നിലവിൽ *നിലവിലെ വിലാസം: കൊളോൺ 50931, ജർമ്മനി, വാർദ്ധക്യവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട രോഗങ്ങളിലെ സെല്ലുലാർ സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണത്തെക്കുറിച്ചുള്ള കൊളോൺ എക്സലൻസ് ക്ലസ്റ്റർ ഗവേഷണം (CECAD).
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രോഗങ്ങളുടെ ന്യൂറോഡീജനറേഷൻ മാറ്റാനാവാത്തതായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു, കാരണം ന്യൂറോണുകളുടെ മെറ്റബോളിക് പ്ലാസ്റ്റിസിറ്റി പരിമിതമാണ്, എന്നാൽ ശരീരത്തിലെ ന്യൂറോണൽ മെറ്റബോളിസത്തിന്റെ കോശ സ്വയംഭരണത്തിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ സ്വാധീനം മോശമായി മനസ്സിലാക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. ഇവിടെ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്യൂഷൻ ഡൈനാമിക്സ് തടസ്സപ്പെടുത്തിയതിനാൽ ഉണ്ടാകുന്ന പുരോഗമന OXPHOS കുറവുള്ള പുർകിൻജെ ന്യൂറോണുകളുടെ സെൽ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രോട്ടീമിനെ ഞങ്ങൾ പരിചയപ്പെടുത്തുന്നു. പ്രോട്ടിയോമിക്സ് മേഖലയിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതത ഒരു ആഴത്തിലുള്ള മാറ്റത്തിന് കാരണമായതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, ഇത് ആത്യന്തികമായി കോശ മരണത്തിന് മുമ്പ് കൃത്യമായ മെറ്റബോളിക് പ്രോഗ്രാമുകളുടെ തുടർച്ചയായ സജീവമാക്കലിലേക്ക് നയിച്ചു. അപ്രതീക്ഷിതമായി, പൈറുവേറ്റ് കാർബോക്‌സിലേസിന്റെയും (PCx) TCA സൈക്കിളിന്റെ ഇന്റർമീഡിയറ്റുകളെ പൂരകമാക്കുന്ന മറ്റ് ആന്റി-ഏജിംഗ് എൻസൈമുകളുടെയും വ്യക്തമായ ഇൻഡക്ഷൻ ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു. PCx വർദ്ധിപ്പിക്കുന്ന ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് സ്ട്രെസും ന്യൂറോഡീജനറേഷനും തടയുന്നത്, OXPHOS ഇല്ലാത്ത ന്യൂറോണുകളിൽ രക്തപ്രവാഹത്തിന് ഒരു സംരക്ഷണ ഫലമുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. അവസാനമായി ഡീജനറേറ്റഡ് ന്യൂറോണുകളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സംയോജനത്തിന്റെ പുനഃസ്ഥാപനം ഈ ഉപാപചയ സവിശേഷതകളെ പൂർണ്ണമായും വിപരീതമാക്കുന്നു, അതുവഴി കോശ മരണം തടയുന്നു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയ്ക്ക് പ്രതിരോധശേഷി നൽകുന്ന മുമ്പ് അറിയപ്പെടാത്ത പാതകളെ ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ തിരിച്ചറിയുകയും രോഗത്തിന്റെ അവസാന ഘട്ടങ്ങളിൽ പോലും ന്യൂറോഡീജനറേഷൻ വിപരീതമാക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് കാണിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.
ന്യൂറോണൽ എനർജി മെറ്റബോളിസം നിലനിർത്തുന്നതിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ കേന്ദ്ര പങ്ക് മനുഷ്യ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രോഗങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട വിപുലമായ ന്യൂറോളജിക്കൽ ലക്ഷണങ്ങൾ ഊന്നിപ്പറയുന്നു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ (1, 2) അല്ലെങ്കിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡി‌എൻ‌എയുടെ (എം‌ടി‌ഡി‌എൻ‌എ) സ്ഥിരതയെ പരോക്ഷമായി ബാധിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീൻ നാശം എന്നിവയാണ് ഈ രോഗങ്ങളിൽ ഭൂരിഭാഗവും ഉണ്ടാകുന്നത് (3, 4). ചുറ്റുമുള്ള ടിഷ്യൂകളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയ്ക്കുള്ള പ്രതികരണമായി, യാഥാസ്ഥിതിക ഉപാപചയ പാതകൾ (5-7) സജീവമാക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് മൃഗ മാതൃകകളിലെ പ്രവർത്തനം തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, ഇത് ഈ സങ്കീർണ്ണ രോഗങ്ങളുടെ രോഗകാരിയെക്കുറിച്ച് ആഴത്തിൽ മനസ്സിലാക്കുന്നതിന് പ്രധാനപ്പെട്ട വിവരങ്ങൾ നൽകുന്നു. ഇതിനു വിപരീതമായി, തലച്ചോറിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ അഡിനോസിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് (എടിപി) ഉൽപാദനത്തിന്റെ പൊതുവായ പരാജയം മൂലമുണ്ടാകുന്ന നിർദ്ദിഷ്ട കോശ തരങ്ങളുടെ ഉപാപചയ മാറ്റങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള നമ്മുടെ ധാരണ അടിസ്ഥാനപരമാണ് (8), രോഗം തടയുന്നതിനോ തടയുന്നതിനോ ഉപയോഗിക്കാവുന്ന ചികിത്സാ ലക്ഷ്യങ്ങൾ തിരിച്ചറിയേണ്ടതിന്റെ ആവശ്യകത ഊന്നിപ്പറയുന്നു. ന്യൂറോഡീജനറേഷൻ തടയുക (9). ചുറ്റുമുള്ള ടിഷ്യൂകളുടെ കോശ തരങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ നാഡീകോശങ്ങൾക്ക് വളരെ പരിമിതമായ ഉപാപചയ വഴക്കം ഉണ്ടെന്ന് വ്യാപകമായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു എന്നതാണ് വിവരങ്ങളുടെ അഭാവം (10). സിനാപ്റ്റിക് ട്രാൻസ്മിഷൻ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിനും പരിക്ക്, രോഗാവസ്ഥകൾ എന്നിവയോട് പ്രതികരിക്കുന്നതിനും ന്യൂറോണുകളിലേക്കുള്ള മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ വിതരണം ഏകോപിപ്പിക്കുന്നതിൽ ഈ കോശങ്ങൾ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നതിനാൽ, മസ്തിഷ്ക കലകളുടെ വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞ അവസ്ഥകളുമായി കോശ മെറ്റബോളിസത്തെ പൊരുത്തപ്പെടുത്താനുള്ള കഴിവ് ഗ്ലിയൽ കോശങ്ങളിൽ മാത്രമായി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു (11-14). കൂടാതെ, മസ്തിഷ്ക കലകളുടെ അന്തർലീനമായ സെല്ലുലാർ വൈവിധ്യം പ്രത്യേക ന്യൂറോണൽ ഉപഗ്രൂപ്പുകളിൽ സംഭവിക്കുന്ന മെറ്റബോളിക് മാറ്റങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തെ വലിയതോതിൽ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു. തൽഫലമായി, ന്യൂറോണുകളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ കൃത്യമായ സെല്ലുലാർ, മെറ്റബോളിക് അനന്തരഫലങ്ങളെക്കുറിച്ച് വളരെക്കുറച്ചേ അറിയൂ.
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ ഉപാപചയ പ്രത്യാഘാതങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കുന്നതിനായി, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പുറം മെംബ്രൺ ഫ്യൂഷന്റെ (Mfn2) നാശം മൂലമുണ്ടാകുന്ന ന്യൂറോഡീജനറേഷന്റെ വിവിധ ഘട്ടങ്ങളിൽ ഞങ്ങൾ പുർകിൻജെ ന്യൂറോണുകളെ (PN-കൾ) വേർതിരിച്ചെടുത്തു. മനുഷ്യരിൽ Mfn2 മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ചാർകോട്ട്-മാരി-ടൂത്ത് തരം 2A (15) എന്നറിയപ്പെടുന്ന പാരമ്പര്യ മോട്ടോർ സെൻസറി ന്യൂറോപ്പതിയുടെ ഒരു രൂപവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെങ്കിലും, എലികളിൽ Mfn2-ന്റെ സോപാധിക നാശം ഓക്‌സിഡേഷൻ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ (OXPHOS) പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കലിന്റെ ഒരു അറിയപ്പെടുന്ന ഇൻഡക്ഷൻ രീതിയാണ്. വിവിധ ന്യൂറോണൽ ഉപവിഭാഗങ്ങളും (16-19) തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ന്യൂറോഡീജനറേറ്റീവ് ഫിനോടൈപ്പും ചലന വൈകല്യങ്ങൾ (18, 19) അല്ലെങ്കിൽ സെറിബെല്ലാർ അറ്റാക്സിയ (16) പോലുള്ള പുരോഗമന ന്യൂറോളജിക്കൽ ലക്ഷണങ്ങളോടൊപ്പമുണ്ട്. ലേബൽ-ഫ്രീ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് (LFQ) പ്രോട്ടിയോമിക്സ്, മെറ്റബോളോമിക്സ്, ഇമേജിംഗ്, വൈറോളജിക്കൽ രീതികൾ എന്നിവയുടെ സംയോജനം ഉപയോഗിക്കുന്നതിലൂടെ, പ്രോഗ്രസീവ് ന്യൂറോഡീജനറേഷൻ പൈറുവേറ്റ് കാർബോക്‌സിലേസ് (PCx) ഉം ഇൻ വിവോയിൽ PN-കളുടെ ആർട്ടീരിയോസ്‌ക്ലെറോസിസിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന മറ്റ് ഘടകങ്ങളും ശക്തമായി പ്രേരിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. എൻസൈമുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ. ഈ കണ്ടെത്തലിന്റെ പ്രസക്തി പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, Mfn2 കുറവുള്ള PN-കളിൽ PCx-ന്റെ പ്രകടനത്തെ ഞങ്ങൾ പ്രത്യേകമായി കുറച്ചു. ഈ പ്രവർത്തനം ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് സമ്മർദ്ദം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ന്യൂറോഡീജനറേഷൻ ത്വരിതപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്‌തു. അങ്ങനെ, അസോസ്‌പെർമിയ കോശ മരണത്തിന് ഉപാപചയ പൊരുത്തപ്പെടുത്തൽ നൽകുന്നുവെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടു. MFN2 ന്റെ ഗുരുതരമായ പ്രകടനത്തിന് കഠിനമായ OXPHOS കുറവ്, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡി‌എൻ‌എയുടെ വൻതോതിലുള്ള ഉപഭോഗം, പ്രത്യക്ഷത്തിൽ തകർന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്ക് എന്നിവയിലൂടെ ടെർമിനൽ ഡീജനറേഷൻ PN-നെ പൂർണ്ണമായും രക്ഷിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് കോശ മരണത്തിന് മുമ്പുള്ള രോഗത്തിന്റെ വിപുലമായ ഘട്ടത്തിൽ പോലും ഈ തരത്തിലുള്ള ന്യൂറോഡീജനറേഷൻ വീണ്ടെടുക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് കൂടുതൽ ഊന്നിപ്പറയുന്നു.
Mfn2 നോക്കൗട്ട് PN-കളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയെ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിന്, Cre-ആശ്രിത മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയെ മഞ്ഞ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ (YFP) (mtYFP) (20) ലക്ഷ്യമിടാൻ അനുവദിക്കുന്ന ഒരു മൗസ് സ്‌ട്രെയിൻ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. Cre എക്സ്പ്രഷൻ, ഇൻ വിവോയിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജി എന്നിവ പരിശോധിച്ചു. PN-കളിലെ Mfn2 ജീനിന്റെ നാശം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കിന്റെ ക്രമാനുഗതമായ വിഭജനത്തിലേക്ക് നയിക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം S1A), 3 ആഴ്ച പ്രായമാകുമ്പോൾ ആദ്യ മാറ്റം കണ്ടെത്തി. ഇതിനു വിപരീതമായി, കാൽബിൻഡിൻ ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റെയിനിംഗിന്റെ നഷ്ടം തെളിയിക്കുന്നതുപോലെ, PN സെൽ പാളിയുടെ ഗണ്യമായ ഡീജനറേഷൻ 12 ആഴ്ച പ്രായമാകുന്നതുവരെ ആരംഭിച്ചില്ല (ചിത്രം 1, A, B). മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജിയിലെ ആദ്യകാല മാറ്റങ്ങളും ന്യൂറോണൽ മരണത്തിന്റെ ദൃശ്യമായ ആരംഭവും തമ്മിലുള്ള സമയ പൊരുത്തക്കേട്, കോശ മരണത്തിന് മുമ്പ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതത മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഉപാപചയ മാറ്റങ്ങളെക്കുറിച്ച് അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു. YFP (YFP+)-എക്സ്പ്രസ്സിംഗ് PN (ചിത്രം 1C), കൺട്രോൾ എലികളിൽ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) എന്നിവയെ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഫ്ലൂറസെൻസ്-ആക്ടിവേറ്റഡ് സെൽ സോർട്ടിംഗ് (FACS) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള തന്ത്രം ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു, ഇനി മുതൽ CTRL (ചിത്രം S1B) എന്ന് വിളിക്കുന്നു. YFP സിഗ്നലിന്റെ ആപേക്ഷിക തീവ്രതയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഗേറ്റിംഗ് തന്ത്രത്തിന്റെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ, PN-കളുടെ YFP+ ബോഡി (YFPhigh) നോൺ-PN-കളിൽ (YFPneg) (ചിത്രം S1B) നിന്നോ പുട്ടേറ്റീവ് ഫ്ലൂറസെന്റ് ആക്സൺ/ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ഫ്രാഗ്മെന്റുകളിൽ (YFPlow; ചിത്രം S1D, ഇടത്) നിന്ന് ശുദ്ധീകരിക്കാൻ ഞങ്ങളെ അനുവദിക്കുന്നു, ഇത് കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം S1D, വലത്). ക്ലാസിഫൈഡ് പോപ്പുലേഷന്റെ ഐഡന്റിറ്റി പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, ഞങ്ങൾ LFQ പ്രോട്ടിയോമിക്സും തുടർന്ന് പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് വിശകലനവും നടത്തി, YFPhigh, YFPneg സെല്ലുകൾക്കിടയിൽ വ്യക്തമായ വേർതിരിവ് ഉണ്ടെന്ന് കണ്ടെത്തി (ചിത്രം S1C). YFPhigh സെല്ലുകൾ അറിയപ്പെടുന്ന PNs മാർക്കറുകളുടെ (അതായത് Calb1, Pcp2, Grid2, Itpr3) മൊത്തം സമ്പുഷ്ടീകരണം കാണിച്ചു (21, 22), എന്നാൽ ന്യൂറോണുകളിലോ മറ്റ് സെൽ തരങ്ങളിലോ സാധാരണയായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ സമ്പുഷ്ടീകരണം ഇല്ല (ചിത്രം 1D). സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ശേഖരിച്ച ക്ലാസിഫൈഡ് YFPhigh സെല്ലുകളിലെ സാമ്പിളുകൾ തമ്മിലുള്ള താരതമ്യം, ജൈവ പകർപ്പുകൾക്കിടയിൽ നല്ല പുനരുൽപാദനക്ഷമത പ്രകടമാക്കുന്ന ഒരു പരസ്പരബന്ധന ഗുണകം 0.9 കാണിച്ചു (ചിത്രം S1E). ചുരുക്കത്തിൽ, സാധ്യമായ PN ന്റെ നിശിതവും നിർദ്ദിഷ്ടവുമായ ഒറ്റപ്പെടലിനുള്ള ഞങ്ങളുടെ പദ്ധതിയെ ഈ ഡാറ്റ സാധൂകരിച്ചു. ഉപയോഗിച്ച L7-cre ഡ്രൈവർ സിസ്റ്റം ഡെലിവറിക്ക് ശേഷമുള്ള ആദ്യ ആഴ്ചയിൽ മൊസൈക് പുനഃസംയോജനത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിനാൽ (23), ഞങ്ങൾ CTRL-ൽ നിന്നും കണ്ടീഷണലിൽ നിന്നും എലികളെ ഇല്ലാതാക്കാൻ തുടങ്ങി (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ന്യൂറോണുകൾ ശേഖരിക്കുക. പുനഃസംയോജനം പൂർത്തിയായ ശേഷം, 4 ആഴ്ച പ്രായമാകുമ്പോൾ അതിനെ Mfn2cKO എന്ന് വിളിക്കുന്നു. അവസാന പോയിന്റായി, വ്യക്തമായ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വിഘടനം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും പി‌എൻ പാളി കേടുകൂടാതെയിരിക്കുമ്പോൾ 8 ആഴ്ച പ്രായം ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു (ചിത്രം 1B, ചിത്രം S1A). മൊത്തത്തിൽ, ഞങ്ങൾ ആകെ 3013 പ്രോട്ടീനുകൾ കണക്കാക്കി, അതിൽ ഏകദേശം 22% മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രോട്ടിയോമിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള മൈറ്റോകാർട്ട 2.0 അനോട്ടേഷനുകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് (ചിത്രം 1E) (ചിത്രം 1E) (24). 8-ാം ആഴ്ചയിൽ നടത്തിയ ഡിഫറൻഷ്യൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം, എല്ലാ പ്രോട്ടീനുകളിലും 10.5% മാത്രമേ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങളുണ്ടാക്കിയിട്ടുള്ളൂ എന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം 1F, ചിത്രം S1F), ഇതിൽ 195 പ്രോട്ടീനുകൾ ഡൗൺ-റെഗുലേറ്റഡ് ആയിരുന്നു, 120 പ്രോട്ടീനുകൾ അപ്-റെഗുലേറ്റഡ് ആയിരുന്നു (ചിത്രം 1F). ഈ ഡാറ്റാ സെറ്റിന്റെ "നൂതന പാത വിശകലനം" കാണിക്കുന്നത് വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിച്ച ജീനുകൾ പ്രധാനമായും നിർദ്ദിഷ്ട മെറ്റബോളിക് പാതകളുടെ ഒരു പരിമിത സെറ്റിലാണ് (ചിത്രം 1G). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, OXPHOS, കാൽസ്യം സിഗ്നലിംഗ് എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പാതകളുടെ നിയന്ത്രണം കുറയ്ക്കുന്നത് ഫ്യൂഷൻ-കുറവുള്ള PN-കളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ പ്രേരണയെ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, പ്രധാനമായും അമിനോ ആസിഡ് മെറ്റബോളിസം ഉൾപ്പെടുന്ന മറ്റ് വിഭാഗങ്ങൾ ഗണ്യമായി ഉയർന്ന നിലയിലാണ്, ഇത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ PN-കളിൽ സംഭവിക്കുന്ന മെറ്റബോളിസവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. റിവയറിങ് സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്. പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കൽ.
(എ) CTRL, Mfn2cKO എലികളുടെ സെറിബെല്ലാർ വിഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധി കോൺഫോക്കൽ ഫോട്ടോഗ്രാഫുകൾ, PN-കളുടെ (കാൽബിൻഡിൻ, ഗ്രേ) പുരോഗമനപരമായ നഷ്ടം കാണിക്കുന്നു; ന്യൂക്ലിയസ്സുകൾ DAPI ഉപയോഗിച്ച് എതിർസ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. (ബി) (എ) യുടെ അളവ് (വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം, ***P<0.001; n = മൂന്ന് എലികളിൽ നിന്നുള്ള 4 മുതൽ 6 വരെ സർക്കിളുകൾ). (സി) പരീക്ഷണാത്മക വർക്ക്ഫ്ലോ. (ഡി) പുർക്കിൻജെ (മുകളിൽ) മറ്റ് സെൽ തരങ്ങൾക്കും (മധ്യത്തിൽ) പ്രത്യേക മാർക്കറുകളുടെ ഹീറ്റ് മാപ്പ് വിതരണം. (ഇ) ക്ലാസിഫൈഡ് PN-ൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ എണ്ണം കാണിക്കുന്ന വെൻ ഡയഗ്രം. (എഫ്) 8 ആഴ്ചയിൽ Mfn2cKO ന്യൂറോണുകളിൽ വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ട് (1.3 ന്റെ പ്രാധാന്യ കട്ട്-ഓഫ് മൂല്യം). (ജി) 8 ആഴ്ചകളായി തരംതിരിച്ചിരിക്കുന്ന Mfn2cKO PN-ലെ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട അഞ്ച് അപ്-റെഗുലേഷൻ (ചുവപ്പ്) ഡൗൺ-റെഗുലേഷൻ (നീല) പാതകളെ സർഗ്ഗാത്മകത പാത വിശകലനം കാണിക്കുന്നു. കണ്ടെത്തിയ ഓരോ പ്രോട്ടീനിന്റെയും ശരാശരി എക്സ്പ്രഷൻ ലെവൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ഗ്രേസ്കെയിൽ ഹീറ്റ് മാപ്പ്: ക്രമീകരിച്ച P മൂല്യം. ns, പ്രധാനമല്ല.
പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നത് I, III, IV എന്നീ സമുച്ചയങ്ങളുടെ പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ക്രമേണ കുറഞ്ഞു എന്നാണ്. I, III, IV എന്നീ സമുച്ചയങ്ങളിലെല്ലാം അവശ്യ mtDNA-എൻകോഡ് ചെയ്ത ഉപയൂണിറ്റുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, അതേസമയം ന്യൂക്ലിയർ-കോഡ് ചെയ്ത കോംപ്ലക്സ് II അടിസ്ഥാനപരമായി ബാധിക്കപ്പെട്ടില്ല (ചിത്രം 2A, ചിത്രം S2A). . പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഫലങ്ങൾക്ക് അനുസൃതമായി, സെറിബെല്ലാർ ടിഷ്യു വിഭാഗങ്ങളുടെ ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി, PN-ലെ കോംപ്ലക്സ് IV-ന്റെ MTCO1 (മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ സൈറ്റോക്രോം സി ഓക്സിഡേസ് സബ്യൂണിറ്റ് 1) സബ്യൂണിറ്റ് ലെവൽ ക്രമേണ കുറഞ്ഞുവെന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം 2B). mtDNA-എൻകോഡ് ചെയ്ത സബ്യൂണിറ്റ് Mtatp8 ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു (ചിത്രം S2A), അതേസമയം ന്യൂക്ലിയർ-എൻകോഡ് ചെയ്ത ATP സിന്തേസ് സബ്യൂണിറ്റിന്റെ സ്റ്റേഡി-സ്റ്റേറ്റ് ലെവൽ മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു, ഇത് mtDNA എക്സ്പ്രഷൻ സ്ഥിരതയുള്ളപ്പോൾ അറിയപ്പെടുന്ന സ്റ്റേബിൾ ATP സിന്തേസ് സബ്അസംബ്ലി F1 കോംപ്ലക്സുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. രൂപീകരണം സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്. ഇന്ററപ്റ്റ് (7). റിയൽ-ടൈം പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (qPCR) ഉപയോഗിച്ച് തരംതിരിച്ച Mfn2cKO PN-കളിലെ mtDNA ലെവലിന്റെ വിലയിരുത്തൽ mtDNA കോപ്പി നമ്പറിൽ ക്രമാനുഗതമായ കുറവ് സ്ഥിരീകരിച്ചു. കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, 8 ആഴ്ച പ്രായമാകുമ്പോൾ, mtDNA ലെവലിന്റെ ഏകദേശം 20% മാത്രമേ നിലനിർത്താൻ കഴിഞ്ഞുള്ളൂ (ചിത്രം 2C). ഈ ഫലങ്ങൾക്ക് അനുസൃതമായി, Mfn2cKO PN-കളുടെ കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി സ്റ്റെയിനിംഗ് DNA കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഉപയോഗിച്ചു, ഇത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുടെ സമയ-ആശ്രിത ഉപഭോഗം കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 2D). മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രോട്ടീൻ ഡീഗ്രഡേഷനിലും സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണത്തിലും ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ചില സ്ഥാനാർത്ഥികൾ മാത്രമേ അപ്-റെഗുലേറ്റഡ് ചെയ്തിട്ടുള്ളൂ എന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, അതിൽ Lonp1, Afg3l2, Clpx, OXPHOS കോംപ്ലക്സ് അസംബ്ലി ഘടകങ്ങൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. അപ്പോപ്‌ടോസിസിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ അളവിൽ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങളൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല (ചിത്രം S2B). അതുപോലെ, കാൽസ്യം ഗതാഗതത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ, എൻഡോപ്ലാസ്മിക് റെറ്റിക്യുലം ചാനലുകൾക്ക് ചെറിയ മാറ്റങ്ങൾ മാത്രമേ ഉള്ളൂ എന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം S2C). കൂടാതെ, ഓട്ടോഫാഗിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളുടെ വിലയിരുത്തലിൽ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങളൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല, ഇത് ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രിയും ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പിയും വഴി ഇൻ വിവോയിൽ നിരീക്ഷിച്ച ഓട്ടോഫാഗോസോമുകളുടെ ദൃശ്യമായ ഇൻഡക്ഷനുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം S3). എന്നിരുന്നാലും, PN-കളിലെ പുരോഗമനപരമായ OXPHOS പ്രവർത്തനരഹിതതയ്‌ക്കൊപ്പം വ്യക്തമായ അൾട്രാസ്ട്രക്ചറൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മാറ്റങ്ങളും ഉണ്ട്. 5 ഉം 8 ഉം ആഴ്ച പ്രായമുള്ള Mfn2cKO PN-കളുടെ സെൽ ബോഡികളിലും ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ട്രീകളിലും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ക്ലസ്റ്ററുകൾ കാണാൻ കഴിയും, കൂടാതെ ആന്തരിക മെംബ്രൺ ഘടനയിൽ ആഴത്തിലുള്ള മാറ്റങ്ങൾക്ക് വിധേയമായിട്ടുണ്ട് (ചിത്രം S4, A, B). ഈ അൾട്രാസ്ട്രക്ചറൽ മാറ്റങ്ങളും mtDNA-യിലെ ഗണ്യമായ കുറവും അനുസരിച്ച്, ടെട്രാമെഥൈൽറോഡാമൈൻ മീഥൈൽ എസ്റ്ററുമായി (TMRM) അക്യൂട്ട് സെറിബ്രൽ സെറിബെല്ലാർ സ്ലൈസുകളുടെ വിശകലനം Mfn2cKO PN-കളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെംബ്രൻ പൊട്ടൻഷ്യൽ ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞുവെന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം S4C).
