.6 മുതൽ 100 ​​A880-ൽ കൂടുതലുള്ള A880/A805 അനുപാതങ്ങളും ഉപയോഗിച്ച് അബ്സോർപ്ഷൻ സ്പെക്ട്രയെ കേന്ദ്രീകരിക്കുക. ഇവ ഉടൻ തന്നെ ഫ്രീസുചെയ്ത TEM ഗ്രിഡ് തയ്യാറാക്കലിനായി ഉപയോഗിക്കുകയോ -80°C-ൽ ആവശ്യമുള്ളത് വരെ സൂക്ഷിക്കുകയോ ചെയ്യുന്നു.
കുറഞ്ഞ താപനിലയുള്ള TEM ഗ്രിഡുകൾ തയ്യാറാക്കാൻ ഒരു Leica EM GP ഇമ്മേഴ്‌ഷൻ ഫ്രീസർ ഉപയോഗിച്ചു. ഈ സമുച്ചയം IMAC ബഫറിൽ 50 ന്റെ A880 ലേക്ക് ലയിപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് 5μl പുതുതായി ഗ്ലോ-ഡിസ്ചാർജ് ചെയ്ത QUANTIFOIL 1.2/1.3 കാർബൺ-പൊതിഞ്ഞ കോപ്പർ മെഷിലേക്ക് (Agar Scientific, UK) ലോഡ് ചെയ്തു. ഗ്രിഡ് 20°C യിലും 60% ആപേക്ഷിക ആർദ്രതയിലും 30 സെക്കൻഡ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് 3 സെക്കൻഡ് ബ്ലോട്ട് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് -176°C യിൽ ദ്രാവക ഈഥേനിൽ കെടുത്തുക.
RC-LH114-W സമുച്ചയത്തിന്റെ ഡാറ്റ eBIC (ഇലക്ട്രോണിക് ബയോഇമേജിംഗ് സെന്റർ) (ബ്രിട്ടീഷ് ഡയമണ്ട് ലൈറ്റ് സോഴ്‌സ്)-ൽ ടൈറ്റൻ ക്രിയോസ് മൈക്രോസ്‌കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് രേഖപ്പെടുത്തി, ഇത് 300kV ന്റെ ആക്സിലറേറ്റിംഗ് വോൾട്ടേജിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു, 130,000× നാമമാത്രമായ മാഗ്നിഫിക്കേഷനും 20 eV യുടെ ഊർജ്ജവും തിരഞ്ഞെടുക്കുക. ഡാറ്റ ശേഖരിക്കുന്നതിനായി കൗണ്ടിംഗ് മോഡിൽ ചിത്രങ്ങൾ റെക്കോർഡുചെയ്യാൻ K2 പീക്ക് ഡിറ്റക്ടറുള്ള ഒരു ഗാറ്റൻ 968 GIF ക്വാണ്ടം ഉപയോഗിച്ചു. കാലിബ്രേറ്റ് ചെയ്ത പിക്സൽ വലുപ്പം 1.048Å ആണ്, ഡോസ് നിരക്ക് 3.83 e-Å-2s-1 ആണ്. 11 സെക്കൻഡിനുള്ളിൽ മൂവി ശേഖരിച്ച് 40 ഭാഗങ്ങളായി വിഭജിച്ചു. മൈക്രോസ്കോപ്പ് വീണ്ടും ഫോക്കസ് ചെയ്യാൻ കാർബൺ പൂശിയ പ്രദേശം ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് ഓരോ ദ്വാരത്തിലും മൂന്ന് മൂവികൾ ശേഖരിക്കുക. ആകെ, 3130 മൂവികൾ ശേഖരിച്ചു, -1 നും -3μm നും ഇടയിൽ ഡീഫോക്കസ് മൂല്യങ്ങൾ.
യുകെയിലെ ലീഡ്‌സ് സർവകലാശാലയിലെ ആസ്റ്റർബറി ബയോസ്ട്രക്ചർ ലബോറട്ടറിയിൽ (യുകെ) ഇതേ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ആർസി-എൽഎച്ച്116 സമുച്ചയത്തിനായുള്ള ഡാറ്റ ശേഖരിച്ചത്. 130 കെ മാഗ്നിഫിക്കേഷനോടെ കൗണ്ടിംഗ് മോഡിൽ ഡാറ്റ ശേഖരിച്ചു, പിക്സൽ വലുപ്പം 4.6 e-Å-2s-1 ഡോസോടെ 1.065 Å ആയി കാലിബ്രേറ്റ് ചെയ്തു. മൂവി 12 സെക്കൻഡിനുള്ളിൽ റെക്കോർഡുചെയ്‌ത് 48 ഭാഗങ്ങളായി വിഭജിച്ചു. ആകെ, 3359 ഫിലിമുകൾ ശേഖരിച്ചു, -1 നും -3μm നും ഇടയിലുള്ള ഡിഫോക്കസ് മൂല്യങ്ങൾ.
എല്ലാ ഡാറ്റ പ്രോസസ്സിംഗും Relion 3.0 പൈപ്പ്‌ലൈനിലാണ് (42) നടത്തുന്നത്. ഡോസ് വെയ്റ്റിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് ബീം ചലനം ശരിയാക്കാൻ Motioncorr 2 (43) ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് CTF (കോൺട്രാസ്റ്റ് ട്രാൻസ്ഫർ ഫംഗ്ഷൻ) പാരാമീറ്റർ നിർണ്ണയിക്കാൻ CTFFIND 4.1 (44) ഉപയോഗിക്കുക. ഈ പ്രാരംഭ പ്രോസസ്സിംഗ് ഘട്ടങ്ങൾക്ക് ശേഷമുള്ള സാധാരണ ഫോട്ടോമൈക്രോഗ്രാഫുകൾ ചിത്രം 2 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. S16. 250-പിക്സൽ ഫ്രെയിമിൽ 1000 കണികകളുടെ ഏകദേശം 250 പിക്സലുകൾ സ്വമേധയാ തിരഞ്ഞെടുത്ത് റഫറൻസ് ദ്വിമാന (2D) വർഗ്ഗീകരണം ഇല്ലാതെ ഓട്ടോമാറ്റിക് സെലക്ഷൻ ടെംപ്ലേറ്റ് സൃഷ്ടിക്കപ്പെടുന്നു, അതുവഴി സാമ്പിൾ മലിനീകരണം നേരിടുന്നതോ തിരിച്ചറിയാവുന്ന സ്വഭാവസവിശേഷതകളില്ലാത്തതോ ആയ വർഗ്ഗീകരണങ്ങളെ നിരസിക്കുന്നു. തുടർന്ന്, എല്ലാ മൈക്രോഫോട്ടോഗ്രാഫുകളിലും ഓട്ടോമാറ്റിക് സെലക്ഷൻ നടത്തി, RC-LH114-W 849,359 കണികകളായിരുന്നു, RC-LH116 സമുച്ചയം 476,547 കണികകളായിരുന്നു. തിരഞ്ഞെടുത്ത എല്ലാ കണികകളും രണ്ട് റൗണ്ട് നോൺ-റഫറൻസ് 2D വർഗ്ഗീകരണത്തിന് വിധേയമായി, ഓരോ റണ്ണിനും ശേഷം, കാർബൺ ഏരിയ, സാമ്പിൾ മലിനീകരണം, വ്യക്തമായ സവിശേഷതകളൊന്നുമില്ല അല്ലെങ്കിൽ ശക്തമായി ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്ന കണികകൾ നിരസിക്കപ്പെടുന്നു, അതിന്റെ ഫലമായി യഥാക്രമം 772,033 (90.9%) ഉം 359,678 (75.5%) ഉം ലഭിക്കും. RC-LH114-W, RC-LH116 എന്നിവയുടെ 3D വർഗ്ഗീകരണത്തിനായി കണികകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. സ്റ്റോക്കാസ്റ്റിക് ഗ്രേഡിയന്റ് ഡിസെന്റ് രീതി ഉപയോഗിച്ചാണ് പ്രാരംഭ 3D റഫറൻസ് മോഡൽ സൃഷ്ടിച്ചത്. പ്രാരംഭ മോഡൽ ഒരു റഫറൻസായി ഉപയോഗിച്ച്, തിരഞ്ഞെടുത്ത കണങ്ങളെ 3Dയിൽ നാല് വിഭാഗങ്ങളായി തരംതിരിച്ചിരിക്കുന്നു. ഈ വിഭാഗത്തിലെ മോഡൽ ഒരു റഫറൻസായി ഉപയോഗിച്ച്, ഏറ്റവും വലിയ വിഭാഗത്തിലെ കണികകളിൽ 3D ശുദ്ധീകരണം നടത്തുക, തുടർന്ന് ലായക പ്രദേശം മൂടുന്നതിന് പ്രാരംഭ 15Å ലോ-പാസ് ഫിൽട്ടർ ഉപയോഗിക്കുക, 6 പിക്സൽ സോഫ്റ്റ് അരികുകൾ ചേർക്കുക, മുകളിലെ ഡിറ്റക്ടറിന്റെ Gatan K2 പീക്ക് മോഡുലേഷൻ ട്രാൻസ്ഫർ ഫംഗ്ഷൻ ശരിയാക്കാൻ പിക്സലുകൾ പോസ്റ്റ്-പ്രോസസ് ചെയ്യുക. RC-LH114-W ഡാറ്റാസെറ്റിനായി, മാസ്കിന്റെ അരികുകളിലെ ശക്തമായ സാന്ദ്രത നീക്കം ചെയ്തുകൊണ്ട് ഈ പ്രാരംഭ മോഡൽ പരിഷ്കരിച്ചു (UCSF ചിമേരയിലെ കോർ കോംപ്ലക്സ് സാന്ദ്രതയിൽ നിന്ന് വിച്ഛേദിക്കപ്പെട്ടു). തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന മോഡലുകൾ (RC-LH114-W, RC-LH116 എന്നിവയുടെ റെസല്യൂഷനുകൾ യഥാക്രമം 3.91 ഉം 4.16 Å ഉം ആണ്) 3D വർഗ്ഗീകരണത്തിന്റെ രണ്ടാം റൗണ്ടിനുള്ള ഒരു റഫറൻസായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. ഉപയോഗിച്ച കണങ്ങളെ പ്രാരംഭ 3D ക്ലാസിലേക്ക് തരംതിരിച്ചിരിക്കുന്നു കൂടാതെ അയൽപക്കവുമായി ശക്തമായ ബന്ധം അടങ്ങിയിട്ടില്ല. ഓവർലാപ്പ് അല്ലെങ്കിൽ വ്യക്തമായ ഘടനാപരമായ സവിശേഷതകളുടെ അഭാവം. 3D വർഗ്ഗീകരണത്തിന്റെ രണ്ടാം റൗണ്ടിനുശേഷം, ഏറ്റവും ഉയർന്ന റെസല്യൂഷനുള്ള വിഭാഗം തിരഞ്ഞെടുത്തു [RC-LH114-W ന്, ഒരു വിഭാഗം 377,703 കണികകളാണ് (44.5%), RC-LH116 ന്, രണ്ട് വിഭാഗങ്ങളുണ്ട്, ആകെ 260,752 കണികകൾ (54.7%), ചെറിയ വ്യത്യാസത്തോടെ പ്രാരംഭ ഭ്രമണത്തിനുശേഷം വിന്യസിക്കുമ്പോൾ മാത്രം അവ സമാനമാകുന്നിടത്ത്]. തിരഞ്ഞെടുത്ത കണികകളെ 400-പിക്സൽ ബോക്സിൽ വീണ്ടും വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും 3D റിഫൈനിംഗ് വഴി പരിഷ്കരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. പ്രാരംഭ 15Å ലോ-പാസ് ഫിൽട്ടർ, 3 പിക്സൽ മാപ്പ് എക്സ്പാൻഷൻ, 3 പിക്സൽ സോഫ്റ്റ് മാസ്ക് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് സോൾവെന്റ് മാസ്ക് സൃഷ്ടിക്കുന്നത്. ഓരോ ഘട്ടത്തിനും ശേഷം, ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ടെക്സ്ചർ കൂടുതൽ പരിഷ്കരിക്കുന്നതിന്, ഓരോ കണികാ CTF റിഫൈൻമെന്റ്, ഓരോ കണികാ ചലന തിരുത്തൽ, ഓരോ കണികാ CTF റിഫൈനിന്റെ രണ്ടാം റൗണ്ട്, 3D റിഫൈൻമെന്റ്, സോൾവെന്റ് മാസ്കിംഗ്, പോസ്റ്റ്-പ്രോസസ്സിംഗ് എന്നിവ നടത്തുന്നു. 0.143 എന്ന FSC (ഫോറിയർ ഷെൽ കോറിലേഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റ്) കട്ട്-ഓഫ് മൂല്യം ഉപയോഗിച്ച്, RC-LH114-W, RC-LH116 എന്നിവയുടെ അന്തിമ മോഡലുകളുടെ റെസല്യൂഷനുകൾ യഥാക്രമം 2.65 ഉം 2.80Å ഉം ആണ്. അന്തിമ മോഡലിന്റെ FSC വക്രം ചിത്രം 2. S17 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
എല്ലാ പ്രോട്ടീൻ സീക്വൻസുകളും UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); പ്രോട്ടീൻ-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3) എന്നിവയിൽ നിന്ന് ഡൗൺലോഡ് ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു. RC-L, RC-M, RC-H എന്നിവയുടെ പ്രോട്ടീൻ സീക്വൻസുകളും Rba യുടെ ക്രിസ്റ്റൽ ഘടനയും ഉൾക്കൊള്ളുന്ന RC യുടെ ഒരു ഹോമോളജി മോഡൽ നിർമ്മിക്കാൻ SWISS-MODEL (45) ഉപയോഗിച്ചു. sphaeroides RC ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിച്ചു (PDB ID: 5LSE) (46). ജനറേറ്റഡ് മോഡലിനെ മാപ്പിലേക്ക് ഘടിപ്പിക്കുന്നതിന് UCSF ചിമേരയിലെ “ഫിറ്റ് മാപ്പ്” ടൂൾ ഉപയോഗിക്കുക (47), പ്രോട്ടീൻ ഘടന മെച്ചപ്പെടുത്തുക, കോഫാക്ടർ [4×BChl a (മോണോമർ ലൈബ്രറി അവശിഷ്ട നാമം = BCL), 2×BPh a (BPH), ഒന്നോ രണ്ടോ തരം UQ10 (U10), ഒരു നോൺ-ഹീം ഇരുമ്പ് (Fe), ഒരു 3,4-ഡൈഹൈഡ്രോഹെക്സാകാർബണൈൽകോളിൻ (QAK)] എന്നിവ ചേർക്കാൻ കൂട്ട് (48) ഉപയോഗിക്കുന്നു. മോണോമർ ലൈബ്രറിയിൽ QAK ലഭ്യമല്ലാത്തതിനാൽ, PHENIX (49) ലെ eLBOW ടൂൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇത് പാരാമീറ്ററൈസ് ചെയ്തു.