(എ) OXPHOS സമുച്ചയത്തിന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലിന്റെ ടൈം കോഴ്‌സ് വിശകലനം. 8 ആഴ്ചയിൽ P<0.05 ഉള്ള പ്രോട്ടീനുകൾ മാത്രം പരിഗണിക്കുക (ടു-വേ ANOVA). ഡോട്ടഡ് ലൈൻ: CTRL നെ അപേക്ഷിച്ച് ക്രമീകരണമില്ല. (ബി) ഇടത്: ആന്റി-MTCO1 ആന്റിബോഡി (സ്കെയിൽ ബാർ, 20 μm) ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തിട്ടുള്ള ഒരു സെറിബെല്ലാർ വിഭാഗത്തിന്റെ ഒരു ഉദാഹരണം. പുർക്കിൻജെ സെൽ ബോഡികൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്ന പ്രദേശം മഞ്ഞ നിറത്തിൽ മൂടിയിരിക്കുന്നു. വലത്: MTCO1 ലെവലുകളുടെ അളവ് (വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം; മൂന്ന് എലികളിൽ നിന്ന് വിശകലനം ചെയ്ത n = 7 മുതൽ 20 വരെ സെല്ലുകൾ). (സി) അടുക്കിയ PN ലെ mtDNA കോപ്പി നമ്പറിന്റെ qPCR വിശകലനം (വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം; n = 3 മുതൽ 7 വരെ എലികൾ). (ഡി) ഇടത്: ആന്റി-DNA ആന്റിബോഡി (സ്കെയിൽ ബാർ, 20 μm) ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തിട്ടുള്ള ഒരു സെറിബെല്ലാർ സ്ലൈസിന്റെ ഒരു ഉദാഹരണം. പുർക്കിൻജെ സെൽ ബോഡികൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്ന പ്രദേശം മഞ്ഞ നിറത്തിൽ മൂടിയിരിക്കുന്നു. വലത്: mtDNA നിഖേദങ്ങളുടെ അളവ് (വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം; മൂന്ന് എലികളിൽ നിന്നുള്ള n = 5 മുതൽ 9 വരെ കോശങ്ങൾ). (E) ഒരു ഹോൾ-സെൽ പാച്ച് ക്ലാമ്പ് റെക്കോർഡിംഗിൽ mitoYFP + Purkinje സെല്ലുകൾ (അമ്പടയാളം) കാണിക്കുന്ന ഒരു അക്യൂട്ട് സെറിബെല്ലാർ വിഭാഗത്തിന്റെ ഉദാഹരണം. (F) IV വക്രത്തിന്റെ അളവ്. (G) CTRL, Mfn2cKO Purkinje സെല്ലുകളിൽ ഡിപോളറൈസിംഗ് കറന്റ് ഇഞ്ചക്ഷന്റെ പ്രതിനിധി റെക്കോർഡിംഗുകൾ. ടോപ്പ് ട്രെയ്‌സ്: AP ട്രിഗർ ചെയ്‌ത ആദ്യ പൾസ്. താഴെയുള്ള ട്രെയ്‌സ്: പരമാവധി AP ഫ്രീക്വൻസി. (H) പോസ്റ്റ്‌സിനാപ്റ്റിക് സ്വയമേവയുള്ള ഇൻപുട്ടുകളുടെ (sPSP-കൾ) അളവ്. പ്രതിനിധി റെക്കോർഡിംഗ് ട്രെയ്‌സും അതിന്റെ സൂം അനുപാതവും (I)-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. മൂന്ന് എലികളിൽ നിന്നുള്ള n = 5 മുതൽ 20 വരെ സെല്ലുകൾ വിശകലനം ചെയ്ത വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം. ഡാറ്റ ശരാശരി ± SEM ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) സുഷിരങ്ങളുള്ള പാച്ച് ക്ലാമ്പ് മോഡ് ഉപയോഗിച്ച് രേഖപ്പെടുത്തിയ സ്വയമേവയുള്ള AP യുടെ പ്രതിനിധി ട്രെയ്‌സുകൾ. മുകളിലെ ട്രെയ്‌സ്: പരമാവധി AP ഫ്രീക്വൻസി. താഴെയുള്ള ട്രെയ്‌സ്: ഒരൊറ്റ AP യുടെ സൂം. (K) (J) അനുസരിച്ച് ശരാശരിയും പരമാവധി AP ഫ്രീക്വൻസിയും അളക്കുക. മാൻ-വിറ്റ്നി ടെസ്റ്റ്; നാല് എലികളിൽ നിന്ന് n = 5 സെല്ലുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു. ഡാറ്റ ശരാശരി ± SEM ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു; പ്രധാനമല്ല.
8 ആഴ്ച പ്രായമുള്ള Mfn2cKO PN-ൽ OXPHOS കേടുപാടുകൾ വ്യക്തമായി കണ്ടെത്തി, ഇത് ന്യൂറോണുകളുടെ ശാരീരിക പ്രവർത്തനം വളരെ അസാധാരണമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. അതിനാൽ, 4 മുതൽ 5 ആഴ്ച വരെയും 7 മുതൽ 8 ആഴ്ച വരെയും അക്യൂട്ട് സെറിബെല്ലാർ സ്ലൈസുകളിൽ ഹോൾ-സെൽ പാച്ച് ക്ലാമ്പ് റെക്കോർഡിംഗുകൾ നടത്തി OXPHOS- കുറവുള്ള ന്യൂറോണുകളുടെ നിഷ്ക്രിയ വൈദ്യുത സവിശേഷതകൾ ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു (ചിത്രം 2E). അപ്രതീക്ഷിതമായി, Mfn2cKO ന്യൂറോണുകളുടെ ശരാശരി വിശ്രമ മെംബ്രൻ പൊട്ടൻഷ്യലും ഇൻപുട്ട് റെസിസ്റ്റൻസും നിയന്ത്രണത്തിന് സമാനമായിരുന്നു, എന്നിരുന്നാലും കോശങ്ങൾക്കിടയിൽ സൂക്ഷ്മമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ ഉണ്ടായിരുന്നു (പട്ടിക 1). അതുപോലെ, 4 മുതൽ 5 ആഴ്ച വരെ പ്രായമുള്ളപ്പോൾ, കറന്റ്-വോൾട്ടേജ് ബന്ധത്തിൽ (IV കർവ്) കാര്യമായ മാറ്റങ്ങളൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല (ചിത്രം 2F). എന്നിരുന്നാലും, 7 മുതൽ 8 ആഴ്ച വരെ പ്രായമുള്ള Mfn2cKO ന്യൂറോണുകളൊന്നും IV റെജിമിനെ (ഹൈപ്പർപോളറൈസേഷൻ സ്റ്റെപ്പ്) അതിജീവിച്ചു, ഇത് ഈ അവസാന ഘട്ടത്തിൽ ഹൈപ്പർപോളറൈസേഷൻ പൊട്ടൻഷ്യലിനോട് വ്യക്തമായ സംവേദനക്ഷമതയുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഇതിനു വിപരീതമായി, Mfn2cKO ന്യൂറോണുകളിൽ, ആവർത്തിച്ചുള്ള പ്രവർത്തന സാധ്യത (AP) ഡിസ്ചാർജുകൾക്ക് കാരണമാകുന്ന ഡിപോളറൈസിംഗ് വൈദ്യുതധാരകൾ നന്നായി സഹിക്കുന്നു, ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് അവയുടെ മൊത്തത്തിലുള്ള ഡിസ്ചാർജ് പാറ്റേണുകൾ 8 ആഴ്ച പഴക്കമുള്ള നിയന്ത്രണ ന്യൂറോണുകളിൽ നിന്ന് കാര്യമായി വ്യത്യസ്തമല്ല എന്നാണ് (പട്ടിക 1, ചിത്രം 2G). അതുപോലെ, സ്വയമേവയുള്ള പോസ്റ്റ്‌സിനാപ്റ്റിക് വൈദ്യുതധാരകളുടെ (sPSCs) ആവൃത്തിയും വ്യാപ്തിയും നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പിന്റേതിന് താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്നതായിരുന്നു, കൂടാതെ സംഭവങ്ങളുടെ ആവൃത്തി 4 ആഴ്ചയിൽ നിന്ന് 5 ആഴ്ചയായി 7 ആഴ്ചയായി 8 ആഴ്ചയായി വർദ്ധിച്ചു, സമാനമായ വർദ്ധനവോടെ (ചിത്രം 2, H, I). PN-കളിലെ സിനാപ്റ്റിക് പക്വതയുടെ കാലയളവ് (25). സുഷിരങ്ങളുള്ള PNs പാച്ചുകൾക്ക് ശേഷം സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു. മുഴുവൻ സെൽ പാച്ച് ക്ലാമ്പ് റെക്കോർഡിംഗിൽ സംഭവിക്കാവുന്നതുപോലെ, സെല്ലുലാർ ATP വൈകല്യങ്ങളുടെ സാധ്യമായ നഷ്ടപരിഹാരം ഈ കോൺഫിഗറേഷൻ തടയുന്നു. പ്രത്യേകിച്ച്, Mfn2cKO ന്യൂറോണുകളുടെ റെസ്റ്റിംഗ് മെംബ്രൻ പൊട്ടൻഷ്യലും സ്വയമേവയുള്ള ഫയറിംഗ് ഫ്രീക്വൻസിയും ബാധിച്ചിട്ടില്ല (ചിത്രം 2, J, K). ചുരുക്കത്തിൽ, വ്യക്തമായ OXPHOS പ്രവർത്തനരഹിതമായ PN-കൾക്ക് ഉയർന്ന ഫ്രീക്വൻസി ഡിസ്ചാർജ് പാറ്റേണുകളെ നന്നായി നേരിടാൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് സാധാരണ ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രതികരണങ്ങൾ നിലനിർത്താൻ അനുവദിക്കുന്ന ഒരു നഷ്ടപരിഹാര സംവിധാനം ഉണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഡാറ്റ ശരാശരി ± SEM ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു (വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം, ഹോം-സിഡാക്കിന്റെ മൾട്ടിപ്പിൾ താരതമ്യ പരിശോധന; *P<0.05). യൂണിറ്റ് നമ്പർ ബ്രാക്കറ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.
പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റാസെറ്റിലെ (ചിത്രം 1G) ഏതെങ്കിലും വിഭാഗത്തിൽ ഗുരുതരമായ OXPHOS കുറവിനെ ചെറുക്കാൻ കഴിയുന്ന പാതകൾ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടോ എന്ന് അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങൾ തീരുമാനിച്ചു, അതുവഴി ബാധിതമായ PN ന് സാധാരണ ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജി നിലനിർത്താൻ കഴിയുന്നത് എന്തുകൊണ്ടെന്ന് വിശദീകരിക്കുന്നു (ചിത്രം 2, E മുതൽ K വരെ). . ബ്രാഞ്ചഡ് ചെയിൻ അമിനോ ആസിഡുകളുടെ (BCAA) കാറ്റബോളിസത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന എൻസൈമുകൾ ഗണ്യമായി ഉയർന്നതായി പ്രോട്ടിയോമിക്സ് വിശകലനം കാണിച്ചു (ചിത്രം 3A, ചിത്രം S5A), അന്തിമ ഉൽപ്പന്നമായ അസറ്റൈൽ-CoA (CoA) അല്ലെങ്കിൽ സുക്സിനൈൽ CoA എന്നിവയ്ക്ക് ആർട്ടീരിയോസ്ക്ലെറോസിസ് ആസിഡ് (TCA) സൈക്കിളിലെ ട്രൈകാർബോക്സിലേറ്റുകളെ സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയും. BCAA ട്രാൻസാമിനേസ് 1 (BCAT1), BCAT2 എന്നിവയുടെ ഉള്ളടക്കം വർദ്ധിച്ചതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. α-കെറ്റോഗ്ലുട്ടറേറ്റിൽ നിന്ന് ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റ് ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് അവ BCAA കാറ്റബോളിസത്തിന്റെ ആദ്യ ഘട്ടത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു (26). ബ്രാഞ്ചഡ് ചെയിൻ കീറ്റോ ആസിഡ് ഡീഹൈഡ്രജനേസ് (BCKD) സമുച്ചയത്തിലെ എല്ലാ ഉപയൂണിറ്റുകളും അപ്-റെഗുലേറ്റഡ് ആണ് (ഫലമായുണ്ടാകുന്ന BCAA കാർബൺ അസ്ഥികൂടത്തിന്റെ തുടർന്നുള്ളതും മാറ്റാനാവാത്തതുമായ ഡീകാർബോക്സിലേഷനെ കോംപ്ലക്സ് ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു) (ചിത്രം 3A, ചിത്രം S5A). എന്നിരുന്നാലും, തരംതിരിച്ച PN-ൽ BCAA-യിൽ തന്നെ വ്യക്തമായ മാറ്റങ്ങളൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല, ഇത് ഈ അവശ്യ അമിനോ ആസിഡുകളുടെ വർദ്ധിച്ച സെല്ലുലാർ ആഗിരണം അല്ലെങ്കിൽ TCA ചക്രത്തിന് അനുബന്ധമായി മറ്റ് സ്രോതസ്സുകളുടെ (ഗ്ലൂക്കോസ് അല്ലെങ്കിൽ ലാക്റ്റിക് ആസിഡ്) ഉപയോഗം മൂലമാകാം (ചിത്രം S5B). OXPHOS ഇല്ലാത്ത PN-കൾ 8 ആഴ്ച പ്രായമാകുമ്പോൾ വർദ്ധിച്ച ഗ്ലൂട്ടാമൈൻ വിഘടനവും ട്രാൻസ്മിനേഷൻ പ്രവർത്തനങ്ങളും കാണിച്ചു, ഇത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ എൻസൈമുകളായ ഗ്ലൂട്ടാമൈനേസ് (GLS), ഗ്ലൂട്ടാമൈൻ പൈറുവേറ്റ് ട്രാൻസ്മിനേസ് 2 (GPT2) എന്നിവയുടെ അപ്-റെഗുലേഷൻ വഴി പ്രതിഫലിപ്പിക്കാൻ കഴിയും (ചിത്രം 3, A, C). GLS ന്റെ അപ്-റെഗുലേഷൻ സ്പ്ലൈസ്ഡ് ഐസോഫോം ഗ്ലൂട്ടമിനേസ് C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL ന്റെ മാറ്റം ഏകദേശം 4.5 മടങ്ങ്, P = 0.05) ലേക്ക് പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, കൂടാതെ കാൻസർ ടിഷ്യൂകളിലെ അതിന്റെ നിർദ്ദിഷ്ട അപ്-റെഗുലേഷനും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോഎനർജിയെ പിന്തുണയ്ക്കാൻ കഴിയും. (27).
(എ) 8 ആഴ്ചകളിൽ നിർദ്ദിഷ്ട റൂട്ടിലെ പ്രോട്ടീൻ ലെവലിലെ മടക്ക മാറ്റം ഹീറ്റ് മാപ്പ് കാണിക്കുന്നു. (ബി) ആന്റി-പിസിഎക്സ് ആന്റിബോഡി (സ്കെയിൽ ബാർ, 20 μm) ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്ത ഒരു സെറിബെല്ലാർ സ്ലൈസിന്റെ ഉദാഹരണം. മഞ്ഞ അമ്പടയാളം പുർക്കിൻജെ സെൽ ബോഡിയിലേക്ക് വിരൽ ചൂണ്ടുന്നു. (സി) രക്തപ്രവാഹത്തിന് ഒരു പ്രധാന സ്ഥാനാർത്ഥിയായി തിരിച്ചറിഞ്ഞ ടൈം കോഴ്‌സ് പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം (മൾട്ടിപ്പിൾ ടി-ടെസ്റ്റ്, *FDR <5%; n = 3-5 എലികൾ). (ഡി) മുകളിൽ: [1-13C]പൈറുവേറ്റ് ട്രേസറിൽ (അതായത്, PDH അല്ലെങ്കിൽ ട്രാൻസ്-ആർട്ടീരിയൽ റൂട്ട് വഴി) അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ലേബൽ ചെയ്ത കാർബണിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്നതിനുള്ള വ്യത്യസ്ത വഴികൾ കാണിക്കുന്ന ഒരു സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം. താഴെ: [1-13C]പൈറുവേറ്റ് (ജോടിയാക്കിയ ടി-ടെസ്റ്റ്; ** P <0.01) ഉപയോഗിച്ച് അക്യൂട്ട് സെറിബെല്ലാർ സ്ലൈസുകൾ ലേബൽ ചെയ്ത ശേഷം അസ്പാർട്ടിക് ആസിഡ്, സിട്രിക് ആസിഡ്, മാലിക് ആസിഡ് എന്നിവയായി പരിവർത്തനം ചെയ്ത സിംഗിൾ-ലേബൽ ചെയ്ത കാർബൺ (M1) ന്റെ ശതമാനം വയലിൻ ചാർട്ട് കാണിക്കുന്നു. (ഇ) സൂചിപ്പിച്ച പാതയുടെ സമഗ്ര സമയ ചരിത്ര വിശകലനം. 8 ആഴ്ചയിൽ P<0.05 ഉള്ള പ്രോട്ടീനുകൾ മാത്രം പരിഗണിക്കുക​​. ഡാഷ് ചെയ്ത ലൈൻ: ക്രമീകരണ മൂല്യമില്ല (വേരിയൻസിന്റെ ടു-വേ വിശകലനം; * P <0.05; *** P <0.001). ഡാറ്റ ശരാശരി ± SEM ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.
ഞങ്ങളുടെ വിശകലനത്തിൽ, BCAA കാറ്റബോളിസം പ്രധാന അപ്-റെഗുലേഷൻ പാതകളിൽ ഒന്നായി മാറിയിരിക്കുന്നു. OXPHOS ഇല്ലാത്ത PN-ൽ TCA സൈക്കിളിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്ന വെന്റിലേഷൻ വോളിയം മാറിയേക്കാമെന്ന് ഈ വസ്തുത ശക്തമായി സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഇത് ന്യൂറോണൽ മെറ്റബോളിക് റിവൈറിംഗിന്റെ ഒരു പ്രധാന രൂപത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കാം, ഇത് ഗുരുതരമായ OXPHOS പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ പരിപാലന സമയത്ത് ന്യൂറോണൽ ഫിസിയോളജിയിലും അതിജീവനത്തിലും നേരിട്ട് സ്വാധീനം ചെലുത്തിയേക്കാം. ഈ സിദ്ധാന്തത്തിന് അനുസൃതമായി, പ്രധാന ആന്റി-അഥെറോസ്ക്ലെറോട്ടിക് എൻസൈം PCx അപ്-റെഗുലേറ്റഡ് ആണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (Mfn2cKO/CTRL ഏകദേശം 1.5 തവണ മാറുന്നു; ചിത്രം 3A), ഇത് പൈറുവേറ്റിനെ ഓക്സലോഅസെറ്റേറ്റിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്യുന്നതിനെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു (28), ഇത് മസ്തിഷ്ക കലകളിലാണെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു. ലെ എക്സ്പ്രഷൻ ആസ്ട്രോസൈറ്റുകളിൽ മാത്രമായി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു (29, 30). പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഫലങ്ങൾക്ക് അനുസൃതമായി, OXPHOS-കുറവുള്ള PN-കളിൽ PCx എക്സ്പ്രഷൻ പ്രത്യേകമായും ഗണ്യമായും വർദ്ധിച്ചതായി കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി കാണിച്ചു, അതേസമയം PCx പ്രതിപ്രവർത്തനം പ്രധാനമായും നിയന്ത്രണത്തിന്റെ തൊട്ടടുത്തുള്ള ബെർഗ്മാൻ ഗ്ലിയൽ സെല്ലുകളിലേക്ക് പരിമിതപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 3B). PCx-ന്റെ നിരീക്ഷിച്ച അപ്‌റെഗുലേഷൻ പ്രവർത്തനപരമായി പരിശോധിക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ അക്യൂട്ട് സെറിബെല്ലാർ സ്ലൈസുകളെ [1-13C] പൈറുവേറ്റ് ട്രേസർ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു. പൈറുവേറ്റ് ഡീഹൈഡ്രജനേസ് (PDH) ഉപയോഗിച്ച് പൈറുവേറ്റ് ഓക്സിഡൈസ് ചെയ്തപ്പോൾ, അതിന്റെ ഐസോടോപ്പ് ലേബൽ അപ്രത്യക്ഷമായി, പക്ഷേ വാസ്കുലർ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങൾ വഴി പൈറുവേറ്റ് മെറ്റബോളിസീകരിക്കപ്പെടുമ്പോൾ TCA സൈക്കിൾ ഇന്റർമീഡിയറ്റുകളിൽ ഇത് ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട് (ചിത്രം 3D). ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റയെ പിന്തുണച്ച്, Mfn2cKO സ്ലൈസുകളുടെ അസ്പാർട്ടിക് ആസിഡിൽ ഈ ട്രേസറിൽ നിന്നുള്ള ധാരാളം മാർക്കറുകൾ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, അതേസമയം സിട്രിക് ആസിഡും മാലിക് ആസിഡും മിതമായ പ്രവണത കാണിച്ചു, എന്നിരുന്നാലും കാര്യമായതല്ല (ചിത്രം 3D).