അടുത്തതായി, LH1 ഉപയൂണിറ്റ് നിർമ്മിച്ചു. തുടക്കത്തിൽ, PHENIX (49) ലെ ഓട്ടോമാറ്റിക് കൺസ്ട്രക്ഷൻ ടൂൾ ഉപയോഗിച്ച് മാപ്പും LH1-α, LH1-β പ്രോട്ടീൻ സീക്വൻസുകളും ഇൻപുട്ടായി ഉപയോഗിച്ച് LH1 സീക്വൻസിന്റെ ഒരു ഭാഗം യാന്ത്രികമായി നിർമ്മിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു. ഏറ്റവും പൂർണ്ണമായ LH1 സബ്യൂണിറ്റ് തിരഞ്ഞെടുത്ത്, അത് എക്സ്ട്രാക്റ്റ് ചെയ്ത് കൂട്ടിലേക്ക് ലോഡ് ചെയ്യുക, അതിൽ നഷ്ടപ്പെട്ട സീക്വൻസ് സ്വമേധയാ ചേർക്കുക, രണ്ട് BCls a (BCL) ഉം ഒരു സ്പിറില്ലോക്സാന്തിൻ (CRT) ഉം ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് മുഴുവൻ ഘടനയും സ്വമേധയാ പരിഷ്കരിക്കുക [പ്രസക്തമായ Rps അനുസരിച്ച് LH1 സമുച്ചയത്തിന്റെ സാന്ദ്രതയും അറിയപ്പെടുന്ന കരോട്ടിനോയിഡ് ഉള്ളടക്കവും. സ്പീഷീസ് (17)]. പൂർണ്ണമായ LH1 സബ്യൂണിറ്റ് പകർത്തുക, കൂടാതെ UCSF ചിമേര “ഡോക്കിംഗ് മാപ്പ് ടൂൾ” ഉപയോഗിച്ച് LH1 സാന്ദ്രതയുടെ തൊട്ടടുത്തുള്ള നോൺ-മോഡൽ ഏരിയയിൽ ഡോക്ക് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് കൂട്ടിൽ പരിഷ്കരിക്കുക; എല്ലാ LH1 സബ്യൂണിറ്റുകളും മാതൃകയാക്കുന്നതുവരെ പ്രക്രിയ ആവർത്തിക്കുക. RC-LH114-W ഘടനയ്ക്കായി, കൂട്ടിലെ അലോക്കേറ്റഡ് ഡെൻസിറ്റി വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിലൂടെ, USCF ചിമേര മാപ്പിലെ ശേഷിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ ഇതര ഘടകങ്ങളിൽ നിന്ന് പ്രോട്ടീൻ വേർതിരിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ പ്രാരംഭ മോഡലും ശേഷിക്കുന്ന ഉപയൂണിറ്റുകളും (പ്രോട്ടീൻ-W) മോഡലിംഗ് സ്ഥാപിക്കാൻ ഓട്ടോബിൽഡ് ഉപകരണം ഉപയോഗിക്കുന്നു. PHENIX (49). കൂട്ടിലെ (48) ഫലമായുണ്ടാകുന്ന മോഡലിലേക്ക് നഷ്ടപ്പെട്ട ഏതെങ്കിലും സീക്വൻസുകൾ ചേർക്കുക, തുടർന്ന് മുഴുവൻ ഉപയൂണിറ്റും സ്വമേധയാ പരിഷ്കരിക്കുക. ശേഷിക്കുന്ന അലോക്കേറ്റഡ് ഡെൻസിറ്റി ലിപിഡുകളുടെ (CDL = CDL, POPC = 6PL, POPG = PGT എന്നിവയുടെ PDB മോണോമർ ലൈബ്രറി ഐഡി), β-DDM ഡിറ്റർജന്റ് (LMT), UQ10 തന്മാത്രകൾ (U10) എന്നിവയുടെ സംയോജനവുമായി യോജിക്കുന്നു. മോഡൽ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകളും ഫിറ്റിന്റെ ദൃശ്യ നിലവാരവും കൂടുതൽ മെച്ചപ്പെടുത്താൻ കഴിയാത്തതുവരെ പൂർണ്ണമായ പ്രാരംഭ മോഡൽ മികച്ചതാക്കാൻ കൂട്ടിൽ (48) PHENIX ഒപ്റ്റിമൈസേഷനും (49) മാനുവൽ ഒപ്റ്റിമൈസേഷനും ഉപയോഗിക്കുക. അവസാനമായി, ലോക്കൽ മാപ്പ് മൂർച്ച കൂട്ടാൻ LocScale (50) ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് അലോക്കേറ്റഡ് ഡെൻസിറ്റി മോഡലിംഗ്, ഓട്ടോമാറ്റിക്, മാനുവൽ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ എന്നിവയുടെ മറ്റ് നിരവധി ചക്രങ്ങൾ നടത്തുക.
അതത് സാന്ദ്രതയ്ക്കുള്ളിൽ ഡോക്ക് ചെയ്തിരിക്കുന്ന അതത് പെപ്റ്റൈഡുകൾ, കോഫാക്ടറുകൾ, മറ്റ് ലിപിഡുകൾ, ക്വിനോണുകൾ എന്നിവ ചിത്രം 1 ലും 2 ലും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. S18 മുതൽ S23 വരെ. അന്തിമ മോഡലിന്റെ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് വിവരങ്ങൾ പട്ടിക S1 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
മറ്റുവിധത്തിൽ വ്യക്തമാക്കിയിട്ടില്ലെങ്കിൽ, UV/Vis/NIR അബ്സോർപ്ഷൻ സ്പെക്ട്ര ഒരു Cary60 സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്ററിൽ (Agilent, USA) 250 nm മുതൽ 1000 nm വരെയുള്ള 1 nm ഇടവേളകളിലും 0.1 സെക്കൻഡ് സംയോജന സമയത്തിലും ശേഖരിച്ചു.