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ എ ജീനിനെ (Tfam) പ്രത്യേകമായി നശിപ്പിക്കുന്ന ഡോപാമൈൻ ന്യൂറോണുകൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതമായ മൈറ്റോപാർക്ക് എലികളുടെ ഡോപാമൈൻ ന്യൂറോണുകളിൽ (ചിത്രം S6B), PCx എക്സ്പ്രഷനും ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (31), ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് അസെറ്റോൺ ആസിഡ് ആർട്ടീരിയോസ്ക്ലെറോസിസ് ശരീരത്തിലെ ന്യൂറോണൽ OXPHOS ന്റെ പ്രവർത്തനരഹിതമായ സമയത്ത് രോഗത്തിന്റെ സംഭവം നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു എന്നാണ്. ആർട്ടീരിയോസ്ക്ലെറോസിസ് ബാധിച്ചേക്കാവുന്ന ന്യൂറോണുകളിൽ പ്രകടിപ്പിക്കാവുന്ന അതുല്യമായ എൻസൈമുകൾ (32-34) OXPHOS ഇല്ലാത്ത PN-കളിൽ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു, ഉദാഹരണത്തിന് പ്രൊപിയോണൈൽ-CoA കാർബോക്സിലേസ് (PCC-A), മാലോണൈൽ-CoA പ്രൊപിയോണൈൽ-CoA യെ സുക്സിനൈൽ-CoA ആക്കി മാറ്റുന്നു, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മാലിക് എൻസൈം 3 (ME3), ഇതിന്റെ പ്രധാന പങ്ക് മാലേറ്റിൽ നിന്ന് പൈറുവേറ്റ് വീണ്ടെടുക്കുക എന്നതാണ് (ചിത്രം 3, A, C) (33, 35). കൂടാതെ, ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യുകയും അതുവഴി PDH നിർജ്ജീവമാക്കുകയും ചെയ്യുന്ന Pdk3 എൻസൈമിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവ് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (36), അതേസമയം PDH-നെയോ PDH എൻസൈം കോംപ്ലക്സിനെയോ സജീവമാക്കുന്ന Pdp1 എൻസൈമിൽ മാറ്റങ്ങളൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല (ചിത്രം 3A). സ്ഥിരമായി, Mern2cKO PN-കളിൽ, Ser293-ലെ PDH കോംപ്ലക്‌സിലെ പൈറുവേറ്റ് ഡീഹൈഡ്രജനേസ് E1 ഘടകത്തിന്റെ α1 സബ്യൂണിറ്റ് α (PDHE1α) സബ്യൂണിറ്റിന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ (PDH-ന്റെ എൻസൈം പ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്നു) മെച്ചപ്പെടുത്തി (ചിത്രം S6C) (ചിത്രം S6C). പൈറുവേറ്റിന് വാസ്കുലർ ആക്‌സസ് ഇല്ല.
ഒടുവിൽ, സെറീൻ, ഗ്ലൈസിൻ ബയോസിന്തസിസ് എന്നിവയുടെ സൂപ്പർ പാത്ത്‌വേ, അനുബന്ധ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫോളേറ്റ് (1C) സൈക്കിൾ, പ്രോലൈൻ ബയോസിന്തസിസ് (ചിത്രം 1G, ചിത്രം S5C) എന്നിവയെല്ലാം സജീവമാക്കൽ പ്രക്രിയയിൽ ഗണ്യമായി മുകളിലേക്ക് നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. ചുറ്റുമുള്ള കലകൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയോടെ സജീവമാകുന്നു (5-7). ഈ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റയെ പിന്തുണയ്ക്കുന്ന കോൺഫോക്കൽ വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് OXPHOS ഇല്ലാത്ത PN-ൽ, 8 ആഴ്ച പ്രായമുള്ള എലികളുടെ സെറിബെല്ലാർ കഷ്ണങ്ങൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫോളേറ്റ് സൈക്കിളിന്റെ ഒരു പ്രധാന എൻസൈമായ സെറിൻ ഹൈഡ്രോക്സിമെഥൈൽട്രാൻസ്ഫെറേസ് 2 (SHMT2) ന് വിധേയമാക്കിയെന്നാണ്. ഗണ്യമായ രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണം (ചിത്രം S5D). 13 CU-ഗ്ലൂക്കോസ്-ഇൻകുബേറ്റഡ് അക്യൂട്ട് സെറിബെല്ലാർ സ്ലൈസുകളിൽ, മെറ്റബോളിക് ട്രെയ്‌സിംഗ് പരീക്ഷണങ്ങൾ സെറീൻ, പ്രോലൈൻ ബയോസിന്തസിസ് എന്നിവയുടെ മുകളിലേക്ക് നിയന്ത്രണം കൂടുതൽ സ്ഥിരീകരിച്ചു, ഇത് കാർബൺ ഐസോഫോമുകൾ സെറീൻ, പ്രോലൈൻ എന്നിവയിലേക്ക് ഒഴുകുന്നത് വർദ്ധിച്ചതായി സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം S5E). GLS ഉം GPT2 ഉം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്ന പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങൾ ഗ്ലൂട്ടാമൈനിൽ നിന്നുള്ള ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റിന്റെ സമന്വയത്തിനും ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റും α-കെറ്റോഗ്ലുട്ടറേറ്റും തമ്മിലുള്ള ട്രാൻസ്‌മിനേഷനും കാരണമാകുന്നതിനാൽ, അവയുടെ അപ്‌റെഗുലേഷൻ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് OXPHOS കുറവുള്ള ന്യൂറോണുകൾക്ക് ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റിന്റെ ആവശ്യകത വർദ്ധിച്ചിട്ടുണ്ടെന്നാണ്. ഇത് പ്രോലൈനിന്റെ വർദ്ധിച്ച ബയോസിന്തസിസ് നിലനിർത്താൻ ലക്ഷ്യമിട്ടുള്ളതായിരിക്കാം (ചിത്രം S5C). ഈ മാറ്റങ്ങൾക്ക് വിപരീതമായി, PN-നിർദ്ദിഷ്ട Mfn2cKO എലികളിൽ നിന്നുള്ള സെറിബെല്ലാർ ആസ്ട്രോസൈറ്റുകളുടെ ഒരു പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനം ഈ പാതകൾ (എല്ലാ ആന്റിപെറോക്സിഡേസുകളും ഉൾപ്പെടെ) എക്സ്പ്രഷനിൽ കാര്യമായ മാറ്റമൊന്നും വരുത്തിയിട്ടില്ലെന്ന് കാണിച്ചു, അങ്ങനെ ഈ മെറ്റബോളിക് റീഡയറക്ഷൻ ഡീഗ്രേഡഡ് PN-ലേക്ക് തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെട്ടതാണെന്ന് തെളിയിക്കുന്നു (ചിത്രം S6, D മുതൽ G വരെ).
ചുരുക്കത്തിൽ, ഈ വിശകലനങ്ങൾ PN-കളിലെ നിർദ്ദിഷ്ട ഉപാപചയ പാതകളുടെ താൽക്കാലിക സജീവമാക്കലിന്റെ ഗണ്യമായി വ്യത്യസ്തമായ പാറ്റേണുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി. അസാധാരണമായ ന്യൂറോണൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം ആദ്യകാല രക്തപ്രവാഹത്തിനും 1C പുനർനിർമ്മാണത്തിനും (ചിത്രം 3E, ചിത്രം S5C), I, IV കോംപ്ലക്സുകളുടെ പ്രകടനത്തിൽ പ്രവചനാതീതമായ മാറ്റങ്ങൾക്കും കാരണമാകുമെങ്കിലും, സെറിൻ ഡി നോവോ സിന്തസിസിലെ മാറ്റങ്ങൾ പിന്നീടുള്ള ഘട്ടങ്ങളിൽ മാത്രമേ പ്രകടമാകൂ. OXPHOS പ്രവർത്തനരഹിതത (ചിത്രം 3E, ചിത്രം S5C). ന്യൂറോണൽ മെറ്റബോളിസത്തെ പുനർനിർമ്മിക്കുന്നതിനായി TCA ചക്രത്തിലെ രക്തപ്രവാഹത്തിന് വർദ്ധനവുമായി സ്ട്രെസ്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ (1C സൈക്കിൾ), സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് (സെറിൻ ബയോസിന്തസിസ്) എന്നിവ സിനർജിസ്റ്റിക്കലായി പ്രതികരിക്കുന്ന ഒരു തുടർച്ചയായ പ്രക്രിയയെ ഈ കണ്ടെത്തലുകൾ നിർവചിക്കുന്നു.
8 ആഴ്ച പ്രായമുള്ള OXPHOS കുറവുള്ള PN-കൾക്ക് ഉയർന്ന ഫ്രീക്വൻസി ഉത്തേജന പ്രവർത്തനം നിലനിർത്താനും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തന വൈകല്യം പരിഹരിക്കുന്നതിന് ഗണ്യമായ മെറ്റബോളിക് പുനഃസംയോജനത്തിന് വിധേയമാകാനും കഴിയും. ഈ കണ്ടെത്തൽ ഈ നിമിഷത്തിൽ പോലും, ഈ കോശങ്ങൾക്ക് ന്യൂറോഡീജനറേഷൻ വൈകിപ്പിക്കുന്നതിനോ തടയുന്നതിനോ ചികിത്സാ ഇടപെടൽ ലഭിച്ചേക്കാം എന്ന രസകരമായ ഒരു സാധ്യത ഉയർത്തുന്നു. വൈകി. രണ്ട് സ്വതന്ത്ര ഇടപെടലുകളിലൂടെ ഞങ്ങൾ ഈ സാധ്യത പരിഹരിച്ചു. ആദ്യ രീതിയിൽ, ഞങ്ങൾ ഒരു Cre-ആശ്രിത അഡിനോ-അസോസിയേറ്റഡ് വൈറസ് (AAV) വെക്റ്റർ രൂപകൽപ്പന ചെയ്തു, അതുവഴി MFN2 ഇൻ വിവോയിൽ OXPHOS കുറവുള്ള PN-കളിൽ തിരഞ്ഞെടുത്ത് പ്രകടിപ്പിക്കാൻ കഴിയും (ചിത്രം S7A). AAV എൻകോഡിംഗ് MFN2 ഉം ഫ്ലൂറസെന്റ് റിപ്പോർട്ടർ ജീൻ mCherry (Mfn2-AAV) ഉം ഇൻ വിട്രോയിലെ പ്രാഥമിക ന്യൂറോൺ സംസ്കാരങ്ങളിൽ പരിശോധിച്ചു, ഇത് MFN2 ഒരു Cre-ആശ്രിത രീതിയിൽ പ്രകടിപ്പിക്കാൻ കാരണമായി, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയെ രക്ഷിച്ചു, അതുവഴി Mfn2cKO ന്യൂറോണുകളിലെ ന്യൂറോമ്യൂട്ടേഷൻ തടയുന്നു (ചിത്രം S7, B, D, E). അടുത്തതായി, 8 ആഴ്ച പ്രായമുള്ള Mfn2-AAV യെ Mfn2cKO യുടെ സെറിബെല്ലാർ കോർട്ടെക്സിലേക്ക് സ്റ്റീരിയോടാക്റ്റിക്കലി എത്തിക്കുന്നതിനും എലികളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനുമായി ഞങ്ങൾ ഇൻ വിവോ പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി, 12 ആഴ്ച പ്രായമുള്ള എലികളെ വിശകലനം ചെയ്തു (ചിത്രം 4A). ചികിത്സിച്ച Mfn2cKO എലികൾ മരിച്ചു (ചിത്രം 1, A, B) (16). ഇൻ വിവോ വൈറൽ ട്രാൻസ്ഡക്ഷൻ ചില സെറിബെല്ലാർ സർക്കിളുകളിൽ PN ന്റെ സെലക്ടീവ് എക്സ്പ്രഷനിൽ കലാശിച്ചു (ചിത്രം S7, G, H). mCherry (Ctrl-AAV) മാത്രം പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കൺട്രോൾ AAV യുടെ കുത്തിവയ്പ്പ് Mfn2cKO മൃഗങ്ങളിലെ ന്യൂറോഡീജനറേഷന്റെ അളവിൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തിയില്ല. ഇതിനു വിപരീതമായി, Mfn2-AAV ഉപയോഗിച്ച് ട്രാൻസ്ഡ്യൂസ് ചെയ്ത Mfn2cKO-കളുടെ വിശകലനം PN സെൽ പാളിയുടെ ഒരു പ്രധാന സംരക്ഷണ പ്രഭാവം കാണിച്ചു (ചിത്രം 4, B, C). പ്രത്യേകിച്ചും, ന്യൂറോൺ സാന്ദ്രത നിയന്ത്രണ മൃഗങ്ങളിൽ നിന്ന് ഏതാണ്ട് വേർതിരിച്ചറിയാൻ കഴിയാത്തതായി തോന്നുന്നു (ചിത്രം 4, B, C, ചിത്രം S7, H, I). MFN2 അല്ലാത്ത MFN1 ന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ ന്യൂറോണൽ മരണം സംരക്ഷിക്കുന്നതിൽ ഒരുപോലെ ഫലപ്രദമാണ് (ചിത്രം 4C, ചിത്രം S7, C, F), എക്ടോപിക് MFN1 ന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ MFN2 ന്റെ അഭാവത്തെ ഫലപ്രദമായി നികത്തുമെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. സിംഗിൾ PN ലെവലിൽ നടത്തിയ കൂടുതൽ വിശകലനം, Mfn2-AAV മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ അൾട്രാസ്ട്രക്ചറിനെ വലിയതോതിൽ രക്ഷപ്പെടുത്തി, mtDNA ലെവലുകൾ സാധാരണമാക്കി, ആന്റി-ആൻജിയോജെനിസിസ് മാർക്കർ PCx ന്റെ ഉയർന്ന എക്സ്പ്രഷൻ വിപരീതമാക്കി (ചിത്രം 4, C മുതൽ E വരെ). വിശ്രമിക്കുന്ന അവസ്ഥയിൽ രക്ഷപ്പെടുത്തിയ Mfn2cKO എലികളുടെ ദൃശ്യ പരിശോധനയിൽ അവയുടെ പോസ്ചറും മോട്ടോർ ലക്ഷണങ്ങളും (ചലനം S1 മുതൽ S3 വരെ) മെച്ചപ്പെട്ടതായി കാണിച്ചു. ഉപസംഹാരമായി, OXPHOS-ൽ ഗുരുതരമായ കുറവുള്ള PN-കളിലേക്ക് MFN2 വീണ്ടും അവതരിപ്പിക്കുന്നത് വൈകിയാൽ mtDNA ഉപഭോഗം മാറ്റാനും രക്തപ്രവാഹത്തിന് കാരണമാകാനും അതുവഴി ഇൻ വിവോയിൽ ആക്സോൺ ഡീജനറേഷനും ന്യൂറോണൽ മരണവും തടയാനും പര്യാപ്തമാണെന്ന് ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.
(എ) സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന മെറ്റബോളിക് പാത്ത്‌വേ സജീവമാകുമ്പോൾ MFN2 എൻകോഡിംഗ് AAV കുത്തിവയ്ക്കുന്നതിനുള്ള പരീക്ഷണ ഷെഡ്യൂൾ കാണിക്കുന്ന ഒരു സ്കീം. (ബി) Mfn2cKO എലികളിൽ 8 ആഴ്ചയിൽ ട്രാൻസ്‌ഡ്യൂസ് ചെയ്‌തതും ആന്റി-കാൽബിൻഡിൻ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്‌തതുമായ 12 ആഴ്ച പ്രായമുള്ള സെറിബെല്ലാർ സ്ലൈസുകളുടെ പ്രതിനിധി കോൺഫോക്കൽ ചിത്രങ്ങൾ. വലത്: ആക്സൺ നാരുകളുടെ സ്കെയിലിംഗ്. ആക്സൺ സൂമിന്റെ സ്കെയിൽ 450 ഉം 75 μm ഉം ആണ്. (സി) ഇടത്: AAV ട്രാൻസ്‌ഡക്ഷൻ ലൂപ്പിലെ (AAV+) പുർക്കിൻജെ സെൽ സാന്ദ്രതയുടെ അളവ് (വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം; n = 3 എലികൾ). വലത്: 12 ആഴ്ചയിൽ ട്രാൻസ്‌ഡ്യൂസ് ചെയ്‌ത PN-ലെ mtDNA ഫോക്കസ് വിശകലനം (ജോടിയാക്കാത്ത ടി-ടെസ്റ്റ്; n = മൂന്ന് എലികളിൽ നിന്നുള്ള 6 സെല്ലുകൾ). * P <0.05; ** P <0.01. (D) സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന വൈറൽ വെക്റ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ട്രാൻസ്‌ഡ്യൂസ് ചെയ്‌ത Mfn2cKO സെറിബെല്ലാർ വിഭാഗങ്ങളുടെ PN-കളുടെ പ്രതിനിധി ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ. പിങ്ക് മാസ്ക് ഡെൻഡ്രൈറ്റുകൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്ന പ്രദേശത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, മഞ്ഞ ഡോട്ടുള്ള ചതുരം വലതുവശത്ത് നൽകിയിരിക്കുന്ന സൂമിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു; n ന്യൂക്ലിയസിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 1μm. (E) 12 ആഴ്ചയിൽ ട്രാൻസ്ഡ്യൂസ് ചെയ്ത PN-ലെ PCx സ്റ്റെയിനിംഗിന്റെ ഒരു ഉദാഹരണം കാണിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 20μm. OE, ഓവർഎക്സ്പ്രഷൻ; FC, ഫോൾഡ് ചേഞ്ച്.
ഒടുവിൽ, OXPHOS തകരാറുകൾ അനുഭവിച്ച PN-കളിൽ പെറോക്സിഡേസ്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് സെൽ അതിജീവനത്തിന്റെ പ്രാധാന്യം ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. മൗസ് PCx mRNA (AAV-shPCx) പ്രത്യേകമായി ലക്ഷ്യമിട്ട് ഞങ്ങൾ mCherry എൻകോഡിംഗ് AAV-shRNA (ഷോർട്ട് ഹെയർപിൻ RNA) സൃഷ്ടിച്ചു, കൂടാതെ Mfn2cKO എലികളുടെ സെറിബെല്ലത്തിലേക്ക് വൈറസ് അല്ലെങ്കിൽ അതിന്റെ സ്ക്രാംബിൾഡ് കൺട്രോൾ (AAV-scr) കുത്തിവച്ചു. PCx എക്സ്പ്രഷൻ വർദ്ധിക്കുകയും PN സെൽ പാളി ഇപ്പോഴും കേടുകൂടാതെയിരിക്കുകയും ചെയ്ത കാലയളവിൽ ഫലപ്രദമായ PCx നോക്ക്ഡൗൺ നേടുന്നതിനായി നാലാമത്തെ ആഴ്ചയിൽ (ചിത്രം 5A) കുത്തിവയ്പ്പ് നടത്തി (ചിത്രം 3C) PCx (ചിത്രം S8A) തകർക്കുന്നത് PN മരണത്തിന്റെ ഗണ്യമായ ത്വരിതപ്പെടുത്തലിന് കാരണമാകുമെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, ഇത് രോഗബാധിതമായ വളയത്തിലേക്ക് പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു (ചിത്രം 5, B, C). PCx അപ്-റെഗുലേഷൻ മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഉപാപചയ ഫലങ്ങളുടെ സംവിധാനം മനസ്സിലാക്കുന്നതിനായി, ഗ്ലൂട്ടത്തയോൺ വിലയിരുത്തുന്നതിനായി PCx നോക്ക്ഡൗണും AAV-മധ്യസ്ഥതയുള്ള ഒപ്റ്റിക്കൽ ബയോസെൻസർ Grx1-roGFP2 ഉം ഒരേസമയം പ്രകടിപ്പിച്ചതിനുശേഷം (ചിത്രം S8, B മുതൽ D വരെ) PN-കളുടെ റെഡോക്സ് നില ഞങ്ങൾ പഠിച്ചു. പെപ്റ്റൈഡ് റെഡോക്സ് പൊട്ടൻഷ്യലിന്റെ ആപേക്ഷിക മാറ്റം (38). തുടർന്ന്, FLIM അവസ്ഥകൾ പരിശോധിച്ചതിന് ശേഷം സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് റെഡോക്സ് സ്റ്റാറ്റസിലെ സാധ്യതയുള്ള മാറ്റങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് 7 ആഴ്ച പ്രായമുള്ള Mfn2cKO അല്ലെങ്കിൽ കൺട്രോൾ ലിറ്റർമേറ്റുകളുടെ അക്യൂട്ട് ബ്രെയിൻ സ്ലൈസുകളിൽ ഞങ്ങൾ രണ്ട്-ഫോട്ടോൺ ഫ്ലൂറസെൻസ് ലൈഫ് ടൈം ഇമേജിംഗ് മൈക്രോസ്കോപ്പി (FLIM) നടത്തി (ചിത്രം S8, E മുതൽ G വരെ). PCx എക്സ്പ്രഷൻ ഇല്ലാത്ത ഒരൊറ്റ Mfn2cKO PN-കളുടെ ഓക്സിഡേഷൻ അവസ്ഥയിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവ് വിശകലനം കാണിച്ചു, ഇത് സ്ക്രാംബിൾഡ് shRNA മാത്രം പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കൺട്രോൾ ന്യൂറോണുകളിൽ നിന്നോ Mfn2cKO PN-കളിൽ നിന്നോ വ്യത്യസ്തമാണ് (ചിത്രം 5, D, E). PCx എക്സ്പ്രഷൻ ഡൗൺ-റെഗുലേറ്റ് ചെയ്തപ്പോൾ, ഉയർന്ന ഓക്സിഡൈസ്ഡ് അവസ്ഥ കാണിക്കുന്ന Mfn2cKO PN-കളുടെ ശതമാനം മൂന്ന് മടങ്ങ് വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 5E), ഇത് PCx അപ്-റെഗുലേഷൻ ഡീജനറേറ്റഡ് ന്യൂറോണുകളുടെ റെഡോക്സ് ശേഷി നിലനിർത്തുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
(എ) സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന മെറ്റബോളിക് പാത്ത്‌വേ സജീവമാകുമ്പോൾ, shPCx എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നതിനുള്ള AAV ഇൻജക്ഷൻ ഷെഡ്യൂൾ കാണിക്കുന്ന ഒരു സ്കീം. (ബി) 4 ആഴ്ചയിൽ ആന്റി-കാൽസിനൂറിൻ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ട്രാൻസ്ഡ്യൂസ് ചെയ്ത് ലേബൽ ചെയ്ത Mfn2cKO എലികളിലെ 8 ആഴ്ച പ്രായമുള്ള സെറിബെല്ലാർ വിഭാഗങ്ങളുടെ പ്രതിനിധി കോൺഫോക്കൽ ഫോട്ടോഗ്രാഫുകൾ. സ്കെയിൽ ബാർ, 450μm. (സി) AAV-ട്രാൻസ്ഡ്യൂസ്ഡ് ലൂപ്പുകളിലെ പുർക്കിൻജെ സെൽ സാന്ദ്രതയുടെ അളവ് (വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം; n = 3 മുതൽ 4 വരെ എലികൾ). ഡാറ്റ ശരാശരി ± SEM ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു; ***P<0.001. (ഡി) നിർദ്ദിഷ്ട പരീക്ഷണ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഗ്ലൂട്ടത്തയോൺ റെഡോക്സ് സെൻസർ Grx1-roGFP2 പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന 7 ആഴ്ച പ്രായമുള്ള PN ന്റെ ശരാശരി ആയുസ്സ് പ്രതിനിധി FLIM ചിത്രം കാണിക്കുന്നു. LUT (ലുക്ക്-അപ്പ് പട്ടിക) അനുപാതം: അതിജീവന സമയ ഇടവേള (പിക്കോസെക്കൻഡുകളിൽ). സ്കെയിൽ ബാർ, 25μm. (E) ഓരോ അവസ്ഥയിലും രണ്ട് എലികളിലെയും (D) (n=158 മുതൽ 368 വരെ കോശങ്ങൾ വരെയുള്ള Grx1-roGFP2 ആയുഷ്കാല മൂല്യങ്ങളുടെ വിതരണം ഹിസ്റ്റോഗ്രാം കാണിക്കുന്നു. ഓരോ ഹിസ്റ്റോഗ്രാമിനും മുകളിലുള്ള പൈ ചാർട്ട്: CTRL-AAV-scr-ലെ ശരാശരി ആയുഷ്കാല മൂല്യത്തിന്റെ 1 SD കവിയുന്ന, ഗണ്യമായി നീളമുള്ള (ചുവപ്പ്, ഓക്സിഡൈസ്ഡ്) അല്ലെങ്കിൽ കുറഞ്ഞ (നീല, കുറഞ്ഞ) ആയുഷ്കാല മൂല്യങ്ങളുള്ള കോശങ്ങളുടെ എണ്ണം കാണിക്കുന്നു. (F) ന്യൂറോണൽ PCx-ന്റെ അപ്‌റെഗുലേഷന്റെ സംരക്ഷണ ഫലം നിർദ്ദിഷ്ട മാതൃക കാണിക്കുന്നു.
മൊത്തത്തിൽ, ഞങ്ങൾ ഇവിടെ നൽകുന്ന ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നത്, MFN2 ന്റെ പുനഃപ്രകടനം ഗുരുതരമായ OXPHOS കുറവ്, കഠിനമായ mtDNA ശോഷണം, അങ്ങേയറ്റം അസാധാരണമായ ista-പോലുള്ള രൂപഘടന എന്നിവയുള്ള പുരോഗമിച്ച PN-നെ പൂർണ്ണമായും രക്ഷിക്കാൻ കഴിയുമെന്നാണ്. അതുവഴി വിപുലമായ രോഗങ്ങളിൽ പോലും തുടർച്ചയായ പുരോഗതി നൽകുന്നു. ന്യൂറോഡീജനറേഷൻ കോശ മരണത്തിന് മുമ്പുള്ള ഘട്ടത്തിന്റെ റിവേഴ്‌സിബിൾ തെളിവുകൾ നൽകുന്നു. OXPHOS ഇല്ലാത്ത PN-കളിൽ PCx എക്സ്പ്രഷനെ തടയുകയും കോശ മരണം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും അതുവഴി ഒരു സംരക്ഷണ പങ്ക് വഹിക്കുകയും ചെയ്യുന്ന ന്യൂറോണുകളുടെ കഴിവാണ് ഈ അളവിലുള്ള ഉപാപചയ വഴക്കത്തെ കൂടുതൽ ഊന്നിപ്പറയുന്നത് (TCA സൈക്കിളിന്റെ ഒരു പുനർവിന്യാസം).
ഈ പഠനത്തിൽ, OXPHOS പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കലിനുള്ള PN-കളുടെ പ്രതികരണം, ഉപാപചയ പ്രോഗ്രാമുകൾ സജീവമാക്കിയ ഡിഫറൻഷ്യൽ ആക്ടിവേഷൻ പാതയിലൂടെ ക്രമേണ TCA സൈക്കിൾ രക്തപ്രവാഹത്തിലേക്ക് സംയോജിക്കുന്നതാണെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിവുകൾ നൽകി. നിരവധി പൂരക രീതികളിലൂടെ പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനം ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു, കൂടാതെ കഠിനമായ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതത വെല്ലുവിളിക്കപ്പെടുമ്പോൾ, ന്യൂറോണുകൾക്ക് മുമ്പ് അജ്ഞാതമായ ഒരു ഉപാപചയ ഇലാസ്തികത ഉണ്ടെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി. ഞങ്ങളെ അത്ഭുതപ്പെടുത്തിക്കൊണ്ട്, മുഴുവൻ റിവൈറിംഗ് പ്രക്രിയയും ന്യൂറോഡീജനറേഷനോടൊപ്പമുള്ള ടെർമിനൽ മെറ്റബോളിക് അവസ്ഥയെ ക്രമേണയും മാറ്റാനാവാത്ത വിധം അടയാളപ്പെടുത്തണമെന്നില്ല, പക്ഷേ കോശ മരണത്തിന് മുമ്പുള്ള ഘട്ടത്തിൽ പോലും ഇത് ഒരു മെയിന്റനൻസ് ന്യൂറോണായി മാറിയേക്കാമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഫങ്ഷണൽ കോമ്പൻസേഷൻ മെക്കാനിസം. ശരീരത്തിൽ ന്യൂറോണുകൾക്ക് ഗണ്യമായ അളവിൽ ഉപാപചയ പ്ലാസ്റ്റിറ്റി ഉണ്ടെന്ന് ഈ കണ്ടെത്തൽ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. MFN2 ന്റെ പിന്നീടുള്ള പുനരവതരണം പ്രധാന ഉപാപചയ മാർക്കറുകളുടെ പ്രകടനത്തെ വിപരീതമാക്കാനും PN ഡീജനറേഷൻ തടയാനും കഴിയുമെന്ന് ഈ വസ്തുത തെളിയിക്കുന്നു. നേരെമറിച്ച്, ഇത് രക്തപ്രവാഹത്തെ തടയുകയും ഞരമ്പുകളെ ത്വരിതപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. ട്രാൻസ്സെക്ഷ്വൽ.
ഞങ്ങളുടെ ഗവേഷണത്തിലെ ഏറ്റവും ആകർഷകമായ കണ്ടെത്തലുകളിൽ ഒന്ന്, OXPHOS ഇല്ലാത്ത PN-കൾക്ക് ആർട്ടീരിയോസ്ക്ലെറോസിസിനെ പ്രത്യേകമായി ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്ന എൻസൈമുകൾ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ TCA സൈക്കിൾ മെറ്റബോളിസത്തിൽ മാറ്റം വരുത്താൻ കഴിയുമെന്നതാണ്. മെറ്റബോളിക് പുനഃക്രമീകരണം കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ ഒരു പൊതു സവിശേഷതയാണ്, അവയിൽ ചിലത് TCA സൈക്കിൾ ഇന്റർമീഡിയറ്റുകളെ അനുബന്ധമായി നൽകി കുറയ്ക്കുന്ന തുല്യതകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് ശ്വസന ശൃംഖലയെ നയിക്കുകയും ലിപിഡ്, ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ബയോസിന്തസിസ് മുൻഗാമികളുടെ ഉത്പാദനം നിലനിർത്തുകയും ചെയ്യുന്നു (39, 40). OXPHOS പ്രവർത്തനരഹിതമായ പെരിഫറൽ ടിഷ്യൂകളിൽ, ഗ്ലൂട്ടാമൈൻ/ഗ്ലൂട്ടാമൈൻ മെറ്റബോളിസത്തിന്റെ പുനഃസംയോജനവും ഒരു പ്രധാന സവിശേഷതയാണെന്ന് ഒരു സമീപകാല പഠനം കാണിച്ചു (5, 41), ഇവിടെ TCA സൈക്കിളിലേക്കുള്ള ഗ്ലൂട്ടാമൈൻ പ്രവേശനത്തിന്റെ ദിശ OXPHOS പരിക്കിന്റെ തീവ്രത കാരണം ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു (41). എന്നിരുന്നാലും, ശരീരത്തിലെ ന്യൂറോണൽ മെറ്റബോളിക് പ്ലാസ്റ്റിസിറ്റിയുടെ ഏതെങ്കിലും സാമ്യതയെക്കുറിച്ചും രോഗ പശ്ചാത്തലത്തിൽ അതിന്റെ സാധ്യമായ പ്രസക്തിയെക്കുറിച്ചും വ്യക്തമായ തെളിവുകളുടെ അഭാവമുണ്ട്. അടുത്തിടെ നടത്തിയ ഒരു ഇൻ വിട്രോ പഠനത്തിൽ, പ്രാഥമിക കോർട്ടിക്കൽ ന്യൂറോണുകൾ ന്യൂറോ ട്രാൻസ്മിഷനായി ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റ് പൂളുകളെ സമാഹരിക്കുന്നതായി കാണിച്ചു, അതുവഴി മെറ്റബോളിക് സമ്മർദ്ദ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഓക്സിഡേറ്റീവ് മെറ്റബോളിസവും രക്തപ്രവാഹത്തിന് പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതും (42). TCA സൈക്കിൾ എൻസൈമായ സക്സിനേറ്റ് ഡീഹൈഡ്രജനേസിന്റെ ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ഇൻഹിബിഷന്റെ കീഴിൽ, പൈറുവേറ്റ് കാർബോക്സിലേഷൻ കൾച്ചർ ചെയ്ത സെറിബെല്ലാർ ഗ്രാനുൾ ന്യൂറോണുകളിൽ ഓക്സലോഅസെറ്റേറ്റിന്റെ സമന്വയം നിലനിർത്തുമെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു (34). എന്നിരുന്നാലും, മസ്തിഷ്ക കലകളിൽ (അഥെറോസ്ക്ലെറോസിസ് പ്രധാനമായും ആസ്ട്രോസൈറ്റുകളിൽ മാത്രമായി ഒതുങ്ങി നിൽക്കുന്നതായി വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നിടത്ത്) ഈ സംവിധാനങ്ങളുടെ ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രസക്തിക്ക് ഇപ്പോഴും പ്രധാന ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രാധാന്യമുണ്ട് (43). ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ശരീരത്തിലെ OXPHOS മൂലം കേടുപാടുകൾ സംഭവിച്ച PN-കളെ TCA പൂൾ ഇന്റർമീഡിയറ്റുകളുടെ സപ്ലിമെന്റേഷന്റെ രണ്ട് പ്രധാന ഉറവിടങ്ങളായ BCAA ഡീഗ്രഡേഷനിലേക്കും പൈറുവേറ്റ് കാർബോക്സിലേഷനിലേക്കും മാറ്റാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നു. ന്യൂറോണൽ എനർജി മെറ്റബോളിസത്തിന് BCAA കാറ്റബോളിസത്തിന്റെ സാധ്യത നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ന്യൂറോ ട്രാൻസ്മിഷനിൽ ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റിന്റെയും GABAയുടെയും പങ്കിന് പുറമേ (44), ഇൻ വിവോയിൽ ഈ സംവിധാനങ്ങൾക്ക് ഇപ്പോഴും തെളിവുകളൊന്നുമില്ല. അതിനാൽ, പ്രവർത്തനരഹിതമായ PN-കൾക്ക് ആഥെറോസ്ക്ലെറോസിസ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെ സ്വാംശീകരണ പ്രക്രിയയാൽ നയിക്കപ്പെടുന്ന TCA ഇന്റർമീഡിയറ്റുകളുടെ ഉപഭോഗത്തിന് യാന്ത്രികമായി നഷ്ടപരിഹാരം നൽകാൻ കഴിയുമെന്ന് അനുമാനിക്കാൻ എളുപ്പമാണ്. പ്രത്യേകിച്ച്, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതമായ കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തിൽ നിർദ്ദേശിക്കപ്പെടുന്ന, ആസ്പാർട്ടിക് ആസിഡിന്റെ വർദ്ധിച്ച ആവശ്യകത നിലനിർത്താൻ PCx ന്റെ അപ്‌റെഗുലേഷൻ ആവശ്യമായി വന്നേക്കാം (45). എന്നിരുന്നാലും, Mfn2cKO PN-കളിലെ അസ്പാർട്ടിക് ആസിഡിന്റെ സ്ഥിര-സ്ഥിതി ലെവലിൽ ഞങ്ങളുടെ മെറ്റബോളോമിക് വിശകലനം കാര്യമായ മാറ്റങ്ങളൊന്നും വെളിപ്പെടുത്തിയില്ല (ചിത്രം S6A), ഇത് പ്രോലിഫറേറ്റിംഗ് കോശങ്ങൾക്കും പോസ്റ്റ്-മൈറ്റോട്ടിക് ന്യൂറോണുകൾക്കുമിടയിൽ അസ്പാർട്ടിക് ആസിഡിന്റെ വ്യത്യസ്ത മെറ്റബോളിക് ഉപയോഗത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു. ഇൻ വിവോ പ്രവർത്തനരഹിതമായ ന്യൂറോണുകളിൽ PCx അപ്‌റെഗുലേഷന്റെ കൃത്യമായ സംവിധാനം ഇപ്പോഴും വിശദീകരിക്കേണ്ടതുണ്ടെങ്കിലും, സെറിബെല്ലാർ സ്ലൈസുകളിലെ FLIM പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ഇത് പ്രകടമായെങ്കിലും, ന്യൂറോണുകളുടെ റെഡോക്സ് അവസ്ഥ നിലനിർത്തുന്നതിൽ ഈ അകാല പ്രതികരണം ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിച്ചു. പ്രത്യേകിച്ചും, PCx-നെ അപ്-റെഗുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിൽ നിന്ന് PN-കളെ തടയുന്നത് കൂടുതൽ ഓക്സിഡൈസ് ചെയ്ത അവസ്ഥയിലേക്ക് നയിക്കുകയും കോശ മരണത്തെ ത്വരിതപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യും. BCAA ഡീഗ്രഡേഷൻ സജീവമാക്കലും പൈറുവേറ്റിന്റെ കാർബോക്‌സിലേഷനും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ പെരിഫറൽ ടിഷ്യൂകളെ ചിത്രീകരിക്കുന്നതിനുള്ള വഴികളല്ല (7). അതിനാൽ, ന്യൂറോ ഡീജനറേഷന് പ്രധാനപ്പെട്ട ഒരേയൊരു സവിശേഷതയല്ലെങ്കിലും, OXPHOS കുറവുള്ള ന്യൂറോണുകളുടെ ഒരു മുൻ‌ഗണനാ സവിശേഷതയായി അവ കാണപ്പെടുന്നു.
സെറിബെല്ലർ രോഗം ഒരു വൈവിധ്യമാർന്ന തരം ന്യൂറോഡീജനറേറ്റീവ് രോഗമാണ്, ഇത് സാധാരണയായി അറ്റാക്സിയയായി പ്രത്യക്ഷപ്പെടുകയും പലപ്പോഴും പിഎൻ-കൾക്ക് കേടുപാടുകൾ വരുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു (46). ഈ ന്യൂറോൺ ജനസംഖ്യ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയ്ക്ക് പ്രത്യേകിച്ച് ഇരയാകുന്നു, കാരണം എലികളിലെ അവയുടെ സെലക്ടീവ് ഡീജനറേഷൻ മനുഷ്യന്റെ സ്പൈനോസെറെബെല്ലാർ അറ്റാക്സിയയെ ചിത്രീകരിക്കുന്ന നിരവധി മോട്ടോർ ലക്ഷണങ്ങളെ പുനർനിർമ്മിക്കാൻ പര്യാപ്തമാണ് (16, 47, 48). റിപ്പോർട്ടുകൾ പ്രകാരം, മ്യൂട്ടന്റ് ജീനുള്ള ഒരു ട്രാൻസ്ജെനിക് മൗസ് മോഡൽ മനുഷ്യ സ്പൈനോസെറെബെല്ലാർ അറ്റാക്സിയയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു കൂടാതെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുമുണ്ട് (49, 50), ഇത് PNPH-ൽ OXPHOS കുറവിന്റെ അനന്തരഫലങ്ങൾ പഠിക്കേണ്ടതിന്റെ പ്രാധാന്യം ഊന്നിപ്പറയുന്നു. അതിനാൽ, ഈ സവിശേഷ ന്യൂറോൺ ജനസംഖ്യയെ ഫലപ്രദമായി ഒറ്റപ്പെടുത്തുകയും പഠിക്കുകയും ചെയ്യുന്നത് പ്രത്യേകിച്ചും അനുയോജ്യമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, PN-കൾ സമ്മർദ്ദത്തോട് വളരെ സെൻസിറ്റീവ് ആയതിനാൽ മുഴുവൻ സെറിബെല്ലർ സെൽ ജനസംഖ്യയുടെ കുറഞ്ഞ അനുപാതം കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, പല ഒമിക്സ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പഠനങ്ങൾക്കും, അവയെ മുഴുവൻ കോശങ്ങളായി തിരഞ്ഞെടുത്ത് വേർതിരിക്കുന്നത് ഇപ്പോഴും ഒരു വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞ വശമാണ്. മറ്റ് കോശ തരങ്ങളുടെ (പ്രത്യേകിച്ച് മുതിർന്ന കോശങ്ങളുടെ) മലിനീകരണത്തിന്റെ പൂർണ്ണമായ അഭാവം കൈവരിക്കുന്നത് മിക്കവാറും അസാധ്യമാണെങ്കിലും, ഡൗൺസ്ട്രീം പ്രോട്ടിയോമിക്സ് വിശകലനത്തിനായി മതിയായ എണ്ണം പ്രായോഗിക ന്യൂറോണുകൾ നേടുന്നതിന് ഞങ്ങൾ FACS-മായി ഫലപ്രദമായ ഒരു വിഘടന ഘട്ടം സംയോജിപ്പിച്ചു, കൂടാതെ മുഴുവൻ സെറിബെല്ലത്തിന്റെയും നിലവിലുള്ള ഡാറ്റാ സെറ്റുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ വളരെ ഉയർന്ന പ്രോട്ടീൻ കവറേജ് (ഏകദേശം 3000 പ്രോട്ടീനുകൾ) ഉണ്ട് (51). മുഴുവൻ കോശങ്ങളുടെയും പ്രവർത്തനക്ഷമത സംരക്ഷിക്കുന്നതിലൂടെ, ഞങ്ങൾ ഇവിടെ നൽകുന്ന രീതി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയിലെ ഉപാപചയ പാതകളിലെ മാറ്റങ്ങൾ പരിശോധിക്കാൻ മാത്രമല്ല, അതിന്റെ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് എതിരാളികളിലെ മാറ്റങ്ങൾ പരിശോധിക്കാനും ഞങ്ങളെ അനുവദിക്കുന്നു, ഇത് സെൽ തരം സമ്പുഷ്ടമാക്കുന്നതിന് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെംബ്രൻ ടാഗുകളുടെ ഉപയോഗത്തെ പൂരകമാക്കുന്നു. സങ്കീർണ്ണമായ ടിഷ്യൂകളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ എണ്ണത്തിനായുള്ള പുതിയ രീതി (52, 53). ഞങ്ങൾ വിവരിക്കുന്ന രീതി പുർക്കിൻജെ കോശങ്ങളുടെ പഠനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതല്ല, മറിച്ച് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ മറ്റ് മാതൃകകൾ ഉൾപ്പെടെ രോഗബാധിതമായ തലച്ചോറിലെ ഉപാപചയ മാറ്റങ്ങൾ പരിഹരിക്കുന്നതിന് ഏത് തരത്തിലുള്ള കോശത്തിലും എളുപ്പത്തിൽ പ്രയോഗിക്കാൻ കഴിയും.
അവസാനമായി, ഈ ഉപാപചയ പുനഃക്രമീകരണ പ്രക്രിയയിൽ കോശ സമ്മർദ്ദത്തിന്റെ പ്രധാന ലക്ഷണങ്ങളെ പൂർണ്ണമായും മാറ്റിമറിക്കാനും ന്യൂറോണൽ ഡീജനറേഷൻ തടയാനും കഴിയുന്ന ഒരു ചികിത്സാ ജാലകം ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. അതിനാൽ, ഇവിടെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന റിവൈറിംഗിന്റെ പ്രവർത്തനപരമായ പ്രത്യാഘാതങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കുന്നത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതത സമയത്ത് ന്യൂറോണൽ പ്രവർത്തനക്ഷമത നിലനിർത്തുന്നതിനുള്ള സാധ്യമായ ചികിത്സകളെക്കുറിച്ചുള്ള അടിസ്ഥാന ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകിയേക്കാം. മറ്റ് മസ്തിഷ്ക കോശ തരങ്ങളിലെ ഊർജ്ജ ഉപാപചയത്തിലെ മാറ്റങ്ങൾ വിച്ഛേദിക്കാൻ ലക്ഷ്യമിട്ടുള്ള ഭാവി ഗവേഷണം മറ്റ് ന്യൂറോളജിക്കൽ രോഗങ്ങളിൽ ഈ തത്വത്തിന്റെ പ്രയോഗക്ഷമത പൂർണ്ണമായി വെളിപ്പെടുത്തേണ്ടതുണ്ട്.
മിറ്റോപാർക്ക് എലികളെക്കുറിച്ച് മുമ്പ് വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട് (31). loxP ഫ്ലാങ്കിംഗ് Mfn2 ജീനുകളുള്ള C57BL/6N എലികളെ മുമ്പ് വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട് (18) കൂടാതെ L7-Cre എലികളുമായി സങ്കലനം ചെയ്തു (23). തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ഇരട്ട ഹെറ്ററോസൈഗസ് സന്തതികളെ പിന്നീട് ഹോമോസൈഗസ് Mfn2loxP/Mfn2loxP എലികളുമായി സങ്കലനം ചെയ്തു, Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) നായി പുർക്കിൻജെ-നിർദ്ദിഷ്ട ജീൻ നോക്കൗട്ടുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു. ഇണചേരലിന്റെ ഒരു ഉപവിഭാഗത്തിൽ, അധിക ക്രോസിംഗുകളിലൂടെ Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP അല്ലീൽ (stop-mtYFP) അവതരിപ്പിച്ചു (20). എല്ലാ മൃഗ നടപടിക്രമങ്ങളും യൂറോപ്യൻ, ദേശീയ, സ്ഥാപന മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി നടത്തുകയും ജർമ്മനിയിലെ നോർത്ത് റൈൻ-വെസ്റ്റ്ഫാലിയയിലെ ഉംവെൽറ്റിലെയും വെർബ്രോച്ചർസ്ചുട്സിലെയും ലാൻഡെസാംറ്റ്ഫുർനാറ്റൂർ അംഗീകരിക്കുകയും ചെയ്തു. മൃഗസംരക്ഷണം യൂറോപ്യൻ ഫെഡറേഷൻ ഓഫ് ലബോറട്ടറി അനിമൽ സയൻസസ് അസോസിയേഷനുകളുടെ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശവും പിന്തുടരുന്നു.
ഗർഭിണിയായ സ്ത്രീയുടെ സെർവിക്കൽ ഡിസ്ലോക്കേഷൻ അനസ്തേഷ്യ ചെയ്ത ശേഷം, എലിയുടെ ഭ്രൂണം വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നു (E13). 10 mM ഹെപ്പസ് സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്ത ഹാങ്ക്സിന്റെ ബാലൻസ്ഡ് സാൾട്ട് സൊല്യൂഷനിൽ (HBSS) കോർട്ടെക്സ് വിച്ഛേദിക്കുകയും പപ്പെയ്ൻ (20 U/ml), സിസ്റ്റീൻ (1μg/ml) എന്നിവ അടങ്ങിയ ഡൽബെക്കോയുടെ മോഡിഫൈഡ് ഈഗിൾസ് മീഡിയത്തിലേക്ക് കടത്തിവിടുകയും ചെയ്തു. DMEM-ൽ ടിഷ്യു ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത് എൻസൈമാറ്റിക് ദഹനം വഴി അതിനെ വേർപെടുത്തുക. Ml) 37°C താപനിലയിൽ 20 മിനിറ്റ് നേരം, തുടർന്ന് 10% ഫെറ്റൽ ബോവിൻ സെറം സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്ത DMEM-ൽ മെക്കാനിക്കൽ മില്ലിംഗ് ചെയ്തു. 6 സെ.മീ കൾച്ചർ ഡിഷിന് 2×106 സാന്ദ്രതയിൽ അല്ലെങ്കിൽ ഇമേജിംഗ് വിശകലനത്തിനായി 0.5×105 സെല്ലുകൾ/cm2 സാന്ദ്രതയിൽ പോളിലൈസിൻ പൂശിയ ഗ്ലാസ് കവർസ്ലിപ്പുകളിൽ കോശങ്ങൾ വിത്ത് വിതച്ചു. 4 മണിക്കൂറിന് ശേഷം, മീഡിയം 1% B27 സപ്ലിമെന്റും 0.5 mM ഗ്ലൂട്ടമാക്സും അടങ്ങിയ ന്യൂറോബാസൽ സെറം-ഫ്രീ മീഡിയം ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചു. പരീക്ഷണത്തിലുടനീളം ന്യൂറോണുകളെ 37°C യിലും 5% CO2 ലും നിലനിർത്തി, ആഴ്ചയിൽ ഒരിക്കൽ ഭക്ഷണം നൽകി. ഇൻ വിട്രോയിൽ പുനഃസംയോജനം പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിനായി, ഇനിപ്പറയുന്ന AAV9 വൈറസ് വെക്റ്ററിന്റെ 3μl (24-കിണർ കൾച്ചർ ഡിഷ്) അല്ലെങ്കിൽ 0.5μl (24-കിണർ പ്ലേറ്റ്) ഉപയോഗിച്ച് രണ്ടാം ദിവസം ഇൻ വിട്രോയിൽ ന്യൂറോണുകളെ ചികിത്സിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (ആഡ്ജീൻ, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ 105530-AAV9) ഉം AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (ആഡ്ജീൻ, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ 105545-AAV9).