1 ന്റെ A880 ലേക്ക് 2 mm പാത്ത് ഉള്ള ഒരു ക്വാർട്സ് കുവെറ്റിൽ സാമ്പിൾ നേർപ്പിച്ച്, 400 നും 1000 nm നും ഇടയിൽ ആഗിരണം ചെയ്യുന്ന സ്പെക്ട്രം ശേഖരിക്കുക. വൃത്താകൃതിയിലുള്ള ഡൈക്രോയിക് സ്പെക്ട്ര ഒരു ജാസ്കോ 810 സ്പെക്ട്രോപോളാരിമീറ്ററിൽ (ജാസ്കോ, ജപ്പാൻ) 400 nm നും 950 nm നും ഇടയിൽ 1 nm ഇടവേളകളിൽ 20 nm min-1 സ്കാൻ നിരക്കിൽ ശേഖരിച്ചു.
കോർ കോംപ്ലക്സിനെ ഏകദേശം 50 ന്റെ A880 ആയി നേർപ്പിച്ചാണ് മോളാർ എക്‌സ്റ്റിൻഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റ് നിർണ്ണയിക്കുന്നത്. 10μl വോളിയം 990μl ബൈൻഡിംഗ് ബഫറിലോ മെഥനോളിലോ നേർപ്പിക്കുക, BChl ഡീഗ്രഡേഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിന് ഉടനടി ആഗിരണം സ്പെക്ട്രം ശേഖരിക്കുക. ഓരോ മെഥനോൾ സാമ്പിളിലെയും BChl ഉള്ളടക്കം 54.8 mM-1 cm-1 ന്റെ 771 nm ലെ എക്‌സ്റ്റിൻഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റ് ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കി, എക്‌സ്റ്റിൻഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റ് നിർണ്ണയിച്ചു (51). കോർ കോംപ്ലക്സ് കോൺസൺട്രേഷൻ നിർണ്ണയിക്കാൻ അളന്ന BChl കോൺസൺട്രേഷനെ 32 (RC-LH114-W) അല്ലെങ്കിൽ 36 (RC-LH116) കൊണ്ട് ഹരിക്കുക, തുടർന്ന് ബഫർ എക്‌സ്റ്റിൻഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റിൽ ശേഖരിച്ച അതേ സാമ്പിളിന്റെ അബ്‌സോർപ്ഷൻ സ്പെക്ട്രം നിർണ്ണയിക്കാൻ ഇത് ഉപയോഗിക്കുന്നു. സമാന്തരമായി. ഓരോ സാമ്പിളിനും മൂന്ന് ആവർത്തിച്ചുള്ള അളവുകൾ എടുത്തു, BChl Qy പരമാവധിയുടെ ശരാശരി ആഗിരണം കണക്കുകൂട്ടലിനായി ഉപയോഗിച്ചു. 878 nm-ൽ അളക്കുന്ന RC-LH114-W ന്റെ വംശനാശ ഗുണകം 3280±140 mM-1 cm-1 ആണ്, അതേസമയം 880 nm-ൽ അളക്കുന്ന RC-LH116 ന്റെ വംശനാശ ഗുണകം 3800±30 mM-1 cm-1 ആണ്.
(52) ലെ രീതി അനുസരിച്ച് UQ10 അളക്കപ്പെട്ടു. ചുരുക്കത്തിൽ, റിവേഴ്സ് ഫേസ് HPLC (RP-HPLC) എജിലന്റ് 1200 HPLC സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ചാണ് നടത്തിയത്. 0.02% (w/v) ഫെറിക് ക്ലോറൈഡ് അടങ്ങിയ 50μl 50:50 മെഥനോൾ:ക്ലോറോഫോമിൽ ഏകദേശം 0.02 nmol RC-LH116 അല്ലെങ്കിൽ RC-LH114-W ലയിപ്പിക്കുക, കൂടാതെ പ്രീ-ഇക്വിലിബ്രേറ്റഡ് ബെക്ക്മാൻ കോൾട്ടർ അൾട്രാസ്ഫിയർ ODS 4.6 mm 40°C യിൽ 1 ml-1 മിനിറ്റ്-1 ൽ HPLC ലായകത്തിൽ (80:20 മെഥനോൾ:2-പ്രൊപ്പനോൾ) ×25 സെ.മീ നിരയിൽ ലയിപ്പിക്കുക. 275 nm (UQ10), 450 nm (കരോട്ടിനോയിഡുകൾ), 780 nm (BChl) എന്നിവയിൽ 1 മണിക്കൂർ ആഗിരണം നിരീക്ഷിക്കാൻ ഒരു HPLC ലായകത്തിൽ ഐസോക്രാറ്റിക് എല്യൂഷൻ നടത്തുക. 25.5 മിനിറ്റിൽ 275 nm ക്രോമാറ്റോഗ്രാമിലെ പീക്ക് സംയോജിപ്പിച്ചു, അതിൽ മറ്റ് കണ്ടെത്താവുന്ന സംയുക്തങ്ങളൊന്നും അടങ്ങിയിരുന്നില്ല. 0 മുതൽ 5.8 nmol വരെയുള്ള ശുദ്ധമായ മാനദണ്ഡങ്ങളുടെ കുത്തിവയ്പ്പിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കിയ കാലിബ്രേഷൻ വക്രത്തെ പരാമർശിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്ത UQ10 ന്റെ മോളാർ അളവ് കണക്കാക്കാൻ സംയോജിത പ്രദേശം ഉപയോഗിക്കുന്നു (ചിത്രം S14). ഓരോ സാമ്പിളും മൂന്ന് പകർപ്പുകളായി വിശകലനം ചെയ്തു, റിപ്പോർട്ട് ചെയ്ത പിശക് ശരാശരിയുടെ SD യുമായി യോജിക്കുന്നു.
30 μM കുറഞ്ഞ ഹോഴ്സ് ഹാർട്ട് സൈറ്റോക്രോം c2 (മെർക്ക്, യുകെ) ഉം 0 മുതൽ 50 μMUQ2 (മെർക്ക്, യുകെ) ഉം ഉപയോഗിച്ച് പരമാവധി 0.1 Qy ആഗിരണം ചെയ്യുന്ന RC-LH1 സമുച്ചയം അടങ്ങിയ ഒരു ലായനി തയ്യാറാക്കി. ഓരോ UQ2 സാന്ദ്രതയിലും മൂന്ന് 1-മില്ലി സാമ്പിളുകൾ തയ്യാറാക്കി, അളക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഇരുട്ടുമായി പൂർണ്ണമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നത് ഉറപ്പാക്കാൻ 4°C-ൽ ഇരുട്ടിൽ രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. 300 nm ഫ്ലേം/500 ലൈൻ ഗ്രേറ്റിംഗ്, 1.24 mm ഇൻലെറ്റ്, 0.12 mm മധ്യ, 0.6 mm ഔട്ട്‌ലെറ്റ് സ്ലിറ്റുകൾ എന്നിവ സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു OLIS RSM1000 മോഡുലാർ സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്ററിലേക്ക് ലായനി ലോഡ് ചെയ്തു. ഉത്തേജന വെളിച്ചം ഒഴിവാക്കാൻ സാമ്പിൾ ഫോട്ടോട്യൂബിന്റെയും റഫറൻസ് ഫോട്ടോമൾട്ടിപ്ലയർ ട്യൂബിന്റെയും പ്രവേശന കവാടത്തിൽ 600 nm നീളമുള്ള ഒരു പാസ് ഫിൽട്ടർ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്നു. 0.15 സെക്കൻഡ് ഇന്റഗ്രേഷൻ സമയത്തോടെ 550 nm-ൽ ആഗിരണം നിരീക്ഷിച്ചു. 880 nm M880F2 LED (ലൈറ്റ് എമിറ്റിംഗ് ഡയോഡ്) (തോർലാബ്സ് ലിമിറ്റഡ്, യുകെ) യിൽ നിന്ന് ഒരു ഫൈബർ ഒപ്റ്റിക് കേബിളിലൂടെ 90% തീവ്രതയിൽ ഒരു DC2200 കൺട്രോളർ (തോർലാബ്സ് ലിമിറ്റഡ്, യുകെ) വഴി എക്സൈറ്റേഷൻ ലൈറ്റ് പുറപ്പെടുവിക്കുകയും 90° കോണിൽ പ്രകാശ സ്രോതസ്സിലേക്ക് പുറപ്പെടുവിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. സാമ്പിൾ തുടക്കത്തിൽ ആഗിരണം ചെയ്യാത്ത ഏതെങ്കിലും പ്രകാശത്തെ തിരികെ നൽകുന്നതിന് അളക്കുന്ന ബീം കണ്ണാടിക്ക് എതിർവശത്താണ്. 50 സെക്കൻഡ് പ്രകാശത്തിന് 10 സെക്കൻഡ് മുമ്പ് ആഗിരണം നിരീക്ഷിക്കുക. തുടർന്ന് ക്വിനോലോൾ സ്വയമേവ സൈറ്റോക്രോം c23 + എത്രത്തോളം കുറയ്ക്കുന്നുവെന്ന് വിലയിരുത്താൻ ഇരുട്ടിൽ 60 സെക്കൻഡ് ആഗിരണം കൂടുതൽ നിരീക്ഷിച്ചു (അസംസ്കൃത ഡാറ്റയ്ക്കായി ചിത്രം S8 കാണുക).
0.5 മുതൽ 10 സെക്കൻഡിനുള്ളിൽ (UQ2 സാന്ദ്രതയെ ആശ്രയിച്ച്) ഒരു ലീനിയർ പ്രാരംഭ നിരക്ക് ഘടിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് ഡാറ്റ പ്രോസസ്സ് ചെയ്തു. ഓരോ UQ2 സാന്ദ്രതയിലും മൂന്ന് സാമ്പിളുകളുടെയും നിരക്കുകൾ ശരാശരി കണക്കാക്കി. അതത് എക്‌സ്റ്റിൻഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റ് കണക്കാക്കിയ RC-LH1 സാന്ദ്രത നിരക്ക് കാറ്റലറ്റിക് കാര്യക്ഷമതയിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിച്ചു, ഒറിജിൻ പ്രോ 2019 (ഒറിജിൻ ലാബ്, യുഎസ്എ) ൽ പ്ലോട്ട് ചെയ്‌തു, കൂടാതെ വ്യക്തമായ Km, Kcat മൂല്യങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കാൻ മൈക്കിളിസ്-മെന്റൻ മോഡലിൽ ഘടിപ്പിച്ചു.
ക്ഷണികമായ ആഗിരണം അളവുകൾക്കായി, RC-LH1 സാമ്പിൾ 50 mM സോഡിയം അസ്കോർബേറ്റും (മെർക്ക്, യുഎസ്എ) 0.4 mM ടെർബ്യൂട്ടിനും (മെർക്ക്, യുഎസ്എ) അടങ്ങിയ IMAC ബഫറിൽ ~2μM ആയി നേർപ്പിച്ചു. അസ്കോർബിക് ആസിഡ് ഒരു ത്യാഗപരമായ ഇലക്ട്രോൺ ദാതാവായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ പ്രധാന ആർ‌സി ദാതാവ് അളവെടുക്കൽ പ്രക്രിയയിലുടനീളം കുറയുന്നുവെന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ ടെർട്ട്-ബ്യൂട്ടാക്ലോഫെൻ ഒരു QB ഇൻഹിബിറ്ററായി ഉപയോഗിക്കുന്നു (അതായത്, ഫോട്ടോഓക്‌സിഡൈസ് ചെയ്തിട്ടില്ല). ലേസർ പാതയിലെ സാമ്പിളിന് എക്‌സൈറ്റേഷൻ പൾസുകൾക്കിടയിൽ ഇരുണ്ട പൊരുത്തപ്പെടുത്തലിന് മതിയായ സമയം ഉണ്ടെന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ 2 മില്ലീമീറ്റർ ഒപ്റ്റിക്കൽ പാത്ത് നീളമുള്ള ഒരു കസ്റ്റം റൊട്ടേറ്റിംഗ് സെല്ലിലേക്ക് (ഏകദേശം 0.1 മീറ്റർ വ്യാസം, 350 RPM) ഏകദേശം 3 മില്ലി സാമ്പിൾ ചേർക്കുന്നു. 1 kHz (NIR-ന് 20 nJ അല്ലെങ്കിൽ Vis-ന് 100 nJ) ആവർത്തന നിരക്കിൽ 880 nm-ൽ സാമ്പിളിനെ ഉത്തേജിപ്പിക്കാൻ Ti: സഫയർ ലേസർ സിസ്റ്റം (സ്പെക്ട്ര ഫിസിക്സ്, യുഎസ്എ) വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ~100-fs ലേസർ പൾസുകൾ ഉപയോഗിക്കുക. ഡാറ്റ ശേഖരിക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, സാമ്പിൾ ഏകദേശം 30 മിനിറ്റ് എക്‌സൈറ്റേഷൻ ലൈറ്റിലേക്ക് തുറന്നുവിടുക. എക്‌സ്‌പോഷർ QA നിഷ്‌ക്രിയത്വത്തിന് കാരണമാകും (ഒരുപക്ഷേ ഒന്നോ രണ്ടോ തവണ QA കുറയ്ക്കാം). എന്നാൽ ഈ പ്രക്രിയ പഴയപടിയാക്കാനാകുമെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കുക, കാരണം ദീർഘനേരം ഇരുണ്ട പൊരുത്തപ്പെടുത്തലിന് ശേഷം, RC പതുക്കെ QA പ്രവർത്തനത്തിലേക്ക് മടങ്ങും. -10 മുതൽ 7000 ps വരെ കാലതാമസത്തോടെ ക്ഷണികമായ സ്പെക്ട്ര അളക്കാൻ ഒരു ഹീലിയോസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ (അൾട്രാഫാസ്റ്റ് സിസ്റ്റംസ്, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ചു. ഡാറ്റ സെറ്റുകൾ അൺഗ്രൂപ്പ് ചെയ്യാനും പിന്നീട് ലയിപ്പിക്കാനും സ്റ്റാൻഡേർഡ് ചെയ്യാനും സർഫസ് എക്സ്പ്ലോറർ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (അൾട്രാഫാസ്റ്റ് സിസ്റ്റംസ്, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിക്കുക. ക്ഷയവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഡിഫറൻഷ്യൽ സ്പെക്ട്ര ലഭിക്കുന്നതിന് സംയോജിത ഡാറ്റ സെറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് കാർപെറ്റ് വ്യൂ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ പാക്കേജ് (ലൈറ്റ് കൺവേർഷൻ ലിമിറ്റഡ്, ലിത്വാനിയ) ഉപയോഗിക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ ഒറിജിനിലെ (ഒറിജിൻ ലാബ്, യുഎസ്എ) സിംഗിൾ-വേവ്ലെങ്ത് സ്പെക്ട്രൽ പരിണാമത്തിന് അനുയോജ്യമാക്കുന്നതിന് ഉപകരണ പ്രതികരണവുമായി ഒന്നിലധികം എക്‌സ്‌പോണന്റുകളെ സംയോജിപ്പിക്കുന്ന ഒരു ഫംഗ്ഷൻ ഉപയോഗിക്കുക.