മൗസ് Mfn1 ഉം Mfn2 പൂരക DNA യും (യഥാക്രമം ആഡ്ജീൻ പ്ലാസ്മിഡ് #23212 ഉം #23213 ഉം) സി-ടെർമിനസിൽ V5 സീക്വൻസ് (GKPIPNPLLGLDST) ഉപയോഗിച്ച് അടയാളപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ T2A സീക്വൻസിലൂടെ ഫ്രെയിമിൽ mCherry യുമായി സംയോജിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു. Grx1-roGFP2 എന്നത് ഹൈഡൽബർഗ് TP ഡിക്ക് DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) ന്റെ ഒരു സമ്മാനമാണ്. പരമ്പരാഗത ക്ലോണിംഗ് രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് tdTomato കാസറ്റ് മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചുകൊണ്ട്, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5, pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 വെക്റ്ററുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനായി കാസറ്റിനെ pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ബാക്ക്‌ബോണിലേക്ക് (ആഡ്‌ജീൻ റഫറൻസ് നമ്പർ 28306) സബ്‌ക്ലോൺ ചെയ്തു. നിയന്ത്രണ വെക്റ്റർ pAAV-CAG-FLEX-mCherry സൃഷ്ടിക്കാൻ സമാനമായ ഒരു തന്ത്രം ഉപയോഗിച്ചു. AAV-shPCx കൺസ്ട്രക്റ്റ് സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന്, ഒരു പ്ലാസ്മിഡ് AAV വെക്റ്റർ (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ആവശ്യമാണ്, അതിൽ shRNA ടാർഗെറ്റിംഗ് മൗസ് PCx എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന DNA ശ്രേണി അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) U6 പ്രൊമോട്ടറുടെ നിയന്ത്രണത്തിൽ, CMV പ്രൊമോട്ടറുടെ നിയന്ത്രണത്തിലാണ് mCherry ഉപയോഗിക്കുന്നത്. നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി (സെൽ ബയോലാബ്സ്) സഹായ AAV വെക്റ്ററുകളുടെ ഉത്പാദനം നടത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) എന്നിവ വഹിക്കുന്ന ഒരു ട്രാൻസ്ഫർ പ്ലാസ്മിഡ് ഉപയോഗിക്കുക. 293AAV സെല്ലുകളുടെ ട്രാൻസ്ഫെക്ഷൻ-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) അല്ലെങ്കിൽ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) കോഡിംഗ് ജീൻ, അതുപോലെ AAV1 കാപ്സിഡ് പ്രോട്ടീൻ, ആക്സസറി പ്രോട്ടീൻ കോഡിംഗ് എന്നിവ കാൽസ്യം ഫോസ്ഫേറ്റ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് പ്ലാസ്മിഡ് പ്ലാസ്മിഡ് പാക്കേജിംഗ് ചെയ്യുന്നു. ഡ്രൈ ഐസ്/എഥനോൾ ബാത്തിൽ ഫ്രീസ്-ഥാ സൈക്കിളുകൾ വഴിയും ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫേർഡ് സലൈനിൽ (PBS) ലൈസ് ചെയ്ത കോശങ്ങളിലൂടെയുമാണ് അസംസ്കൃത വൈറസ് സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ലഭിച്ചത്. AAV വെക്റ്ററിനെ തുടർച്ചയായ അയോഡിക്സനോൾ ഗ്രേഡിയന്റ് അൾട്രാസെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ (32,000 rpm ലും 4°C യിലും 24 മണിക്കൂർ) ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ചു, കൂടാതെ ഒരു അമിക്കോൺ അൾട്രാ-15 സെൻട്രിഫ്യൂഗൽ ഫിൽട്ടർ ഉപയോഗിച്ച് കേന്ദ്രീകരിച്ചു. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ജീനോം കോപ്പി (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX എന്നിവയുടെ ജീനോം ടൈറ്റർ മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെയായിരുന്നു (54), റിയൽ-ടൈം ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് അളന്നു.
ഐസ്-കോൾഡ് 1x PBS-ൽ പ്രാഥമിക ന്യൂറോണുകൾ നീക്കം ചെയ്തു, പെല്ലറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് ഫോസ്ഫേറ്റേസും പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്ററും (റോച്ചെ) അടങ്ങിയ 0.5% ട്രൈറ്റൺ X-100 / 0.5% സോഡിയം ഡിയോക്സിചോളേറ്റ്/പിബിഎസ് ലൈസിസ് ബഫറിൽ ഏകീകൃതമാക്കി. ബിസിൻചോണിനിക് ആസിഡ് അസ്സെ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ചാണ് പ്രോട്ടീൻ അളവ് നടത്തിയത്. തുടർന്ന് പ്രോട്ടീനുകളെ SDS-പോളിയാക്രിലാമൈഡ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചു, തുടർന്ന് ഒരു പോളി വിനൈലിഡിൻ ഫ്ലൂറൈഡ് മെംബ്രണിലേക്ക് (GE ഹെൽത്ത്കെയർ) ബ്ലോട്ട് ചെയ്തു. നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത സൈറ്റുകൾ തടയുക, TBST-യിൽ 5% പാലിൽ (Tween ഉള്ള Tris-buffered saline), TBST ഇൻകുബേറ്റിൽ വാഷിംഗ് സ്റ്റെപ്പുകൾ, സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി എന്നിവയിൽ പ്രൈമറി ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. +4°C-ൽ രാത്രി മുഴുവൻ പ്രൈമറി ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. കഴുകിയ ശേഷം, മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 2 മണിക്കൂർ സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി പ്രയോഗിക്കുക. തുടർന്ന്, ആന്റി-β-ആക്ടിൻ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് അതേ ബ്ലോട്ട് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട്, അതേ ലോഡിംഗ് സ്ഥിരീകരിച്ചു. കെമിലുമിനെസെൻസിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്തും കെമിലുമിനെസെൻസ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെയും കണ്ടെത്തൽ (GE ഹെൽത്ത്കെയർ).
ഗ്ലാസ് കവർസ്ലിപ്പുകളിൽ മുമ്പ് വിത്ത് പാകിയ ന്യൂറോണുകളെ 4% പാരാഫോർമാൽഡിഹൈഡ് (PFA)/PBS ഉപയോഗിച്ച് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് നിശ്ചിത സമയ പോയിന്റിൽ ഉറപ്പിച്ചു. ആദ്യം കവർസ്ലിപ്പുകളിൽ 0.1% ട്രൈറ്റൺ X-100/PBS ഉപയോഗിച്ച് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് പെർമിറ്റ് ചെയ്യുന്നു, തുടർന്ന് ബ്ലോക്കിംഗ് ബഫറിൽ [3% ബോവിൻ സെറം ആൽബുമിൻ (BSA)/PBS]. രണ്ടാം ദിവസം, കവർസ്ലിപ്പുകൾ ബ്ലോക്കിംഗ് ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, ഉചിതമായ ഫ്ലൂറോഫോർ-കൺജഗേറ്റഡ് സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 2 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു; ഒടുവിൽ, സാമ്പിളുകൾ PBS-ൽ 4′,6-ഡയമിഡിനോ-2 ഉപയോഗിച്ച് നന്നായി കഴുകി -ഫെനിലിൻഡോൾ (DAPI) കൗണ്ടർസ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത് അക്വാ-പോളി/മൗണ്ട് ഉപയോഗിച്ച് മൈക്രോസ്കോപ്പ് സ്ലൈഡിൽ ഉറപ്പിച്ചു.
ആൺ എലികളെയും പെൺ എലികളെയും കെറ്റാമൈൻ (130 mg/kg), സൈലാസൈൻ (10 mg/kg) എന്നിവയുടെ ഇൻട്രാപെരിറ്റോണിയൽ കുത്തിവയ്പ്പിലൂടെ അനസ്തേഷ്യ നൽകി, കാർപ്രോഫെൻ അനാലിസിക് (5 mg/kg) ഉപയോഗിച്ച് സബ്ക്യുട്ടേനിയസ് ആയി നൽകി, ഒരു ചൂടുള്ള പാഡ് ഘടിപ്പിച്ച സ്റ്റീരിയോടാക്റ്റിക് ഉപകരണത്തിൽ (Kopf) സ്ഥാപിച്ചു. തലയോട്ടി തുറന്ന് മിസ് ബോണുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സെറിബെല്ലാർ കോർട്ടെക്സിന്റെ ഭാഗം നേർത്തതാക്കാൻ ഒരു ഡെന്റൽ ഡ്രിൽ ഉപയോഗിക്കുക (ലാംഡയിൽ നിന്ന്: ടെയിൽ 1.8, ലാറ്ററൽ 1, ലോബ്യൂളുകൾ IV, V എന്നിവയ്ക്ക് അനുസൃതമായി). താഴെയുള്ള വാസ്കുലേച്ചറിനെ തടസ്സപ്പെടുത്താതിരിക്കാൻ തലയോട്ടിയിൽ ഒരു ചെറിയ ദ്വാരം ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം സൃഷ്ടിക്കാൻ ഒരു വളഞ്ഞ സിറിഞ്ച് സൂചി ഉപയോഗിക്കുക. പിന്നീട് നേർത്ത വരച്ച ഗ്ലാസ് കാപ്പിലറി മൈക്രോ-ഹോളിലേക്ക് സാവധാനം തിരുകുന്നു (ഡ്യൂറ മേറ്ററിന്റെ വെൻട്രൽ വശത്ത് -1.3 മുതൽ -1 വരെ), കൂടാതെ 200 മുതൽ 300 nl AAV വരെ മൈക്രോ-ഇൻജക്ടറിലേക്ക് (നരിഷിഗെ) മാനുവൽ സിറിഞ്ചുകൾ (നരിഷിഗെ) ഉപയോഗിച്ച് 10 മുതൽ 20 മിനിറ്റ് വരെ കുറഞ്ഞ മർദ്ദത്തിൽ നിരവധി തവണ കുത്തിവയ്ക്കുന്നു. ഇൻഫ്യൂഷനുശേഷം, വൈറസ് പൂർണ്ണമായും പടരാൻ അനുവദിക്കുന്നതിന് കാപ്പിലറി മറ്റൊരു 10 മിനിറ്റ് കൂടി വയ്ക്കുക. കാപ്പിലറികൾ പിൻവലിച്ച ശേഷം, മുറിവിന്റെ വീക്കം കുറയ്ക്കുന്നതിനും മൃഗത്തിന് സുഖം പ്രാപിക്കുന്നതിനും ചർമ്മം ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം തുന്നിച്ചേർക്കുന്നു. ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്ക് ശേഷം നിരവധി ദിവസത്തേക്ക് മൃഗങ്ങളെ വേദനസംഹാരികൾ (കാസ്പോഫെൻ) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു, ഈ സമയത്ത് അവയുടെ ശാരീരിക അവസ്ഥ ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം നിരീക്ഷിക്കുകയും തുടർന്ന് പറഞ്ഞ സമയത്ത് അവയെ ദയാവധം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. എല്ലാ നടപടിക്രമങ്ങളും യൂറോപ്യൻ, ദേശീയ, സ്ഥാപന മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി നടത്തി, ജർമ്മനിയിലെ നോർത്ത് റൈൻ-വെസ്റ്റ്ഫാലിയയിലെ ഉംവെൽറ്റിലെയും വെർബ്രോച്ചർഷുട്ട്സിലെയും ലാൻഡെസാംറ്റ്ഫർനാറ്റൂർ അംഗീകരിച്ചു.
മൃഗങ്ങളെ കെറ്റാമൈൻ (100 mg/kg), സൈലാസിൻ (10 mg/kg) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് അനസ്തേഷ്യ ചെയ്തു, ആദ്യം 0.1 M PBS ഉപയോഗിച്ച് ഹൃദയം പെർഫ്യൂസ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് PBS-ൽ 4% PFA ഉപയോഗിച്ച് പെർഫ്യൂസ് ചെയ്തു. ടിഷ്യു വിഘടിച്ച് 4% PFA/PBS-ൽ രാത്രി മുഴുവൻ 4°C-ൽ ഉറപ്പിച്ചു. PBS-ൽ സ്ഥിരമായ തലച്ചോറിൽ നിന്ന് സാഗിറ്റൽ വിഭാഗങ്ങൾ (50 μm കട്ടിയുള്ളത്) തയ്യാറാക്കാൻ ഒരു വൈബ്രേറ്റിംഗ് കത്തി (ലൈക്ക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ് GmbH, വിയന്ന, ഓസ്ട്രിയ) ഉപയോഗിച്ചു. മറ്റുവിധത്തിൽ വ്യക്തമാക്കിയിട്ടില്ലെങ്കിൽ, മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ (13) മുറിയിലെ താപനിലയിലും ഇളക്കലിലും സ്വതന്ത്രമായി പൊങ്ങിക്കിടക്കുന്ന വിഭാഗങ്ങളുടെ സ്റ്റെയിനിംഗ് നടത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, ആദ്യം, ലഭിച്ച കഷ്ണങ്ങൾ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 15 മിനിറ്റ് 0.5% ട്രൈറ്റൺ X-100/PBS ഉപയോഗിച്ച് പെർമിബിലൈസ് ചെയ്തു; ചില എപ്പിറ്റോപ്പുകൾക്ക് (Pcx, Shmt2), 80°C (PH 9)-ൽ tris-EDTA ബഫറിൽ കഷ്ണങ്ങൾ 25 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കി. അടുത്തതായി, ബ്ലോക്കിംഗ് ബഫറിൽ (3% BSA/PBS) 4°C താപനിലയിൽ രാത്രി മുഴുവൻ ഇളക്കി പ്രൈമറി ആന്റിബോഡി (പട്ടിക S1 കാണുക) ഉപയോഗിച്ച് സെക്ഷനുകൾ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. അടുത്ത ദിവസം, ബ്ലോക്കിംഗ് ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് സെക്ഷനുകൾ കഴുകി, ഉചിതമായ ഫ്ലൂറോഫോർ-കൺജഗേറ്റഡ് സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് റൂം താപനിലയിൽ 2 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു; ഒടുവിൽ, സെക്ഷനുകൾ PBS-ൽ നന്നായി കഴുകി, DAPI ഉപയോഗിച്ച് കൌണ്ടർ-സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു, തുടർന്ന് ഒരു മൈക്രോസ്കോപ്പ് സ്ലൈഡിൽ അക്വാപോളിമൗണ്ട് ഉപയോഗിച്ച് ഉറപ്പിച്ചു.
സാമ്പിൾ ചിത്രീകരിക്കാൻ ഒരു വെളുത്ത ലൈറ്റ് ലേസറും 405 ഡയോഡ് അൾട്രാവയലറ്റ് ലേസറും ഘടിപ്പിച്ച ഒരു ലേസർ സ്കാനിംഗ് കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് (TCS SP8-X അല്ലെങ്കിൽ TCS ഡിജിറ്റൽ ലൈറ്റ് ഷീറ്റ്, ലെയ്ക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ്) ഉപയോഗിച്ചു. ഫ്ലൂറോഫോറിനെ ഉത്തേജിപ്പിച്ച് ഹൈബ്രിഡ് ഡിറ്റക്ടർ (HyDs) ഉപയോഗിച്ച് സിഗ്നൽ ശേഖരിച്ചുകൊണ്ട്, Nyquist സാമ്പിളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന സ്റ്റാക്ക് ചെയ്ത ചിത്രങ്ങൾ സീക്വൻഷ്യൽ മോഡിൽ ശേഖരിക്കാൻ LAS-X സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ചു: ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് അല്ലാത്ത പാനലുകൾക്ക്, ഇത് വളരെ ഡൈനാമിക് സിഗ്നലുകളാണ് (ഉദാഹരണത്തിന്, സോമാറ്റിക് സെല്ലുകളിലും ഡെൻഡ്രൈറ്റുകളിലും) mtYFP) BrightR മോഡിൽ PN-കളുടെ എണ്ണം കണ്ടെത്താൻ HyD ഉപയോഗിക്കുക. പശ്ചാത്തലം കുറയ്ക്കുന്നതിന് 0.3 മുതൽ 6 ns വരെയുള്ള ഗേറ്റിംഗ് പ്രയോഗിക്കുന്നു.
തരംതിരിച്ച കോശങ്ങളുടെ തത്സമയ ഇമേജിംഗ്. 1% B27 സപ്ലിമെന്റും 0.5 mM ഗ്ലൂട്ടമാക്സും അടങ്ങിയ ന്യൂറോബാസൽ-എ മീഡിയത്തിൽ തരംതിരിച്ച ശേഷം, സെല്ലുകൾ ഉടൻ തന്നെ പോളി-എൽ-ലൈസിൻ-പൊതിഞ്ഞ ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡുകളിൽ (μ-സ്ലൈഡ്8 വെൽ, ഇബിഡി, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ 80826) വിത്ത് പാകി, കോശങ്ങൾ സ്ഥിരമാകാൻ അനുവദിക്കുന്നതിന് 1 മണിക്കൂർ 37°C ലും 5% CO2 ലും സൂക്ഷിക്കുക. വെളുത്ത ലേസർ, HyD, 63×[1.4 സംഖ്യാ അപ്പർച്ചർ (NA)] ഓയിൽ ഒബ്ജക്റ്റീവ് ലെൻസും ഒരു തപീകരണ ഘട്ടവും സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്ന ലെയ്ക SP8 ലേസർ സ്കാനിംഗ് കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ തത്സമയ ഇമേജിംഗ് നടത്തി.
എലിയെ കാർബൺ ഡൈ ഓക്സൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് വേഗത്തിൽ അനസ്തേഷ്യ നൽകി ശിരഛേദം ചെയ്തു, തലയോട്ടിയിൽ നിന്ന് തലച്ചോറ് വേഗത്തിൽ നീക്കം ചെയ്തു, 200μm കട്ടിയുള്ള (13C ലേബലിംഗ് പരീക്ഷണത്തിന്) അല്ലെങ്കിൽ 275μm കട്ടിയുള്ള (രണ്ട് ഫോട്ടോൺ പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക്) സാഗിറ്റൽ വിഭാഗമായി മുറിച്ച് ഇനിപ്പറയുന്ന വസ്തുക്കൾ നിറച്ചു. ഐസ്ക്രീം (HM-650 V, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, വാൾഡോർഫ്, ജർമ്മനി) ഇനിപ്പറയുന്ന പദാർത്ഥങ്ങളാൽ നിറഞ്ഞിരിക്കുന്നു: 125 mM ഐസ്-തണുത്ത, കാർബൺ-പൂരിത (95% O2 ഉം 5% CO2 ഉം) കുറഞ്ഞ Ca2 + കൃത്രിമ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ, 25 mM NaHCO3, 25 mM ഗ്ലൂക്കോസ്, 0.5 mM CaCl2 ഉം 3.5 mM MgCl2 ഉം (310 മുതൽ 330 mmol വരെയുള്ള ഓസ്മോട്ടിക് മർദ്ദം). ലഭിച്ച ബ്രെയിൻ സ്ലൈസുകൾ ഉയർന്ന Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ഗ്ലൂക്കോസ്, 1.0 mM CaCl2, 2.0 mM MgCl2) മീഡിയം) pH 7.4 ഉം 310 മുതൽ 320 mmol ഉം) അടങ്ങിയ പ്രീ-ഇൻകുബേഷൻ ചേമ്പറിലേക്ക് മാറ്റുക.
ഇമേജിംഗ് പ്രക്രിയയ്ക്കിടെ, സ്ലൈസുകൾ ഒരു പ്രത്യേക ഇമേജിംഗ് മുറിയിലേക്ക് മാറ്റി, 32° മുതൽ 33°C വരെയുള്ള സ്ഥിരമായ താപനിലയിൽ തുടർച്ചയായ ACSF പെർഫ്യൂഷനിൽ പരീക്ഷണം നടത്തി. ലെയ്‌ക 25x ഒബ്ജക്റ്റീവ് ലെൻസ് (NA 0.95, വെള്ളം), Ti: സഫയർ ലേസർ (ചാമിലിയൻ വിഷൻ II, കോഹെറന്റ്) എന്നിവ ഘടിപ്പിച്ച ഒരു മൾട്ടിഫോട്ടോൺ ലേസർ സ്കാനിംഗ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് (TCS SP8 MP-OPO, ലെയ്‌ക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ്) സ്ലൈസ് ഇമേജിംഗിനായി ഉപയോഗിച്ചു. FLIM മൊഡ്യൂൾ (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 ന്റെ FLIM. സാഗിറ്റൽ ബ്രെയിൻ സ്ലൈസുകളിലെ ടു-ഫോട്ടോൺ FLIM ഉപയോഗിച്ചാണ് PN-കളുടെ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് റെഡോക്സ് അവസ്ഥയിലെ മാറ്റങ്ങൾ അളന്നത്, അവിടെ Grx1-roGFP2 ബയോസെൻസർ PN-കളെ ലക്ഷ്യം വച്ചുള്ളതാണ്. PN ലെയറിൽ, സ്ലൈസ് ഉപരിതലത്തിന് ഏകദേശം 50 മുതൽ 80 μm വരെ താഴെയായി അക്വിസിഷൻ ഫീൽഡ് തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെടുന്നു, ഇത് ഒരു പ്രായോഗിക PN (അതായത്, ബീഡ് ഘടനയുടെ അഭാവം അല്ലെങ്കിൽ ഡെൻഡ്രൈറ്റുകളിൽ ന്യൂറോണൽ മോർഫോളജിക്കൽ മാറ്റങ്ങൾ) ഉണ്ടെന്നും ഇരട്ട പോസിറ്റീവ് roGFP2 സെൻസറും AAV എൻകോഡിംഗ് shRNA PCx അല്ലെങ്കിൽ അതിന്റെ നിയന്ത്രണ ശ്രേണി (ഓരോന്നും സഹ-പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന mCherry) ഉണ്ടെന്നും ഉറപ്പാക്കുന്നു. 2x ഡിജിറ്റൽ സൂം ഉപയോഗിച്ച് സിംഗിൾ-സ്റ്റാക്ക് ചിത്രങ്ങൾ ശേഖരിക്കുക [ഉത്തേജന തരംഗദൈർഘ്യം: 890 nm; 512 nm 512 പിക്സലുകൾ]. കണ്ടെത്തൽ: ആന്തരിക ഹൈഡ്രോഹൈഡ്രജൻ ഡൈ ലഭിച്ച ഫലങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിന് FLIMfit 5.1.1 സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിക്കുക, മുഴുവൻ ചിത്രത്തിന്റെയും സിംഗിൾ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഡീകേ കർവ് അളന്ന IRF (ഇൻസ്ട്രുമെന്റ് റെസ്‌പോൺസ് ഫംഗ്‌ഷൻ) ലേക്ക് ഘടിപ്പിക്കുക, χ2 ഏകദേശം 1 ആണ്. ഒരു PN-ന്റെ ആയുസ്സ് കണക്കാക്കാൻ, നാഡി ബോഡിക്ക് ചുറ്റുമുള്ള മാസ്‌ക് സ്വമേധയാ വരച്ചു, ഓരോ മാസ്‌കിലെയും ശരാശരി ആയുസ്സ് അളവെടുപ്പിനായി ഉപയോഗിച്ചു.
മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ പൊട്ടൻഷ്യൽ വിശകലനം. പെർഫ്യൂസ് ചെയ്ത ACSF-ലേക്ക് നേരിട്ട് ചേർത്ത 100 nM TMRM ഉപയോഗിച്ച് അക്യൂട്ട് സെക്ഷൻ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത ശേഷം, രണ്ട്-ഫോട്ടോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് PN-കളുടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പൊട്ടൻഷ്യൽ മാറ്റങ്ങൾ അളന്നു. 920 nm-ൽ പ്രോബിനെ ഉത്തേജിപ്പിച്ച് ആന്തരിക HyD (ടെട്രാമെതൈൽറോഡാമൈൻ ഐസോത്തിയോസയനേറ്റ്: 585/40 nm) ഉപയോഗിച്ച് സിഗ്നലുകൾ ശേഖരിച്ചാണ് TMRM ഇമേജിംഗ് നടത്തിയത്; അതേ എക്‌സൈറ്റേഷൻ തരംഗദൈർഘ്യം ഉപയോഗിച്ചും എന്നാൽ mtYFP ഇമേജ് ചെയ്യുന്നതിന് വ്യത്യസ്തമായ ഒരു ആന്തരിക HyD (FITC :525/50) ഉപയോഗിച്ചും. സിംഗിൾ സെൽ തലത്തിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പൊട്ടൻഷ്യൽ വിലയിരുത്തുന്നതിന് ImageJ-യുടെ ഇമേജ് കാൽക്കുലേറ്റർ പ്ലഗ്-ഇൻ ഉപയോഗിക്കുക. ചുരുക്കത്തിൽ, പ്ലഗ്-ഇൻ സമവാക്യം: സിഗ്നൽ = മിനിറ്റ് (mtYFP, TMRM) അനുബന്ധ ചാനലിന്റെ സിംഗിൾ-സ്റ്റാക്ക് കൺഫോക്കൽ ഇമേജിൽ പുർക്കിൻജെ സോമാലിയിൽ TMRM സിഗ്നൽ കാണിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മേഖല തിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു. തുടർന്ന് ലഭിക്കുന്ന മാസ്കിലെ പിക്സൽ ഏരിയ അളക്കുകയും, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പൊട്ടൻഷ്യൽ കാണിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്രാക്ഷൻ ലഭിക്കുന്നതിന് mtYFP ചാനലിന്റെ അനുബന്ധ ത്രെഷോൾഡ് സിംഗിൾ-സ്റ്റാക്ക് ഇമേജിൽ നോർമലൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.