മുകളിൽ സൂചിപ്പിച്ചതുപോലെ (53), RC, പെരിഫറൽ LH2 ആന്റിന എന്നിവ ഇല്ലാത്ത LH1 കോംപ്ലക്സ് അടങ്ങിയ ഒരു ഫോട്ടോസിന്തറ്റിക് ഫിലിം തയ്യാറാക്കി. മെംബ്രൺ 20 mM ട്രിസിൽ (pH 8.0) നേർപ്പിച്ച് 2 mm ഒപ്റ്റിക്കൽ പാത്ത് ഉള്ള ഒരു ക്വാർട്സ് കുവെറ്റിലേക്ക് ലോഡ് ചെയ്തു. -10 മുതൽ 7000 ps വരെ കാലതാമസത്തോടെ 540 nm ൽ സാമ്പിളിനെ ഉത്തേജിപ്പിക്കാൻ ഒരു 30nJ ലേസർ പൾസ് ഉപയോഗിച്ചു. Rps. pal സാമ്പിളിനായി വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ഡാറ്റ സെറ്റ് പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുക.
4°C-ൽ 150,000 RCF-ൽ 2 മണിക്കൂർ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി മെംബ്രൺ പെല്ലറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് 880 nm-ൽ അതിന്റെ ആഗിരണം 20 mM tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl എന്നിവയിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു. 4°C-ൽ ഇരുട്ടിൽ 1 മണിക്കൂർ 2% (w/v) β-DDM-ൽ പതുക്കെ ഇളക്കി മെംബ്രൺ ലയിപ്പിക്കുക. സാമ്പിൾ 100 mM ട്രൈതൈലാമോണിയം കാർബണേറ്റിൽ (pH 8.0) (TEAB; മെർക്ക്, UK) 2.5 mg ml-1 പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയിലേക്ക് നേർപ്പിച്ചു (ബയോ-റാഡ് വിശകലനം). മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച രീതിയിൽ നിന്ന് (54) കൂടുതൽ പ്രോസസ്സിംഗ് നടത്തി, 50 μg പ്രോട്ടീൻ 1% (w/v) സോഡിയം ലോറേറ്റ് അടങ്ങിയ 50 μl TEAB-ലേക്ക് നേർപ്പിച്ചുകൊണ്ട് (മെർക്ക്, UK) കൂടുതൽ പ്രോസസ്സിംഗ് നടത്തി. 60 സെക്കൻഡ് നേരത്തേക്ക് സോണിക്കേഷൻ നടത്തിയ ശേഷം, 37°C-ൽ 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) ഉപയോഗിച്ച് 30 മിനിറ്റ് കുറയ്ക്കുക. S-ആൽക്കൈലേഷനായി, സാമ്പിൾ 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് 200 mM ഐസോപ്രോപനോൾ സ്റ്റോക്ക് ലായനിയിൽ നിന്ന് 10 മിനിറ്റ് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ചേർക്കുക. 2 μg ട്രിപ്സിൻ/എൻഡോപ്രോട്ടീനേസ് ലൈസ്-സി മിശ്രിതം (പ്രോമെഗ യുകെ) ചേർത്ത് പ്രോട്ടിയോലൈറ്റിക് ദഹനം നടത്തി, 37°C-ൽ 3 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. 50 μl എഥൈൽ അസറ്റേറ്റും 10 μl 10% (v/v) LC ഗ്രേഡ് ട്രൈഫ്ലൂറോഅസെറ്റിക് ആസിഡും (TFA; തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, UK) ചേർത്ത് 60 സെക്കൻഡ് വോർട്ടെക്സിംഗ് നടത്തി ലോറേറ്റ് സർഫാക്റ്റന്റ് വേർതിരിച്ചെടുത്തു. 15,700 RCF-ൽ 5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴിയാണ് ഘട്ടം വേർതിരിക്കൽ പ്രോത്സാഹിപ്പിച്ചത്. നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്, പെപ്റ്റൈഡ് അടങ്ങിയ താഴത്തെ ഘട്ടം ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം ആസ്പിറേറ്റ് ചെയ്യാനും ഡീസാൾട്ട് ചെയ്യാനും ഒരു C18 സ്പിൻ കോളം (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, യുകെ) ഉപയോഗിച്ചു. വാക്വം സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ഉണക്കിയ ശേഷം, സാമ്പിൾ 0.5% TFA-യിലും 3% അസെറ്റോണിട്രൈലിലും ലയിപ്പിച്ചു, കൂടാതെ മുമ്പ് വിശദീകരിച്ച സിസ്റ്റം പാരാമീറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് നാനോഫ്ലോ RP ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി ഉപയോഗിച്ച് 500 ng വിശകലനം ചെയ്തു.
Rps. palustris proteome ഡാറ്റാബേസിനായി തിരയുന്നതിന് പ്രോട്ടീൻ തിരിച്ചറിയലിനും ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനും MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ഉപയോഗിക്കുക (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). ഡാറ്റാസെറ്റ് ഐഡന്റിഫയർ PXD020402 ന് കീഴിൽ PRIDE പങ്കാളി ശേഖരം (http://proteomecentral.proteomexchange.org) വഴി മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റ പ്രോട്ടിയോം എക്സ്ചേഞ്ച് അലയൻസിൽ നിക്ഷേപിച്ചിട്ടുണ്ട്.
ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോണൈസേഷൻ മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് RPLC നടത്തിയ വിശകലനത്തിനായി, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് Rps-ൽ നിന്നാണ് RC-LH1 കോംപ്ലക്സ് തയ്യാറാക്കിയത്. മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച രീതി (16) ഉപയോഗിച്ച്, പാലസ്ട്രിസ് കോശങ്ങളിൽ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്ന പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത 20 mM ഹെപ്പസിൽ 2 mg ml-1 (pH 7.8), 100 mM NaCl, 0.03% (w/v) β- (ബയോ-റാഡ് വിശകലനം) ) DDM എന്നിവയായിരുന്നു. നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്, 2D പ്യൂരിഫിക്കേഷൻ കിറ്റ് (GE ഹെൽത്ത്കെയർ, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് 10 μg പ്രോട്ടീൻ പ്രിസിപ്റ്റൈറ്റ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുക്കുക, കൂടാതെ 20 μl 60% (v/v) ഫോർമിക് ആസിഡ് (FA), 20% (v/v) അസെറ്റോണിട്രൈൽ, 20% (v/v) വെള്ളത്തിൽ അവശിഷ്ടം ലയിപ്പിക്കുക. അഞ്ച് മൈക്രോലിറ്ററുകൾ RPLC (ഡയോനെക്സ് RSLC) ഉപയോഗിച്ച് മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (മാക്സിസ് UHR-TOF, ബ്രൂക്കർ) സംയോജിപ്പിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. 60°C യിലും 100μlmin -1 ലും വേർതിരിക്കലിനായി MabPac 1.2×100 mm കോളം (Thermo Fisher Scientific, UK) ഉപയോഗിക്കുക, 85% (v / v) ലായക A [0.1% (v / v) FA ഉം 0.02% (V/v) TFA ജലീയ ലായനിയും] മുതൽ 85% (v/v) ലായക B [0.1%(v/v) FA ഉം 0.02%(v/v) 90%(v/v) അസെറ്റോണിട്രൈൽ TFA ൽ]] സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോണൈസേഷൻ ഉറവിടവും 60 മിനിറ്റിലധികം സ്ഥിരമായ പാരാമീറ്ററുകളും ഉപയോഗിച്ച്, മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ 100 മുതൽ 2750 m/z വരെ (മാസ്-ടു-ചാർജ് അനുപാതം) നേടുന്നു. ExPASy ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് റിസോഴ്‌സ് പോർട്ടൽ FindPept ടൂളിന്റെ (https://web.expasy.org/findpept/) സഹായത്തോടെ, മാസ് സ്പെക്ട്രം സമുച്ചയത്തിന്റെ ഉപയൂണിറ്റുകളിലേക്ക് മാപ്പ് ചെയ്യുക.
100 മില്ലി NF-ലോ (10μMm-2 s-1), മീഡിയം (30μMm-2 s-1) അല്ലെങ്കിൽ ഉയർന്ന (300μMm-2 s-1) വെളിച്ചത്തിൽ 72 മണിക്കൂർ കോശങ്ങൾ വളർത്തി. 100 മില്ലി സ്ക്രൂ-ടോപ്പ് കുപ്പിയിൽ (23) M22 മീഡിയം (അമോണിയം സൾഫേറ്റ് ഒഴിവാക്കി സോഡിയം സക്സിനേറ്റ് സോഡിയം അസറ്റേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്ന M22 മീഡിയം). അഞ്ച് 30-സെക്കൻഡ് സൈക്കിളുകളിൽ, കോശങ്ങൾ ലൈസ് ചെയ്യുന്നതിനായി 0.1 മൈക്രോൺ ഗ്ലാസ് ബീഡുകൾ 1:1 എന്ന വോളിയം അനുപാതത്തിൽ ബീഡ് ചെയ്തു, 5 മിനിറ്റ് ഐസിൽ തണുപ്പിച്ചു. ലയിക്കാത്ത പദാർത്ഥം, പൊട്ടാത്ത കോശങ്ങൾ, ഗ്ലാസ് ബീഡുകൾ എന്നിവ ഒരു ബെഞ്ച്‌ടോപ്പ് മൈക്രോസെൻട്രിഫ്യൂജിൽ 10 മിനിറ്റ് നേരം 16,000 RCF-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി നീക്കം ചെയ്തു. 40/15% (w/w) സുക്രോസ് ഗ്രേഡിയന്റിൽ 10 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ൽ 100,000 RCF ഉള്ള Ti 70.1 റോട്ടറിൽ മെംബ്രൺ വേർതിരിച്ചു.
ഞങ്ങളുടെ മുൻ കൃതിയിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ, PufW (16)-ലെ ഹിസ് ടാഗിന്റെ ഇമ്മ്യൂണോഡെറ്റക്ഷൻ. ചുരുക്കത്തിൽ, 2x SDS ലോഡിംഗ് ബഫറിൽ (മെർക്ക്, യുകെ) ശുദ്ധീകരിച്ച കോർ കോംപ്ലക്സ് (11.8 nM) അല്ലെങ്കിൽ RC യുടെ അതേ സാന്ദ്രത (കുറഞ്ഞ വ്യത്യാസ സ്പെക്ട്രം കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ ഓക്സീകരണം വഴി നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്നു) അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന മെംബ്രൺ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, യുകെ) രണ്ടുതവണ നേർപ്പിച്ചു. 12% ബിസ്-ട്രിസ് നുപേജ് ജെല്ലിന്റെ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, യുകെ) ഒരു പകർപ്പിൽ പ്രോട്ടീനുകൾ വേർതിരിച്ചു. RC-L ഉപയൂണിറ്റ് ലോഡ് ചെയ്യുന്നതിനും ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിനുമായി കൂമാസി ബ്രില്യന്റ് ബ്ലൂ (ബയോ-റാഡ്, യുകെ) ഉപയോഗിച്ച് ഒരു ജെൽ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. രണ്ടാമത്തെ ജെല്ലിലെ പ്രോട്ടീൻ ഇമ്മ്യൂണോഅസെയ്ക്കായി മെഥനോൾ-ആക്ടിവേറ്റഡ് പോളി വിനൈലിഡിൻ ഫ്ലൂറൈഡ് (PVDF) മെംബ്രണിലേക്ക് (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, യുകെ) മാറ്റി. 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20, 5% (w / v) സ്കിം ചെയ്ത പാൽപ്പൊടി എന്നിവയിൽ PVDF മെംബ്രൺ തടഞ്ഞു, തുടർന്ന് ആന്റി-ഹിസ് പ്രൈമറി ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് (1:1000 A190-114A, ബെഥൈൽ ലബോറട്ടറീസ്, യുഎസ്എയിൽ നേർപ്പിച്ച ആന്റിബോഡി ബഫറിൽ [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20] 4 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ആന്റിബോഡി ബഫറിൽ 5 മിനിറ്റ് നേരം 3 തവണ കഴുകിയ ശേഷം, മെംബ്രൺ കുതിരലാട പെറോക്സിഡേസ് (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, യുകെ) ആന്റി-മൗസ് സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡിയുമായി (ആന്റിബോഡി ബഫറിൽ 1:10,000 ലയിപ്പിച്ചത്) സംയോജിപ്പിച്ചു. WESTAR ETA C 2.0 കെമിലുമിനെസെൻസ് സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് (സയനജെൻ, ഇറ്റലി), അമർഷാം ഇമേജർ 600 (ജിഇ ഹെൽത്ത്‌കെയർ, യുകെ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കണ്ടെത്തൽ അനുവദിക്കുന്നതിനായി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക (ആന്റിബോഡി ബഫറിൽ 3 വാഷുകൾക്ക് ശേഷം 5 മിനിറ്റ്).