ഹ്യൂജൻസ് പ്രോ (സയന്റിഫിക് വോളിയം ഇമേജിംഗ്) സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ചാണ് ചിത്രം ഡീകൺവോൾവ് ചെയ്തത്. ടൈലുകളുടെ സ്കാൻ ചെയ്ത ചിത്രങ്ങൾക്കായി, LAS-X സോഫ്റ്റ്‌വെയർ നൽകുന്ന ഓട്ടോമാറ്റിക് സ്റ്റിച്ചിംഗ് അൽഗോരിതം ഉപയോഗിച്ചാണ് ഒരൊറ്റ ടൈലിന്റെ മോണ്ടേജ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്. ഇമേജ് കാലിബ്രേഷനുശേഷം, ഇമേജ് കൂടുതൽ പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നതിനും തെളിച്ചവും ദൃശ്യതീവ്രതയും ഏകീകൃതമായി ക്രമീകരിക്കുന്നതിനും ഇമേജ്ജെ, അഡോബ് ഫോട്ടോഷോപ്പ് എന്നിവ ഉപയോഗിക്കുക. ഗ്രാഫിക് തയ്യാറെടുപ്പിനായി അഡോബ് ഇല്ലസ്ട്രേറ്റർ ഉപയോഗിക്കുക.
mtDNA ഫോക്കസ് വിശകലനം. കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് DNA യ്‌ക്കെതിരായ ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്ത സെറിബെല്ലാർ വിഭാഗങ്ങളിൽ mtDNA നിഖേദങ്ങളുടെ എണ്ണം കണക്കാക്കി. ഓരോ ലക്ഷ്യ പ്രദേശവും കോശശരീരത്തിനും ഓരോ കോശത്തിന്റെയും ന്യൂക്ലിയസിനും വേണ്ടി സൃഷ്ടിക്കപ്പെട്ടു, മൾട്ടി മെഷർ പ്ലഗ്-ഇൻ (ഇമേജ്ജെ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ) ഉപയോഗിച്ച് അതത് പ്രദേശം കണക്കാക്കി. സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ഏരിയ ലഭിക്കുന്നതിന് സെൽ ബോഡി ഏരിയയിൽ നിന്ന് ന്യൂക്ലിയർ ഏരിയ കുറയ്ക്കുക. അവസാനമായി, ത്രെഷോൾഡ് ഇമേജിൽ mtDNA സൂചിപ്പിക്കുന്ന സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ഡിഎൻഎ പോയിന്റുകൾ യാന്ത്രികമായി അളക്കാൻ അനലൈസ് പാർട്ടിക്കിൾസ് പ്ലഗ്-ഇൻ (ഇമേജ്ജെ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ) ഉപയോഗിച്ചു, ലഭിച്ച ഫലങ്ങൾ CTRL എലികളുടെ PN ശരാശരിയിലേക്ക് സാധാരണവൽക്കരിച്ചു. ഓരോ സെല്ലിലും ന്യൂക്ലിയോസൈഡുകളുടെ ശരാശരി എണ്ണമായി ഫലങ്ങൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.
പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം. സിംഗിൾ സെൽ തലത്തിൽ PN-ലെ പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിലയിരുത്താൻ ImageJ-യുടെ ഇമേജ് കാൽക്കുലേറ്റർ പ്ലഗ്-ഇൻ ഉപയോഗിക്കുക. ചുരുക്കത്തിൽ, അനുബന്ധ ചാനലിന്റെ സിംഗിൾ-ലെയർ കോൺഫോക്കൽ ഇമേജിൽ, സമവാക്യം വഴി: സിഗ്നൽ = മിനിറ്റ് (mtYFP, ആന്റിബോഡി), പുർക്കിനയിലെ ഒരു പ്രത്യേക ആന്റിബോഡിക്ക് രോഗപ്രതിരോധശേഷി കാണിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മേഖല തിരിച്ചറിയുന്നു. തുടർന്ന് ഫലമായുണ്ടാകുന്ന മാസ്കിലെ പിക്സൽ ഏരിയ അളക്കുകയും, തുടർന്ന് പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീന്റെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ അംശം ലഭിക്കുന്നതിന് mtYFP ചാനലിന്റെ അനുബന്ധ ത്രെഷോൾഡ് സിംഗിൾ-സ്റ്റാക്ക് ഇമേജിൽ നോർമലൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.
പുർക്കിൻജെ സെൽ സാന്ദ്രത വിശകലനം. ഇമേജ്ജെയുടെ സെൽ കൗണ്ടർ പ്ലഗ്-ഇൻ ഉപയോഗിച്ച് പുർക്കിൻജെ സെല്ലുകളുടെ എണ്ണത്തെ എണ്ണപ്പെട്ട കോശങ്ങൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്ന സെറിബെല്ലാർ വളയത്തിന്റെ നീളം കൊണ്ട് ഹരിച്ചാണ് പുർക്കിൻജെ സാന്ദ്രത വിലയിരുത്തിയത്.
സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കലും ശേഖരണവും. കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പിൽ നിന്നും Mfn2cKO എലികളിൽ നിന്നുമുള്ള തലച്ചോറുകൾ 0.1 M ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫറിൽ (PB) 2% PFA/2.5% ഗ്ലൂട്ടറാൾഡിഹൈഡിൽ ഉറപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് സിലിയേറ്റുകൾ (Leica Mikrosysteme GmbH, വിയന്ന, ഓസ്ട്രിയ) ഉപയോഗിച്ച് കൊറോണൽ വിഭാഗങ്ങൾ തയ്യാറാക്കി (കനം 50 മുതൽ 60 μm വരെ). തുടർന്ന് 1% os ടെട്രാക്സൈഡിലും 1.5% പൊട്ടാസ്യം ഫെറോസയനൈഡിലും മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ PB ബഫറിൽ ഉറപ്പിച്ചു. ഭാഗങ്ങൾ മൂന്ന് തവണ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ കഴുകി, തുടർന്ന് 1% യുറാനൈൽ അസറ്റേറ്റ് അടങ്ങിയ 70% എത്തനോൾ ഉപയോഗിച്ച് 20 മിനിറ്റ് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. പിന്നീട് ഭാഗങ്ങൾ ഗ്രേഡഡ് ആൽക്കഹോളിൽ നിർജ്ജലീകരണം ചെയ്ത് സിലിക്കൺ പൂശിയ ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡുകൾക്കിടയിൽ ഡർക്കുപാൻ ACM (അരാൾഡൈറ്റ് കാസ്റ്റിംഗ് റെസിൻ M) എപ്പോക്സി റെസിനിൽ (ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി സയൻസസ്, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ 14040) ഉൾപ്പെടുത്തി, ഒടുവിൽ 60°C യിൽ 48 മണിക്കൂർ അടുപ്പിൽ പോളിമറൈസ് ചെയ്തു. സെറിബെല്ലാർ കോർട്ടെക്സ് ഏരിയ തിരഞ്ഞെടുത്ത് ലെയ്‌ക അൾട്രാകട്ടിൽ (ലെയ്‌ക മൈക്രോസിസ്റ്റം ജിഎംബിഎച്ച്, വിയന്ന, ഓസ്ട്രിയ) 50 എൻഎം അൾട്രാതിൻ ഭാഗങ്ങൾ മുറിച്ച് പോളിസ്റ്റൈറൈൻ ഫിലിം കൊണ്ട് പൊതിഞ്ഞ 2×1 മില്ലീമീറ്റർ കോപ്പർ സ്ലിറ്റ് ഗ്രിഡിൽ തിരഞ്ഞെടുത്തു. H2O-യിൽ 4% യുറാനൈൽ അസറ്റേറ്റ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് 10 മിനിറ്റ് നേരം ഭാഗങ്ങൾ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു, H2O പലതവണ കഴുകി, തുടർന്ന് H2O-യിൽ റെയ്നോൾഡ്സ് ലെഡ് സിട്രേറ്റ് 10 മിനിറ്റ് കഴുകി, തുടർന്ന് H2O ഉപയോഗിച്ച് പലതവണ കഴുകി. ടിവിഐപിഎസ് (ടൈറ്റ്സ് വീഡിയോ ആൻഡ് ഇമേജ് പ്രോസസ്സിംഗ് സിസ്റ്റം) ടെംകാം-എഫ് 416 ഡിജിറ്റൽ ക്യാമറ (ടിവിഐപിഎസ് ജിഎംബിഎച്ച്, ഗൗട്ടിംഗ്, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഫിലിപ്സ് സിഎം 100 (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, വാൾത്താം, എംഎ, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ എടുത്തു. ജർമ്മനി).
AAV ബാധിച്ച എലികൾക്ക്, തലച്ചോറിനെ വേർതിരിച്ച് 1 mm കട്ടിയുള്ള ഒരു സാഗിറ്റൽ വിഭാഗമാക്കി മുറിച്ചു, AAV-ബാധിച്ച വളയം (അതായത്, mCherry എക്സ്പ്രസ്സിംഗ്) തിരിച്ചറിയാൻ ഒരു ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് സെറിബെല്ലം പരിശോധിച്ചു. കുറഞ്ഞത് രണ്ട് തുടർച്ചയായ സെറിബെല്ലാർ വളയങ്ങളിൽ Purkinje സെൽ പാളിയുടെ (അതായത് മിക്കവാറും മുഴുവൻ പാളിയുടെയും) വളരെ ഉയർന്ന ട്രാൻസ്ഡക്ഷൻ കാര്യക്ഷമതയിൽ AAV കുത്തിവയ്പ്പ് കലാശിക്കുന്ന പരീക്ഷണങ്ങൾ മാത്രമേ ഉപയോഗിക്കുന്നുള്ളൂ. AAV-ട്രാൻസ്ഡ്യൂസ്ഡ് ലൂപ്പ് ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് പോസ്റ്റ്-ഫിക്സേഷനായി മൈക്രോഡിസെക്റ്റ് ചെയ്തു (0.1 M കൊക്കോട്ട് ബഫറിൽ 4% PFA ഉം 2.5% ഗ്ലൂട്ടറാൾഡിഹൈഡും) കൂടുതൽ പ്രോസസ്സ് ചെയ്തു. EPON ഉൾച്ചേർക്കലിനായി, ഫിക്സഡ് ടിഷ്യു 0.1 M സോഡിയം കൊക്കോട്ട് ബഫർ (Applichem) ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, 0.1 M സോഡിയം കൊക്കോട്ട് ബഫറിൽ (Applichem) 4 മണിക്കൂർ 2% OsO4 (os, സയൻസ് സർവീസസ്; Caco) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് 2 മണിക്കൂർ കഴുകി. 0.1 M കൊക്കമൈഡ് ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ ആവർത്തിക്കുക. തുടർന്ന്, ഓരോ എത്തനോൾ ലായനിയും 4°C-ൽ 15 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത് ടിഷ്യുവിനെ നിർജ്ജലീകരണം ചെയ്യാൻ എത്തനോളിന്റെ ആരോഹണ ശ്രേണി ഉപയോഗിച്ചു. ടിഷ്യു പ്രൊപിലീൻ ഓക്സൈഡിലേക്ക് മാറ്റി, 4°C-ൽ EPON (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്)-ൽ രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. മുറിയിലെ താപനിലയിൽ പുതിയ EPON-ൽ 2 മണിക്കൂർ ടിഷ്യു വയ്ക്കുക, തുടർന്ന് 62°C-ൽ 72 മണിക്കൂർ ഉൾപ്പെടുത്തുക. 70 nm അൾട്രാതിൻ ഭാഗങ്ങൾ മുറിക്കാൻ ഒരു അൾട്രാമൈക്രോടോമും (ലൈക്ക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ്, UC6) ഒരു ഡയമണ്ട് കത്തിയും (ഡയറ്റോം, ബീൽ, സ്വിറ്റ്സർലൻഡ്) ഉപയോഗിക്കുക, 37°C-ൽ 15 മിനിറ്റ് 1.5% യുറാനൈൽ അസറ്റേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുക, 4 മിനിറ്റ് ലെഡ് സിട്രേറ്റ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുക. ക്യാമറ വൺവ്യൂ 4K 16-ബിറ്റ് (ഗറ്റാൻ), ഡിജിറ്റൽ മൈക്രോഗ്രാഫ് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (ഗറ്റാൻ) എന്നിവ സജ്ജീകരിച്ച ഒരു JEM-2100 പ്ലസ് ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പ് (JEOL) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ എടുത്തത്. വിശകലനത്തിനായി, 5000× അല്ലെങ്കിൽ 10,000× ഡിജിറ്റൽ സൂം ഉപയോഗിച്ച് ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ നേടി.
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ രൂപാന്തര വിശകലനം. എല്ലാ വിശകലനങ്ങൾക്കും, ഇമേജ്ജെ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് ഡിജിറ്റൽ ഇമേജുകളിൽ വ്യക്തിഗത മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ രൂപരേഖകൾ സ്വമേധയാ രൂപപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. വ്യത്യസ്ത രൂപാന്തര പാരാമീറ്ററുകൾ വിശകലനം ചെയ്യുന്നു. ഓരോ കോശത്തിന്റെയും മൊത്തം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വിസ്തീർണ്ണത്തെ സൈറ്റോപ്ലാസ്ം വിസ്തീർണ്ണം (സൈറ്റോപ്ലാസം വിസ്തീർണ്ണം = സെൽ ഏരിയ-സെൽ ന്യൂക്ലിയസ് ഏരിയ) × 100 കൊണ്ട് ഹരിച്ചാൽ ലഭിക്കുന്ന ഒരു ശതമാനമായാണ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സാന്ദ്രത പ്രകടിപ്പിക്കുന്നത്. [4π (ഏരിയ/ചുറ്റളവ് 2)] എന്ന ഫോർമുല ഉപയോഗിച്ച് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ വൃത്താകൃതി കണക്കാക്കുന്നു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ ഇസ്റ്റ രൂപഘടന വിശകലനം ചെയ്യുകയും അവയുടെ പ്രധാന ആകൃതികൾക്കനുസരിച്ച് രണ്ട് വിഭാഗങ്ങളായി ("ട്യൂബുലാർ", "ബ്ലിസ്റ്റർ") വിഭജിക്കുകയും ചെയ്തു.
ഓട്ടോഫാഗോസോം/ലൈസോസോം സംഖ്യയും സാന്ദ്രതയും വിശകലനം ചെയ്യുക. ഡിജിറ്റൽ ഇമേജിൽ ഓരോ ഓട്ടോഫാഗോസോമിന്റെയും/ലൈസോസോമിന്റെയും രൂപരേഖകൾ സ്വമേധയാ രൂപപ്പെടുത്താൻ ഇമേജ്ജെ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിക്കുക. ഓരോ കോശത്തിന്റെയും മൊത്തം ഓട്ടോഫാഗോസോം/ലൈസോസോം ഘടന വിസ്തീർണ്ണത്തെ സൈറ്റോപ്ലാസ്ം ഏരിയ (സൈറ്റോപ്ലാസ്ം ഏരിയ=സെൽ ഏരിയ-ന്യൂക്ലിയസ് ഏരിയ) × 100 കൊണ്ട് ഹരിച്ചാണ് ഓട്ടോഫാഗോസോമുകൾ/ലൈസോസോമുകളുടെ വിസ്തീർണ്ണം കണക്കാക്കുന്നത്. ഓരോ കോശത്തിനും ഉള്ള ഓട്ടോഫാഗോസോം/ലൈസോസോം ഘടനകളുടെ എണ്ണം (സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ഏരിയയുടെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ) (സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ഏരിയ = സെൽ ഏരിയ-ന്യൂക്ലിയർ ഏരിയ) കൊണ്ട് മൊത്തം സംഖ്യയെ ഹരിച്ചാണ് ഓട്ടോഫാഗോസോമുകളുടെ/ലൈസോസോമുകളുടെ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കുന്നത്.
അക്യൂട്ട് സെക്ഷനിംഗിനും സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കലിനും വേണ്ടിയുള്ള ലേബലിംഗ്. ഗ്ലൂക്കോസ് ലേബലിംഗ് ആവശ്യമുള്ള പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക്, അക്യൂട്ട് ബ്രെയിൻ സ്ലൈസുകൾ ഒരു പ്രീ-ഇൻകുബേഷൻ ചേമ്പറിലേക്ക് മാറ്റുക, അതിൽ പൂരിത കാർബൺ (95% O2 ഉം 5% CO2 ഉം), ഉയർന്ന Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM d-ഗ്ലൂക്കോസ്, 1.0 mM CaCl 2 ഉം 2.0 mM MgCl 2 ഉം, pH 7.4 ഉം 310 മുതൽ 320 mOsm ഉം ആയി ക്രമീകരിച്ചിരിക്കുന്നു), അതിൽ ഗ്ലൂക്കോസ് 13 C ആണ് 6- ഗ്ലൂക്കോസ് പകരം വയ്ക്കൽ (യൂറിസോടോപ്പ്, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ CLM-1396). പൈറുവേറ്റ് ലേബലിംഗ് ആവശ്യമുള്ള പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക്, അക്യൂട്ട് ബ്രെയിൻ സ്ലൈസുകളെ ഉയർന്ന Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ഗ്ലൂക്കോസ്, 1.0 mM CaCl2 എന്നിവയിലേക്ക് മാറ്റുക, 2.0mM MgCl2 ചേർക്കുക, pH 7.4 ഉം 310 മുതൽ 320mOsm വരെ ക്രമീകരിക്കുക), കൂടാതെ 1mM 1-[1-13C] പൈറുവേറ്റ് ചേർക്കുക (യൂറിസോടോപ്പ്, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ CLM-1082). 37°C-ൽ 90 മിനിറ്റ് സെക്ഷനുകൾ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. പരീക്ഷണത്തിന്റെ അവസാനം, സെക്ഷനുകൾ 75 mM അമോണിയം കാർബണേറ്റ് അടങ്ങിയ ഒരു ജലീയ ലായനി (pH 7.4) ഉപയോഗിച്ച് വേഗത്തിൽ കഴുകി, തുടർന്ന് 40:40:20 (v:v:v) അസെറ്റോണിട്രൈൽ (ACN): മെഥനോൾ: വെള്ളം എന്നിവയിൽ ഹോമോജനൈസ് ചെയ്തു. ഭാഗങ്ങൾ 30 മിനിറ്റ് ഐസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത ശേഷം, സാമ്പിളുകൾ 21,000 ഗ്രാം താപനിലയിൽ 10 മിനിറ്റ് 4°C താപനിലയിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് വ്യക്തമായ സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ഒരു സ്പീഡ്വാക് കോൺസെൻട്രേറ്ററിൽ ഉണക്കി. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ഉണങ്ങിയ മെറ്റാബോലൈറ്റ് പെല്ലറ്റ് വിശകലനം വരെ -80°C താപനിലയിൽ സൂക്ഷിച്ചു.
13 സി-ലേബൽ ചെയ്ത അമിനോ ആസിഡുകളുടെ ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി-മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി വിശകലനം. ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി-മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (LC-MS) വിശകലനത്തിനായി, മെറ്റാബോലൈറ്റ് പെല്ലറ്റ് 75μl LC-MS ഗ്രേഡ് വെള്ളത്തിൽ (ഹണിവെൽ) വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു. 4°C-ൽ 21,000 ഗ്രാം സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷന് ശേഷം, 20 μl ക്ലാരിഫൈഡ് സൂപ്പർനേറ്റന്റ് അമിനോ ആസിഡ് ഫ്ലക്സ് വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിച്ചു, ബാക്കിയുള്ള സത്ത് ഉടൻ തന്നെ അയോൺ വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിച്ചു (താഴെ കാണുക). മുമ്പ് വിവരിച്ച ബെൻസോയിൽ ക്ലോറൈഡ് ഡെറിവേറ്റൈസേഷൻ പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗിച്ച് അമിനോ ആസിഡ് വിശകലനം നടത്തി (55, 56). ആദ്യ ഘട്ടത്തിൽ, 10μl 100 mM സോഡിയം കാർബണേറ്റ് (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) 20μl മെറ്റാബോലൈറ്റ് സത്തിൽ ചേർത്തു, തുടർന്ന് 10μl 2% ബെൻസോയിൽ ക്ലോറൈഡ് (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) എൽസി ഗ്രേഡ് ACN-ലേക്ക് ചേർത്തു. സാമ്പിൾ ചുരുക്കമായി വോർട്ടെക്സ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് 21,000 ഗ്രാം താപനിലയിൽ 5 മിനിറ്റ് 20°C-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. ക്ലിയർ ചെയ്ത സൂപ്പർനേറ്റന്റിനെ ഒരു കോണാകൃതിയിലുള്ള ഗ്ലാസ് ഇൻസേർട്ട് (200 μl വോളിയം) ഉപയോഗിച്ച് 2 മില്ലി ഓട്ടോസാംപ്ലർ വിയലിലേക്ക് മാറ്റുക. Q-Exactive (QE)-HF (അൾട്രാ ഹൈ ഫീൽഡ് ഓർബിട്രാപ്പ്) ഹൈ-റെസല്യൂഷൻ പ്രിസിഷൻ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററുമായി (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന അക്വിറ്റി ഐക്ലാസ് അൾട്രാ-ഹൈ പെർഫോമൻസ് എൽസി സിസ്റ്റം (വാട്ടേഴ്സ്) ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു. വിശകലനത്തിനായി, ഡെറിവേറ്റൈസ് ചെയ്ത സാമ്പിളിന്റെ 2μl 1.8μm കണികകൾ അടങ്ങിയ 100×1.0 mm ഹൈ-സ്ട്രെങ്ത് സിലിക്ക T3 കോളത്തിലേക്ക് (വാട്ടേഴ്സ്) കുത്തിവച്ചു. ഫ്ലോ റേറ്റ് 100μl/മിനിറ്റ് ആണ്, ബഫർ സിസ്റ്റത്തിൽ ബഫർ A (10 mM അമോണിയം ഫോർമാറ്റും വെള്ളത്തിൽ 0.15% ഫോർമിക് ആസിഡും) ബഫർ B (ACN) എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ഗ്രേഡിയന്റ് ഇപ്രകാരമാണ്: 0 മിനിറ്റിൽ 0%B; 0%B. 0 മുതൽ 0.1 മിനിറ്റ് വരെ 0 മുതൽ 15% B വരെ; 0.1 മുതൽ 0.5 മിനിറ്റ് വരെ 15 മുതൽ 17% B വരെ; 0.5 മുതൽ 14 മിനിറ്റ് വരെ 17 മുതൽ 55% വരെ B വരെ; 14 മുതൽ 14.5 മിനിറ്റ് വരെ 55 മുതൽ 70% വരെ B വരെ; 18 മിനിറ്റ് വരെ 14.5 മുതൽ 70 മുതൽ 100% വരെ B വരെ; 18 മുതൽ 19 മിനിറ്റ് വരെ 100% B വരെ; 19 മുതൽ 19.1 മിനിറ്റ് വരെ 100 മുതൽ 0% B വരെ; 19.1 മുതൽ 28 മിനിറ്റ് വരെ 0% B വരെ (55, 56). QE-HF മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ പോസിറ്റീവ് അയോണൈസേഷൻ മോഡിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു, അതിന്റെ പിണ്ഡം m/z (മാസ്/ചാർജ് അനുപാതം) 50 മുതൽ 750 വരെയാണ്. പ്രയോഗിച്ച റെസല്യൂഷൻ 60,000 ആണ്, ലഭിച്ച ഗെയിൻ കൺട്രോൾ (AGC) അയോൺ ലക്ഷ്യം 3×106 ആണ്, പരമാവധി അയോൺ സമയം 100 മില്ലിസെക്കൻഡ് ആണ്. ചൂടാക്കിയ ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോണൈസേഷൻ (ESI) സ്രോതസ്സ് 3.5 kV സ്പ്രേ വോൾട്ടേജിലും, 250°C കാപ്പിലറി താപനിലയിലും, 60AU (ആർബിട്രറി യൂണിറ്റുകൾ) ഷീറ്റ് എയർഫ്ലോയിലും, 20AU ഓക്സിലറി എയർഫ്ലോയിലും പ്രവർത്തിക്കുന്നു. 250°C. S ലെൻസ് 60AU ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.
13C ലേബൽ ചെയ്ത ഓർഗാനിക് ആസിഡുകളുടെ അനിയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി-എംഎസ് വിശകലനം. ശേഷിക്കുന്ന മെറ്റാബോലൈറ്റ് അവക്ഷിപ്തം (55μl) ഒരു QE-HF മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററുമായി (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു ഡയോനെക്സ് അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി സിസ്റ്റം (ICS 5000+, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. ചുരുക്കത്തിൽ, 5μl മെറ്റാബോലൈറ്റ് സത്ത് HPLC (2 mm×250 mm, കണികാ വലിപ്പം 4μm, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു ഡയോനെക്സ് അയോൺപാക് AS11-HC നിരയിലേക്ക് 1 എന്ന ഫില്ലിംഗ് അനുപാതത്തിൽ പുഷ്-ഇൻ ഭാഗിക ലൂപ്പ് മോഡിൽ കുത്തിവച്ചു. ) ഡയോനെക്സ് അയോൺപാക് AG11-HC ഗാർഡ് കോളം (2 mm x 50 mm, 4μm, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്). കോളം താപനില 30°C-ൽ നിലനിർത്തുന്നു, കൂടാതെ ഓട്ടോസാംപ്ലർ 6°C ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിൽ നൽകിയിരിക്കുന്ന ഒരു പൊട്ടാസ്യം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ് കാട്രിഡ്ജ് ഉപയോഗിച്ച് എലുയന്റ് ജനറേറ്ററിലൂടെ ഒരു പൊട്ടാസ്യം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ് ഗ്രേഡിയന്റ് സൃഷ്ടിക്കുക. 380μl/മിനിറ്റ് എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ മെറ്റബോളൈറ്റുകളെ വേർതിരിക്കുന്നു, ഇനിപ്പറയുന്ന ഗ്രേഡിയന്റ് പ്രയോഗിക്കുന്നു: 0 മുതൽ 3 മിനിറ്റ് വരെ, 10 mM KOH; 3 മുതൽ 12 മിനിറ്റ് വരെ, 10 മുതൽ 50 mM KOH; 12 മുതൽ 19 മിനിറ്റ് വരെ, 50 മുതൽ 100 ​​mM KOH; 19 മുതൽ 21 മിനിറ്റ് വരെ, 100 mM KOH; 21 മുതൽ 21.5 മിനിറ്റ് വരെ, 100 മുതൽ 10 mM KOH വരെ. 8.5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് കോളം 10 mM KOH-ൽ പുനഃസന്തുലിതമാക്കി.
കോളത്തിന് ശേഷം എലുട്ടെഡ് മെറ്റബോളൈറ്റുകളെ 150μl/മിനിറ്റ് ഐസോപ്രൊപ്പനോൾ സപ്ലിമെന്റ് സ്ട്രീമുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് നെഗറ്റീവ് അയോണൈസേഷൻ മോഡിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്ന ഒരു ഉയർന്ന റെസല്യൂഷൻ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. 60,000 റെസല്യൂഷനോടെ m/z 50 മുതൽ 750 വരെയുള്ള മാസ് ശ്രേണി MS നിരീക്ഷിക്കുന്നു. AGC 1×106 ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു, പരമാവധി അയോൺ സമയം 100 ms ആയി നിലനിർത്തുന്നു. ചൂടാക്കിയ ESI സ്രോതസ്സ് 3.5 kV യുടെ സ്പ്രേ വോൾട്ടേജിൽ പ്രവർത്തിപ്പിച്ചു. അയോൺ സ്രോതസ്സിന്റെ മറ്റ് ക്രമീകരണങ്ങൾ ഇപ്രകാരമാണ്: കാപ്പിലറി താപനില 275°C; ഷീറ്റ് ഗ്യാസ് ഫ്ലോ, 60 AU; ഓക്സിലറി ഗ്യാസ് ഫ്ലോ, 300°C-ൽ 20 AU, S ലെൻസ് സജ്ജീകരണം 60 AU ആയി.
13C ലേബൽ ചെയ്ത മെറ്റബോളൈറ്റുകളുടെ ഡാറ്റ വിശകലനം. ഐസോടോപ്പ് അനുപാതത്തിന്റെ ഡാറ്റ വിശകലനത്തിനായി ട്രേസ്ഫൈൻഡർ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (പതിപ്പ് 4.2, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിക്കുക. ഓരോ സംയുക്തത്തിന്റെയും ഐഡന്റിറ്റി വിശ്വസനീയമായ ഒരു റഫറൻസ് സംയുക്തം പരിശോധിച്ച് സ്വതന്ത്രമായി വിശകലനം ചെയ്തു. ഐസോടോപ്പ് സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം നടത്തുന്നതിന്, ഓരോ 13C ഐസോടോപ്പിന്റെയും (Mn) വേർതിരിച്ചെടുത്ത അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാമിന്റെ (XIC) വിസ്തീർണ്ണം [M + H] + ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്തു, ഇവിടെ n എന്നത് ടാർഗെറ്റ് സംയുക്തത്തിന്റെ കാർബൺ സംഖ്യയാണ്, അമിനോ ആസിഡുകൾ വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു അല്ലെങ്കിൽ [MH] + അയോണുകൾ വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു. XIC യുടെ പിണ്ഡ കൃത്യത ദശലക്ഷത്തിൽ അഞ്ച് ഭാഗങ്ങളിൽ താഴെയാണ്, കൂടാതെ RT യുടെ കൃത്യത 0.05 മിനിറ്റാണ്. കണ്ടെത്തിയ ഓരോ ഐസോടോപ്പിന്റെയും അനുപാതം അനുബന്ധ സംയുക്തത്തിന്റെ എല്ലാ ഐസോടോപ്പുകളുടെയും ആകെത്തുകയുമായി കണക്കാക്കിയാണ് സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം നടത്തുന്നത്. ഈ അനുപാതങ്ങൾ ഓരോ ഐസോടോപ്പിനും ശതമാനം മൂല്യങ്ങളായി നൽകിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഫലങ്ങൾ മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ മോളാർ ശതമാനം സമ്പുഷ്ടീകരണം (MPE) ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു (42).
ശീതീകരിച്ച ന്യൂറോൺ പെല്ലറ്റിനെ ഐസ്-കോൾഡ് 80% മെഥനോൾ (v/v) ഉപയോഗിച്ച് ഏകീകൃതമാക്കി, വോർടെക്സ് ചെയ്ത്, -20°C-ൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. സാമ്പിൾ വീണ്ടും വോർടെക്സ് ചെയ്ത് +4°C-ൽ 30 മിനിറ്റ് ഇളക്കുക. സാമ്പിൾ 21,000 ഗ്രാം താപനിലയിൽ 4°C-ൽ 5 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് ലഭിച്ച സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ശേഖരിച്ച് 25°C-ൽ ഒരു സ്പീഡ്വാക് കോൺസെൻട്രേറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് തുടർന്നുള്ള വിശകലനത്തിനായി ഉണക്കി. മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ, തരംതിരിച്ച കോശങ്ങളുടെ അമിനോ ആസിഡുകളിൽ LC-MS വിശകലനം നടത്തി. ട്രേസ്ഫൈൻഡർ (പതിപ്പ് 4.2, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ച്, ഓരോ സംയുക്തത്തിന്റെയും മോണോ ഐസോടോപ്പിക് പിണ്ഡം ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ വിശകലനം നടത്തി. പ്രീപ്രോസസ് കോർ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ പാക്കേജ് (57) ഉപയോഗിച്ച് മെറ്റാബോലൈറ്റ് ഡാറ്റയുടെ ക്വാണ്ടൈൽ നോർമലൈസേഷൻ നടത്തി.
സ്ലൈസ് തയ്യാറാക്കൽ. എലിയെ വേഗത്തിൽ കാർബൺ ഡൈ ഓക്സൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് അനസ്തേഷ്യ നൽകി ശിരഛേദം ചെയ്തു, തലയോട്ടിയിൽ നിന്ന് തലച്ചോറ് വേഗത്തിൽ നീക്കം ചെയ്തു, ഐസ് നിറച്ച വൈബ്രേറ്റിംഗ് കത്തി (HM-650 V, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, വാൾഡോർഫ്, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ച് അതിനെ 300 മുതൽ 375 μm വരെ സാഗിറ്റൽ ഭാഗങ്ങളായി മുറിച്ചു. തണുത്ത കാർബൺ ഗ്യാസിഫിക്കേഷൻ (95% O2 ഉം 5% CO2 ഉം) കുറഞ്ഞ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ഗ്ലൂക്കോസ്, 1.0 mM CaCl2 ഉം 6.0 mM MgCl2 ഉം pH 7.4 ഉം 310 മുതൽ 330 mOsm ഉം ആയി ക്രമീകരിക്കുക). ലഭിച്ച ബ്രെയിൻ സ്ലൈസുകൾ ഉയർന്ന Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ഗ്ലൂക്കോസ്, 4.0 mM CaCl2, mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ഉം 310 മുതൽ 320 mOsm ഉം അടങ്ങിയ ഒരു ചേമ്പറിലേക്ക് മാറ്റുക. റെക്കോർഡിംഗിന് മുമ്പ് പുനഃസ്ഥാപിക്കാൻ കഴിയുന്ന തരത്തിൽ കഷ്ണങ്ങൾ 20 മുതൽ 30 മിനിറ്റ് വരെ സൂക്ഷിക്കുക.
റെക്കോർഡിംഗ്. എല്ലാ റെക്കോർഡിംഗുകൾക്കും ഒരു നിശ്ചിത റെക്കോർഡിംഗ് ചേമ്പറും 20x വാട്ടർ ഇമ്മേഴ്‌ഷൻ ഒബ്ജക്റ്റീവ് ലെൻസും (സയന്റിഫിക്ക) സജ്ജീകരിച്ച ഒരു മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഘട്ടം ഉപയോഗിച്ചു. (i) ശരീര വലുപ്പം, (ii) സെറിബെല്ലത്തിന്റെ ശരീരഘടനാപരമായ സ്ഥാനം, (iii) ഫ്ലൂറസെന്റ് mtYFP റിപ്പോർട്ടർ ജീനിന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ എന്നിവയാൽ പുർട്ടേറ്റീവ് പുർക്കിൻജെ സെല്ലുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. 5 മുതൽ 11 മെഗാഹോം വരെ ടിപ്പ് റെസിസ്റ്റൻസുള്ള പാച്ച് പൈപ്പറ്റ് ഒരു ബോറോസിലിക്കേറ്റ് ഗ്ലാസ് കാപ്പിലറി (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, സയൻസ് പ്രോഡക്റ്റ്സ്, ഹോഫ്ഹൈം, ജർമ്മനി) ഒരു തിരശ്ചീന പൈപ്പറ്റ് ഇൻസ്ട്രുമെന്റ്സ് (P-1000, സട്ടർ), നൊവാറ്റോ, CA) എന്നിവയാൽ പുറത്തെടുക്കുന്നു. എല്ലാ റെക്കോർഡിംഗുകളും ELC-03XS npi പാച്ച് ക്ലാമ്പ് ആംപ്ലിഫയർ (npi ഇലക്ട്രോണിക് GmbH, Tam, ജർമ്മനി) ആണ് നടത്തിയത്, ഇത് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ സിഗ്നൽ (പതിപ്പ് 6.0, കേംബ്രിഡ്ജ് ഇലക്ട്രോണിക്, കേംബ്രിഡ്ജ്, യുകെ) നിയന്ത്രിച്ചു. 12.5 kHz എന്ന സാമ്പിൾ നിരക്കിലാണ് പരീക്ഷണം രേഖപ്പെടുത്തിയത്. യഥാക്രമം 1.3 ഉം 10 kHz ഉം കട്ട്ഓഫ് ഫ്രീക്വൻസികളുള്ള രണ്ട് ഷോർട്ട്-പാസ് ബെസ്സൽ ഫിൽട്ടറുകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് സിഗ്നൽ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുന്നത്. മെംബ്രണിന്റെയും പൈപ്പറ്റിന്റെയും കപ്പാസിറ്റൻസ് ആംപ്ലിഫയർ ഉപയോഗിച്ചുള്ള നഷ്ടപരിഹാര സർക്യൂട്ട് വഴി നികത്തപ്പെടുന്നു. എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളും ഒരു ഓർക്ക-ഫ്ലാഷ് 4.0 ക്യാമറയുടെ (ഹമാമാറ്റ്സു, ഗെർഡൻ, ജർമ്മനി) നിയന്ത്രണത്തിലാണ് നടത്തിയത്, അത് ഹോകാവോ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (പതിപ്പ് 2.8, ഹമാമാറ്റ്സു, ഗെർഡൻ, ജർമ്മനി) നിയന്ത്രിച്ചിരുന്നു.
പതിവ് മുഴുവൻ സെൽ കോൺഫിഗറേഷനും വിശകലനവും. റെക്കോർഡിംഗിന് തൊട്ടുമുമ്പ്, ഇനിപ്പറയുന്ന പദാർത്ഥങ്ങൾ അടങ്ങിയ ആന്തരിക ലായനി ഉപയോഗിച്ച് പൈപ്പറ്റ് നിറയ്ക്കുക: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM പൊട്ടാസ്യം ഗ്ലൂക്കോണേറ്റ്, 10.0 mM ഹെപ്പസ്, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM ഗ്വാനോസിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് (GTP) (Na), 10.0 mM ക്രിയേറ്റിനിൻ ഫോസ്ഫേറ്റ് എന്നിവ pH 7.25 ആയി ക്രമീകരിച്ചു, ഓസ്മോട്ടിക് മർദ്ദം 290 mOsm (സുക്രോസ്) ആയിരുന്നു. മെംബ്രൺ വിണ്ടുകീറാൻ 0 pA ബലം പ്രയോഗിച്ച ഉടൻ, വിശ്രമ മെംബ്രൺ പൊട്ടൻഷ്യൽ അളന്നു. -40, -30, -20, -10 pA എന്നിവയുടെ ഹൈപ്പർപോളറൈസ്ഡ് വൈദ്യുതധാരകൾ പ്രയോഗിച്ചാണ് ഇൻപുട്ട് പ്രതിരോധം അളക്കുന്നത്. വോൾട്ടേജ് പ്രതികരണത്തിന്റെ വ്യാപ്തി അളക്കുകയും ഇൻപുട്ട് പ്രതിരോധം കണക്കാക്കാൻ ഓമിന്റെ നിയമം ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്യുക. ഒരു വോൾട്ടേജ് ക്ലാമ്പിൽ 5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സ്വയമേവയുള്ള പ്രവർത്തനം രേഖപ്പെടുത്തി, സെമി-ഓട്ടോമാറ്റിക് റെക്കഗ്നിഷൻ സ്ക്രിപ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഇഗോർ പ്രോയിൽ (പതിപ്പ് 32 7.01, വേവ്മെട്രിക്സ്, ലേക്ക് ഓസ്വെഗോ, ഒറിഗോൺ, യുഎസ്എ) sPSC തിരിച്ചറിഞ്ഞ് അളന്നു. വ്യത്യസ്ത പൊട്ടൻഷ്യലുകളിൽ (-110 mV മുതൽ) ബാറ്ററി ക്ലാമ്പ് ചെയ്ത് 5 mV സ്റ്റെപ്പുകളിൽ വോൾട്ടേജ് വർദ്ധിപ്പിച്ചാണ് IV വക്രവും സ്റ്റെഡി-സ്റ്റേറ്റ് കറന്റും അളക്കുന്നത്. ഒരു ഡിപോളറൈസിംഗ് കറന്റ് പ്രയോഗിച്ചാണ് AP യുടെ ഉത്പാദനം പരീക്ഷിച്ചത്. ഒരു ഡിപോളറൈസിംഗ് കറന്റ് പൾസ് പ്രയോഗിക്കുമ്പോൾ സെല്ലിനെ -70 mV യിൽ ക്ലാമ്പ് ചെയ്യുക. ഓരോ റെക്കോർഡിംഗ് യൂണിറ്റിന്റെയും സ്റ്റെപ്പ് വലുപ്പം വെവ്വേറെ ക്രമീകരിക്കുക (10 മുതൽ 60 pA വരെ). ഏറ്റവും ഉയർന്ന AP ഫ്രീക്വൻസിക്ക് കാരണമാകുന്ന പൾസ് സ്പൈക്കുകൾ സ്വമേധയാ എണ്ണിക്കൊണ്ട് പരമാവധി AP ഫ്രീക്വൻസി കണക്കാക്കുക. ഒന്നോ അതിലധികമോ AP-കൾ ആദ്യം ട്രിഗർ ചെയ്യുന്ന ഡിപോളറൈസേഷൻ പൾസിന്റെ രണ്ടാമത്തെ ഡെറിവേറ്റീവ് ഉപയോഗിച്ചാണ് AP ത്രെഷോൾഡ് വിശകലനം ചെയ്യുന്നത്.
സുഷിരങ്ങളുള്ള പാച്ച് കോൺഫിഗറേഷനും വിശകലനവും. സ്റ്റാൻഡേർഡ് പ്രോട്ടോക്കോളുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സുഷിരങ്ങളുള്ള പാച്ച് റെക്കോർഡിംഗ് നടത്തുക. ഇനിപ്പറയുന്ന ചേരുവകൾ അടങ്ങിയിട്ടില്ലാത്ത ഒരു ATP- ഉം GTP- ഉം ഇല്ലാത്ത പൈപ്പറ്റ് ഉപയോഗിക്കുക: 128 mM ഗ്ലൂക്കോണേറ്റ് K, 10 mM KCl, 10 mM ഹെപ്പസ്, 0.1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, കൂടാതെ pH 7.2 ആയി ക്രമീകരിക്കുക (KOH ഉപയോഗിച്ച്). കോശ സ്തരത്തിന്റെ അനിയന്ത്രിതമായ പ്രവേശനക്ഷമത തടയുന്നതിന് ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ലായനിയിൽ നിന്ന് ATP ഉം GTP ഉം ഒഴിവാക്കിയിരിക്കുന്നു. പഞ്ച് ചെയ്ത പാച്ച് റെക്കോർഡ് ലഭിക്കുന്നതിന് പാച്ച് പൈപ്പറ്റിൽ ഒരു ആംഫോട്ടെറിസിൻ അടങ്ങിയ ആന്തരിക ലായനി (ഏകദേശം 200 മുതൽ 250μg/ml വരെ; G4888, സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) നിറയ്ക്കുന്നു. ഡൈമെഥൈൽ സൾഫോക്സൈഡിൽ ആംഫോട്ടെറിസിൻ ലയിപ്പിച്ചു (അന്തിമ സാന്ദ്രത: 0.1 മുതൽ 0.3% വരെ; DMSO; D8418, സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്). ഉപയോഗിച്ച DMSO യുടെ സാന്ദ്രത പഠിച്ച ന്യൂറോണുകളിൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തിയില്ല. പഞ്ചിംഗ് പ്രക്രിയയിൽ, ചാനൽ റെസിസ്റ്റൻസ് (Ra) തുടർച്ചയായി നിരീക്ഷിച്ചു, Ra, AP എന്നിവയുടെ വ്യാപ്തി സ്ഥിരപ്പെടുത്തിയതിനുശേഷം (20-40 മിനിറ്റ്) പരീക്ഷണം ആരംഭിച്ചു. 2 മുതൽ 5 മിനിറ്റ് വരെ വോൾട്ടേജിലും/അല്ലെങ്കിൽ കറന്റ് ക്ലാമ്പിലും സ്വയമേവയുള്ള പ്രവർത്തനം അളക്കുന്നു. ഇഗോർ പ്രോ (പതിപ്പ് 7.05.2, വേവ്മെട്രിക്സ്, യുഎസ്എ), എക്സൽ (പതിപ്പ് 2010, മൈക്രോസോഫ്റ്റ് കോർപ്പറേഷൻ, റെഡ്മണ്ട്, യുഎസ്എ), ഗ്രാഫ്പാഡ് പ്രിസം (പതിപ്പ് 8.1.2, ഗ്രാഫ്പാഡ് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഇൻകോർപ്പറേറ്റഡ്, ലാ ജോല്ല, സിഎ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ വിശകലനം നടത്തി. സ്വയമേവയുള്ള എപികൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിന്, ഇഗോർപ്രോയുടെ ന്യൂറോമാറ്റിക് v3.0c പ്ലഗ്-ഇൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ഓരോ റെക്കോർഡിനും വ്യക്തിഗതമായി ക്രമീകരിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു നിശ്ചിത പരിധി ഉപയോഗിച്ച് എപികൾ യാന്ത്രികമായി തിരിച്ചറിയുക. സ്പൈക്ക് ഇടവേള ഉപയോഗിച്ച്, പരമാവധി തൽക്ഷണ സ്പൈക്ക് ഫ്രീക്വൻസിയും ശരാശരി സ്പൈക്ക് ഫ്രീക്വൻസിയും ഉപയോഗിച്ച് സ്പൈക്ക് ഫ്രീക്വൻസി നിർണ്ണയിക്കുക.
PN ഒറ്റപ്പെടൽ. മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്, ഒരു നിശ്ചിത ഘട്ടത്തിൽ മൗസ് സെറിബെല്ലത്തിൽ നിന്ന് PN-കൾ ശുദ്ധീകരിച്ചു (58). ചുരുക്കത്തിൽ, സെറിബെല്ലം വിഘടിച്ച് ഐസ്-കോൾഡ് ഡിസോസിയേഷൻ മീഡിയത്തിൽ [HBSS Ca2+ ഉം Mg2+ ഉം ഇല്ലാതെ, 20 mM ഗ്ലൂക്കോസ്, പെൻസിലിൻ (50 U/ml), സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (0.05 mg/ml) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്തു], തുടർന്ന് പാപ്പെയ്നിൽ മീഡിയം ദഹിപ്പിച്ചു [HBSS, 1-സിസ്റ്റൈൻ·HCl (1 mg / ml), പാപ്പെയ്ൻ (16 U/ml), ഡിയോക്സിറൈബോണ്യൂക്ലീസ് I (DNase I; 0.1 mg/ml) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്തു] 30°C-ൽ 30 മിനിറ്റ് ചികിത്സിക്കുക. ആദ്യം എഗ്ഗ് മ്യൂക്കസ് (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml), DNase (0.1 mg/ml) എന്നിവ അടങ്ങിയ HBSS മീഡിയത്തിൽ എൻസൈമാറ്റിക് ദഹനം തടയാൻ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ടിഷ്യുകൾ കഴുകുക, തുടർന്ന് 20 mM ഗ്ലൂക്കോസ് അടങ്ങിയ HBSS മീഡിയത്തിൽ HBSS-ൽ സൌമ്യമായി പൊടിക്കുക, പെൻസിലിൻ (50 U/ml), സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (0.05 mg/ml), DNase (0.1 mg/ml) എന്നിവ ഒറ്റ കോശങ്ങൾ പുറത്തുവിടുന്നു. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന സെൽ സസ്പെൻഷൻ 70μm സെൽ സ്ട്രെയിനർ വഴി ഫിൽട്ടർ ചെയ്തു, തുടർന്ന് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ (1110 rpm, 5 മിനിറ്റ്, 4°C) വഴി കോശങ്ങൾ പെല്ലറ്റ് ചെയ്തു, സോർട്ടിംഗ് മീഡിയത്തിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു [HBSS, 20 mM ഗ്ലൂക്കോസ്, 20% ഫീറ്റൽ ബോവിൻ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്തു) സെറം, പെൻസിലിൻ (50 U/ml), സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (0.05 mg/ml)]; പ്രൊപ്പിഡിയം അയഡിഡ് ഉപയോഗിച്ച് കോശ പ്രവർത്തനക്ഷമത വിലയിരുത്തുകയും കോശ സാന്ദ്രത 1×106 മുതൽ 2×106 കോശങ്ങൾ/ml വരെ ക്രമീകരിക്കുകയും ചെയ്യുക. ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രിക്ക് മുമ്പ്, സസ്പെൻഷൻ ഒരു 50 μm സെൽ സ്ട്രെയിനറിലൂടെ ഫിൽട്ടർ ചെയ്തു.