ഇമേജ്ജെ (57)-ൽ, ഓരോ സ്റ്റെയിൻഡ് ജെല്ലിന്റെയും അല്ലെങ്കിൽ ഇമ്മ്യൂണോഅസെ ലെയ്‌നിന്റെയും തീവ്രത വിതരണം വരച്ച്, പീക്കിന് കീഴിലുള്ള പ്രദേശം സംയോജിപ്പിച്ച് ആർ‌സി-എൽ (സ്റ്റെയിൻഡ് ജെൽ) ന്റെയും പ്രോട്ടീൻ-ഡബ്ല്യു (ഇമ്മ്യൂണോഅസെ) യുടെയും തീവ്രത അനുപാതം കണക്കാക്കി. ശുദ്ധമായ ആർ‌സി-എൽ‌എച്ച് 114-ഡബ്ല്യു സാമ്പിളിൽ ആർ‌സി-എൽ ന്റെയും പ്രോട്ടീൻ-ഡബ്ല്യുവിന്റെയും അനുപാതം 1:1 ആണെന്ന് അനുമാനിച്ചുകൊണ്ട് ഈ അനുപാതങ്ങളെ മോളാർ അനുപാതങ്ങളാക്കി മാറ്റി, അതനുസരിച്ച് മുഴുവൻ ഡാറ്റാ സെറ്റും സാധാരണവൽക്കരിച്ചു.
ഈ ലേഖനത്തിനായുള്ള അനുബന്ധ വസ്തുക്കൾക്ക്, ദയവായി http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 കാണുക.
ക്രിയേറ്റീവ് കോമൺസ് ആട്രിബ്യൂഷൻ ലൈസൻസിന്റെ നിബന്ധനകൾക്ക് വിധേയമായി വിതരണം ചെയ്യുന്ന ഒരു ഓപ്പൺ ആക്‌സസ് ലേഖനമാണിത്. യഥാർത്ഥ കൃതി ശരിയായി ഉദ്ധരിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ, ഏത് മാധ്യമത്തിലും അനിയന്ത്രിതമായ ഉപയോഗം, വിതരണം, പുനർനിർമ്മാണം എന്നിവ ഈ ലേഖനം അനുവദിക്കുന്നു.
കുറിപ്പ്: നിങ്ങൾ പേജിലേക്ക് ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന വ്യക്തിക്ക് ഇമെയിൽ കാണണമെന്ന് നിങ്ങൾ ആഗ്രഹിക്കുന്നുണ്ടെന്നും അത് സ്പാം അല്ലെന്നും അറിയാൻ വേണ്ടി മാത്രമേ നിങ്ങളുടെ ഇമെയിൽ വിലാസം നൽകാൻ ഞങ്ങൾ ആവശ്യപ്പെടുകയുള്ളൂ. ഞങ്ങൾ ഒരു ഇമെയിൽ വിലാസവും പിടിച്ചെടുക്കില്ല.
നിങ്ങൾ ഒരു സന്ദർശകനാണോ എന്ന് പരിശോധിക്കുന്നതിനും സ്വയമേവയുള്ള സ്പാം സമർപ്പിക്കൽ തടയുന്നതിനും ഈ ചോദ്യം ഉപയോഗിക്കുന്നു.
ഡേവിഡ് ജെ. കെ. സ്വെയിൻസ്ബറി, പാർക്ക് ക്വിയാൻ, ഫിലിപ്പ് ജെ. ജാക്സൺ, കൈറ്റ്ലിൻ എം. ഫാരീസ്, ഡാരിയസ് എം. നീഡ്സ്വീഡ്സ്കി, എലിസബത്ത് സി. മാർട്ടിൻ, ഡേവിഡ് എ. ഫാർമർ, ലോർണ എ. മാലോൺ, റെബേക്ക എഫ്. തോംസൺ, നീൽ എ. റാൻസൻ, ഡാനിയൽ പി. കാനിഫ്, മാർക്ക് ജെ. ഡിക്ക്മാൻ, ഡ്യൂയി ഹോൾട്ടൻ, ക്രിസ്റ്റീൻ കിർമയർ, ആൻഡ്രൂ ഹിച്ച്കോക്ക്, സി. നീൽ ഹണ്ടർ
പ്രതിപ്രവർത്തന കേന്ദ്രത്തിലെ ലൈറ്റ് ട്രാപ്പ് 1 സമുച്ചയത്തിന്റെ ഉയർന്ന റെസല്യൂഷൻ ഘടന ക്വിനോൺ ചലനാത്മകതയെക്കുറിച്ച് പുതിയ ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകുന്നു.
ഡേവിഡ് ജെ. കെ. സ്വെയിൻസ്ബറി, പാർക്ക് ക്വിയാൻ, ഫിലിപ്പ് ജെ. ജാക്സൺ, കൈറ്റ്ലിൻ എം. ഫാരീസ്, ഡാരിയസ് എം. നീഡ്സ്വീഡ്സ്കി, എലിസബത്ത് സി. മാർട്ടിൻ, ഡേവിഡ് എ. ഫാർമർ, ലോർണ എ. മാലോൺ, റെബേക്ക എഫ്. തോംസൺ, നീൽ എ. റാൻസൻ, ഡാനിയൽ പി. കാനിഫ്, മാർക്ക് ജെ. ഡിക്ക്മാൻ, ഡ്യൂയി ഹോൾട്ടൻ, ക്രിസ്റ്റീൻ കിർമയർ, ആൻഡ്രൂ ഹിച്ച്കോക്ക്, സി. നീൽ ഹണ്ടർ
പ്രതിപ്രവർത്തന കേന്ദ്രത്തിലെ ലൈറ്റ് ട്രാപ്പ് 1 സമുച്ചയത്തിന്റെ ഉയർന്ന റെസല്യൂഷൻ ഘടന ക്വിനോൺ ചലനാത്മകതയെക്കുറിച്ച് പുതിയ ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകുന്നു.
©2021 അമേരിക്കൻ അസോസിയേഷൻ ഫോർ ദി അഡ്വാൻസ്‌മെൻ്റ് ഓഫ് സയൻസ്. എല്ലാ അവകാശങ്ങളും നിക്ഷിപ്തം. HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef, COUNTER എന്നിവയുടെ പങ്കാളിയാണ് AAAS. സയൻസ് അഡ്വാൻസസ് ISSN 2375-2548.