ഫ്ലോ സൈറ്റോമീറ്റർ. FACSAria III മെഷീൻ (BD ബയോസയൻസസ്), FACSDiva സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (BD ബയോസയൻസസ്, പതിപ്പ് 8.0.1) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 4°C യിൽ സെൽ സോർട്ടിംഗ് നടത്തി. ~2800 ഇവന്റുകൾ/സെക്കൻഡ് എന്ന നിരക്കിൽ 20 psi മർദ്ദത്തിൽ 100 ​​μm നോസൽ ഉപയോഗിച്ചാണ് സെൽ സസ്പെൻഷൻ തരംതിരിച്ചത്. പരമ്പരാഗത ഗേറ്റിംഗ് മാനദണ്ഡങ്ങൾക്ക് (സെൽ വലുപ്പം, ബൈമോഡൽ വിവേചനം, ചിതറിക്കിടക്കുന്ന സ്വഭാവസവിശേഷതകൾ) മറ്റ് സെൽ തരങ്ങളിൽ നിന്ന് PN ന്റെ ശരിയായ ഒറ്റപ്പെടൽ ഉറപ്പാക്കാൻ കഴിയാത്തതിനാൽ, mitoYFP+ ​​ലും നിയന്ത്രണ mitoYFP − എലികളിലും YFP തീവ്രതയുടെയും ഓട്ടോഫ്ലൂറസെൻസിന്റെയും നേരിട്ടുള്ള താരതമ്യത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് ഗേറ്റിംഗ് തന്ത്രം സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നത്. 488 nm ലേസർ ലൈൻ ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിൾ വികിരണം ചെയ്തുകൊണ്ട് YFP ഉത്തേജിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ 530/30 nm ബാൻഡ് പാസ് ഫിൽട്ടർ ഉപയോഗിച്ച് സിഗ്നൽ കണ്ടെത്തുന്നു. mitoYFP+ ​​എലികളിൽ, ന്യൂറോണൽ ബോഡിയും ആക്സൺ ശകലങ്ങളും വേർതിരിച്ചറിയാൻ Rosa26-mitoYFP റിപ്പോർട്ടർ ജീനിന്റെ ആപേക്ഷിക ശക്തിയും ഉപയോഗിക്കുന്നു. 7-AAD 561 nm മഞ്ഞ ലേസർ ഉപയോഗിച്ച് ഉത്തേജിപ്പിക്കുകയും മൃതകോശങ്ങളെ ഒഴിവാക്കാൻ 675/20 nm ബാൻഡ്‌പാസ് ഫിൽട്ടർ ഉപയോഗിച്ച് കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. ഒരേ സമയം ആസ്ട്രോസൈറ്റുകളെ വേർതിരിക്കുന്നതിന്, സെൽ സസ്പെൻഷൻ ACSA-2-APC ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു, തുടർന്ന് 640 nm ലേസർ ലൈൻ ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിൾ വികിരണം ചെയ്തു, സിഗ്നൽ കണ്ടെത്താൻ 660/20 nm ബാൻഡ്‌പാസ് ഫിൽട്ടർ ഉപയോഗിച്ചു.
ശേഖരിച്ച കോശങ്ങൾ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ (1110 rpm, 5 മിനിറ്റ്, 4°C) വഴി പെല്ലറ്റ് ചെയ്‌ത് -80°C-ൽ ഉപയോഗം വരെ സൂക്ഷിച്ചു. നടപടിക്രമ വ്യതിയാനം കുറയ്ക്കുന്നതിന് Mfn2cKO എലികളെയും അവയുടെ കുഞ്ഞുങ്ങളെയും ഒരേ ദിവസം തരംതിരിക്കുന്നു. FlowJo സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ഉപയോഗിച്ചാണ് FACS ഡാറ്റ അവതരണവും വിശകലനവും നടത്തിയത്.
മുകളിൽ സൂചിപ്പിച്ചതുപോലെ (59), തുടർന്നുള്ള mtDNA ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനായി തരംതിരിച്ച ന്യൂറോണുകളിൽ നിന്ന് DNA വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ റിയൽ-ടൈം PCR ഉപയോഗിക്കുന്നു. വ്യത്യസ്ത എണ്ണം കോശങ്ങളിൽ qPCR പ്രവർത്തിപ്പിച്ചാണ് തുടക്കത്തിൽ രേഖീയതയും ത്രെഷോൾഡ് സെൻസിറ്റിവിറ്റിയും പരിശോധിച്ചത്. ചുരുക്കത്തിൽ, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20, പ്രോട്ടീനേസ് K (200 ng/ml) എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു ലൈസിസ് ബഫറിൽ 300 PN ശേഖരിച്ച് 55°C 120 മിനിറ്റിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. പ്രോട്ടീനേസ് K യുടെ പൂർണ്ണമായ നിർജ്ജീവീകരണം ഉറപ്പാക്കാൻ കോശങ്ങളെ 95°C ൽ 10 മിനിറ്റ് കൂടുതൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. mt-Nd1 ന് പ്രത്യേകമായുള്ള ഒരു TaqMan പ്രോബ് (തെർമോ ഫിഷർ) ഉപയോഗിച്ച്, 7900HT റിയൽ-ടൈം PCR സിസ്റ്റത്തിൽ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) സെമി-ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR ഉപയോഗിച്ച് mtDNA അളന്നു. സയൻസ്, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ AIVI3E8) 18S (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ Hs99999901_s1) ജീനുകൾ.
പ്രോട്ടിയോം സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കൽ. ലായനി 95°C-ൽ 10 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കി സോണിക്കേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട്, ലൈസിസ് ബഫറിൽ [6 M ഗ്വാനിഡിൻ ക്ലോറൈഡ്, 10 mM ട്രിസ്(2-കാർബോക്സിതൈൽ) ഫോസ്ഫിൻ ഹൈഡ്രോക്ലോറൈഡ്, 10 mM ക്ലോറോഅസെറ്റാമൈഡ്, 100 mM ട്രിസ്-ലൈസ് ഫ്രോസൺ ന്യൂറോൺ പെല്ലറ്റുകൾ ഇൻ HCl]. ബയോറപ്റ്ററിൽ (ഡയജെനോഡ്) 10 മിനിറ്റ് (30 സെക്കൻഡ് പൾസ് / 30 സെക്കൻഡ് താൽക്കാലിക വിരാമം). സാമ്പിൾ 20 mM ട്രിസ്-HCl (pH 8.0) ൽ 1:10 എന്ന അനുപാതത്തിൽ നേർപ്പിച്ചു, 300 ng ട്രിപ്സിൻ ഗോൾഡുമായി (പ്രോമെഗ) കലർത്തി, പൂർണ്ണമായ ദഹനം നേടുന്നതിനായി 37°C-ൽ രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. രണ്ടാം ദിവസം, സാമ്പിൾ 20,000 ഗ്രാം 20 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. സൂപ്പർനേറ്റന്റ് 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡ് ഉപയോഗിച്ച് നേർപ്പിച്ചു, കൂടാതെ ലായനി സ്വയം നിർമ്മിച്ച സ്റ്റേജ് ടിപ്സ് ഉപയോഗിച്ച് ഡീസൾട്ട് ചെയ്തു. സാമ്പിൾ 45°C-ൽ ഒരു സ്പീഡ്‌വാക് ഉപകരണത്തിൽ (എപ്പെൻഡോർഫ് കോൺസെൻട്രേറ്റർ പ്ലസ് 5305) ഉണക്കി, തുടർന്ന് 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡിൽ പെപ്റ്റൈഡ് സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു. എല്ലാ സാമ്പിളുകളും ഒരേ വ്യക്തി ഒരേസമയം തയ്യാറാക്കി. ആസ്ട്രോസൈറ്റ് സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനായി, 4 μg ഡിസാൾട്ടഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഒരു ടാൻഡം മാസ് ടാഗ് (TMT10plex, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ 90110, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ച് 1:20 എന്ന പെപ്റ്റൈഡ് മുതൽ TMT റീജന്റ് അനുപാതം ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തു. TMT ലേബലിംഗിനായി, 70 μl അൺഹൈഡ്രസ് ACN-ൽ 0.8 mg TMT റീജന്റ് വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു, ഉണങ്ങിയ പെപ്റ്റൈഡ് 0.1 M TEAB-യുടെ 9 μl (ട്രൈതൈലാമോണിയം ബൈകാർബണേറ്റ്) ആയി പുനഃസംയോജിപ്പിച്ചു, അതിലേക്ക് ACN-ൽ 7 μl TMT റീജന്റ് ചേർത്തു. സാന്ദ്രത 43.75% ആയിരുന്നു. 60 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേഷനുശേഷം, 5% ഹൈഡ്രോക്‌സിലാമിന്റെ 2 μl ഉപയോഗിച്ച് പ്രതികരണം ശമിപ്പിച്ചു. ലേബൽ ചെയ്ത പെപ്റ്റൈഡുകൾ ശേഖരിച്ച് ഉണക്കി, 200μl 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡിൽ (FA) വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു, രണ്ടായി വിഭജിച്ചു, തുടർന്ന് സ്വയം നിർമ്മിച്ച സ്റ്റേജ് ടിപ്പുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഡീസൾട്ട് ചെയ്തു. അൾട്ടിമേറ്റ് 3000 അൾട്രാ ഹൈ പെർഫോമൻസ് ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫ് (അൾട്ടിമേറ്റ് 3000 അൾട്രാ ഹൈ പെർഫോമൻസ് ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫ്) ഉപയോഗിച്ച്, രണ്ട് പകുതികളിൽ ഒന്ന് 130Å1.7μm C18 കണികകൾ നിറച്ച 1mm x 150mm അക്വിറ്റി ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിക് കോളത്തിൽ ഭിന്നിപ്പിച്ചു (വാട്ടേഴ്സ്, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ. SKU: 186006935). തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്). 30μl/മിനിറ്റ് എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ പെപ്റ്റൈഡുകൾ വേർതിരിക്കുക, 1% മുതൽ 50% വരെ ബഫർ B വരെ 85 മിനിറ്റ് 96 മിനിറ്റ് സ്റ്റെപ്പ്വൈസ് ഗ്രേഡിയന്റോടെ വേർതിരിക്കുക, 50% മുതൽ 95% വരെ ബഫർ B വരെ 3 മിനിറ്റ്, തുടർന്ന് 95% ബഫർ B ന് 8 മിനിറ്റ്; ബഫർ എ 5% ACN ഉം 10 mM അമോണിയം ബൈകാർബണേറ്റും (ABC) ആണ്, ബഫർ B 80% ACN ഉം 10 mM ABC ഉം ആണ്. ഓരോ 3 മിനിറ്റിലും ഭിന്നസംഖ്യകൾ ശേഖരിച്ച് അവയെ രണ്ട് ഗ്രൂപ്പുകളായി (1 + 17, 2 + 18, മുതലായവ) സംയോജിപ്പിച്ച് ഒരു വാക്വം സെൻട്രിഫ്യൂജിൽ ഉണക്കുക.
LC-MS/MS വിശകലനം. മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിക്ക്, 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ മീഡിയം (ഡോ. മൈഷ്, മാറ്റ്), യൂസ് EASY-nLC 1200 (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, ജർമ്മനി) ഘടിപ്പിച്ച 25 സെ.മീ, 75 μm ആന്തരിക വ്യാസമുള്ള PicoFrit അനലിറ്റിക്കൽ കോളത്തിൽ (പുതിയ ഒബ്ജക്റ്റീവ് ലെൻസ്, പാർട്ട് നമ്പർ PF7508250) പെപ്റ്റൈഡുകൾ (നമ്പർ r119.aq) വേർതിരിച്ചു. കോളം 50°C-ൽ നിലനിർത്തി. ബഫറുകൾ A, B എന്നിവ യഥാക്രമം വെള്ളത്തിൽ 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡും 80% ACN-ൽ 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡുമാണ്. പെപ്റ്റൈഡുകൾ 65 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 6% മുതൽ 31% വരെ ബഫർ B വരെയും 5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 31% മുതൽ 50% വരെ ബഫർ B വരെയും 200 nl/min ഗ്രേഡിയന്റിൽ വേർതിരിച്ചു. ഒരു ഓർബിട്രാപ്പ് ഫ്യൂഷൻ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) എലുട്ടെഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു. 350 മുതൽ 1500 മീ/സെഡ് പരിധിയിൽ 120,000 റെസല്യൂഷനോടെ പെപ്റ്റൈഡ് പ്രികർസർ m/z അളക്കൽ നടത്തുന്നു. 27% നോർമലൈസ്ഡ് കൊളീഷൻ എനർജി ഉപയോഗിച്ച്, 2 മുതൽ 6 വരെ ചാർജ് അവസ്ഥയുള്ള ഏറ്റവും ശക്തമായ പ്രികർസറിനെ ഉയർന്ന ഊർജ്ജ സി ട്രാപ്പ് ഡിസോസിയേഷൻ (എച്ച്സിഡി) ക്ലീവേജിനായി തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നു. സൈക്കിൾ സമയം 1 സെക്കൻഡായി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. 5×104 എന്ന ഏറ്റവും ചെറിയ AGC ലക്ഷ്യവും 86 എംഎസ് എന്ന പരമാവധി ഇഞ്ചക്ഷൻ സമയവും ഉപയോഗിച്ച് അയോൺ ട്രാപ്പിൽ പെപ്റ്റൈഡ് ഫ്രാഗ്മെന്റേഷന്റെ m/z മൂല്യം അളന്നു. ഫ്രാഗ്മെന്റേഷനുശേഷം, പ്രികർസറിനെ 45 സെക്കൻഡ് നേരത്തേക്ക് ഡൈനാമിക് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ ലിസ്റ്റിൽ ഉൾപ്പെടുത്തി. ടിഎംടി-ലേബൽ ചെയ്ത പെപ്റ്റൈഡുകൾ 50 സെ.മീ, 75 μm അക്ലെയിം പെപ്മാപ്പ് കോളത്തിൽ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ 164942) വേർതിരിച്ചു, മൈഗ്രേഷൻ സ്പെക്ട്രയെ ഹൈ-ഫീൽഡ് അസിമട്രിക് വേവ്ഫോം അയോണുകൾ (FAIMS) ഉപകരണങ്ങൾ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഘടിപ്പിച്ച ഒരു ഓർബിട്രാപ്പ് ലുമോസ് ട്രിബ്രിഡ് മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) വിശകലനം ചെയ്തു. −50, −70 V എന്നീ രണ്ട് കോമ്പൻസേഷൻ വോൾട്ടേജുകളിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു. സിൻക്രൊണൈസേഷൻ പ്രിക്സറിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി തിരഞ്ഞെടുത്ത MS3 ടിഎംടി റിപ്പോർട്ട് അയോൺ സിഗ്നൽ അളക്കലിനായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. 6% മുതൽ 31% വരെ ബഫർ സാന്ദ്രതയോടെ, 90% ലീനിയർ ഗ്രേഡിയന്റ് എല്യൂഷൻ ഉപയോഗിച്ച് EASY-nLC 1200-ൽ പെപ്റ്റൈഡ് വേർതിരിക്കൽ നടത്തി; ബഫർ എ 0.1% എഫ്എ ആയിരുന്നു, ബഫർ ബി 0.1% എഫ്എയും 80% എസിഎനും ആയിരുന്നു. വിശകലന കോളം 50°C-ൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു. FAIMS കോമ്പൻസേഷൻ വോൾട്ടേജ് അനുസരിച്ച് യഥാർത്ഥ ഫയൽ വിഭജിക്കാൻ ഫ്രീസ്റ്റൈൽ (പതിപ്പ് 1.6, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിക്കുക.
പ്രോട്ടീൻ തിരിച്ചറിയലും അളവ് നിർണ്ണയവും. സംയോജിത ആൻഡ്രോമിഡ സെർച്ച് എഞ്ചിൻ ഉപയോഗിച്ച്, മാക്സ് ക്വാണ്ട് പതിപ്പ് 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ഉപയോഗിച്ച് ഒറിജിനൽ ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്തു. അക്വോറിയ വിക്ടോറിയയിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ക്രെ റീകോമ്പിനേസ്, വൈഎഫ്പി സീക്വൻസുകൾക്ക് പുറമേ, മൗസ് റഫറൻസ് പ്രോട്ടിയോമിന്റെ കാനോനിക്കൽ സീക്വൻസിനും ഐസോഫോം സീക്വൻസിനും വേണ്ടി പെപ്റ്റൈഡ് ഫ്രാഗ്മെന്റ് സ്പെക്ട്ര തിരഞ്ഞു (പ്രോട്ടീൻ ഐഡി UP000000589, മെയ് 2017 ൽ യൂണിപ്രോട്ടിൽ നിന്ന് ഡൗൺലോഡ് ചെയ്‌തു). മെഥിയോണിൻ ഓക്‌സിഡേഷനും പ്രോട്ടീൻ എൻ-ടെർമിനൽ അസറ്റിലേഷനും വേരിയബിൾ മോഡിഫിക്കേഷനുകളായി സജ്ജീകരിച്ചു; സിസ്റ്റീൻ കാർബമോയിൽ മെത്തിലേഷൻ സ്ഥിരമായ മോഡിഫിക്കേഷനുകളായി സജ്ജീകരിച്ചു. ദഹന പാരാമീറ്ററുകൾ "സ്പെസിഫിസിറ്റി", "ട്രിപ്‌സിൻ/പി" എന്നിങ്ങനെ സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. പ്രോട്ടീൻ ഐഡന്റിഫിക്കേഷനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകളുടെയും റേസർ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെയും ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ എണ്ണം 1 ആണ്; അദ്വിതീയ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ എണ്ണം 0 ആണ്. പെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പ് പൊരുത്തപ്പെടുത്തലിന്റെ സാഹചര്യങ്ങളിൽ, പ്രോട്ടീൻ തിരിച്ചറിയൽ നിരക്ക് 0.01 ആയിരുന്നു. "സെക്കൻഡ് പെപ്റ്റൈഡ്" ഓപ്ഷൻ പ്രവർത്തനക്ഷമമാക്കിയിരിക്കുന്നു. വ്യത്യസ്ത ഒറിജിനൽ ഫയലുകൾക്കിടയിൽ വിജയകരമായ ഐഡന്റിഫിക്കേഷനുകൾ കൈമാറാൻ "റൺസ് തമ്മിലുള്ള പൊരുത്തം" ഓപ്ഷൻ ഉപയോഗിക്കുക. ലേബൽ-ഫ്രീ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനായി (LFQ) LFQ മിനിമം റേഷ്യോ കൗണ്ട് 1 ഉപയോഗിക്കുക (60). ഓരോ സമയ പോയിന്റിലും കുറഞ്ഞത് ഒരു ജെനോടൈപ്പ് ഗ്രൂപ്പിലെ കുറഞ്ഞത് രണ്ട് സാധുവായ മൂല്യങ്ങൾക്കായി LFQ തീവ്രത ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ വീതിയുള്ള ഒരു സാധാരണ വിതരണത്തിൽ നിന്ന് എക്സ്ട്രാപോളേറ്റ് ചെയ്യുന്നു. 0.3 ഉം 1.8 ഉം താഴേക്ക് നീക്കുക. LFQ ഫലങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്യാൻ പെർസിയസ് കമ്പ്യൂട്ടിംഗ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോം (https://maxquant.net/perseus/) ഉം R (https://r-project.org/) ഉം ഉപയോഗിക്കുക. ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനത്തിനായി ലിമ്മ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ പാക്കേജിൽ നിന്നുള്ള ഒരു ടു-വേ മോഡറേറ്റ് ടി ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചു (61). ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally, pheatmap എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് പര്യവേക്ഷണ ഡാറ്റ വിശകലനം നടത്തുന്നു. TMT അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റ MaxQuant പതിപ്പ് 1.6.10.43 ഉപയോഗിച്ചാണ് വിശകലനം ചെയ്തത്. 2018 സെപ്റ്റംബറിൽ ഡൗൺലോഡ് ചെയ്ത യൂണിപ്രോട്ടിന്റെ ഹ്യൂമൻ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റാബേസിൽ നിന്ന് റോ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റയ്ക്കായി തിരയുക. വിശകലനത്തിൽ നിർമ്മാതാവ് നൽകിയ ഐസോടോപ്പ് പ്യൂരിറ്റി കറക്ഷൻ ഫാക്ടർ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനത്തിനായി R-ൽ ലിമ്മ ഉപയോഗിക്കുക. ഒറിജിനൽ ഡാറ്റ, ഡാറ്റാബേസ് തിരയൽ ഫലങ്ങൾ, ഡാറ്റ വിശകലന വർക്ക്ഫ്ലോ, ഫലങ്ങൾ എന്നിവയെല്ലാം PRIDE പങ്കാളി ശേഖരം വഴി PXD019690 എന്ന ഡാറ്റ സെറ്റ് ഐഡന്റിഫയറുള്ള ProteomeXchange അലയൻസിൽ സംഭരിച്ചിരിക്കുന്നു.
ഫങ്ഷണൽ അനോട്ടേഷനുകൾ വിശകലനത്തെ സമ്പന്നമാക്കുന്നു. 8 ആഴ്ചകളിലെ ഡാറ്റാ സെറ്റിന്റെ ഫങ്ഷണൽ അനോട്ടേഷൻ പദങ്ങളുടെ സമ്പന്നത നിർണ്ണയിക്കാൻ ഇൻജെനുറ്റി പാത്ത്‌വേ അനാലിസിസ് (QIAGEN) ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 1). ചുരുക്കത്തിൽ, LC-MS/MS (ടാൻഡെം മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി) ഡാറ്റ വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പ്രോട്ടീൻ ലിസ്റ്റ് ഇനിപ്പറയുന്ന ഫിൽട്ടർ മാനദണ്ഡങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ഉപയോഗിക്കുന്നു: മസ് മസ്കുലസിനെ സ്പീഷീസും പശ്ചാത്തലവുമായി തിരഞ്ഞെടുത്തു, കൂടാതെ വിഭാഗം ബെഞ്ചമിനി 0.05 അല്ലെങ്കിൽ അതിൽ താഴെയുള്ള സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിനായി ക്രമീകരിച്ച P മൂല്യം പ്രാധാന്യമുള്ളതായി കണക്കാക്കുന്നു. ഈ ഗ്രാഫിനായി, ക്രമീകരിച്ച P മൂല്യത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി ഓരോ ക്ലസ്റ്ററിലെയും മികച്ച അഞ്ച് അധിക വിഭാഗങ്ങൾ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ഒന്നിലധികം ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച്, ബെഞ്ചമിനി, ക്രീഗർ, യെകുട്ടിയേലി എന്നിവരുടെ രണ്ട്-ഘട്ട ലീനിയർ ബൂസ്റ്റ് പ്രോഗ്രാം (Q = 5%) ഉപയോഗിച്ച്, ഓരോ വിഭാഗത്തിലും തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രധാനപ്പെട്ട സ്ഥാനാർത്ഥികളിൽ ടൈം-കോഴ്‌സ് പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം നടത്തുന്നു, കൂടാതെ ഓരോ വരിയും പ്രത്യേകം വിശകലനം ചെയ്യുന്നു. സ്ഥിരമായ ഒരു SD സ്വീകരിക്കേണ്ട ആവശ്യമില്ല.
പ്രസിദ്ധീകരിച്ച ഡാറ്റാബേസുകളുമായി ഈ പഠനത്തിന്റെ ഫലങ്ങൾ താരതമ്യം ചെയ്യുന്നതിനും ചിത്രം 1-ൽ ഒരു വെൻ ഡയഗ്രം സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനും, ഞങ്ങൾ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പ്രോട്ടീൻ പട്ടികയെ മിറ്റോകാർട്ട 2.0 അനോട്ടേഷനുകളുമായി (24) സംയോജിപ്പിച്ചു. ഡയഗ്രം സൃഷ്ടിക്കാൻ ഡ്രോ വെൻ ഡയഗ്രം (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) എന്ന ഓൺലൈൻ ടൂൾ ഉപയോഗിക്കുക.
പ്രോട്ടിയോമിക്സ് വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ നടപടിക്രമങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള വിശദമായ വിവരങ്ങൾക്ക്, ദയവായി മെറ്റീരിയലുകളുടെയും രീതികളുടെയും അനുബന്ധ വിഭാഗം പരിശോധിക്കുക. മറ്റെല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കും, വിശദമായ വിവരങ്ങൾ അനുബന്ധ ലെജന്റിൽ കാണാം. മറ്റുവിധത്തിൽ വ്യക്തമാക്കിയിട്ടില്ലെങ്കിൽ, എല്ലാ ഡാറ്റയും ശരാശരി ± SEM ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുകയും എല്ലാ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനങ്ങളും ഗ്രാഫ്പാഡ് പ്രിസം 8.1.2 സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ചാണ് നടത്തിയത്.
ഈ ലേഖനത്തിനായുള്ള അനുബന്ധ വസ്തുക്കൾക്ക്, ദയവായി http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 കാണുക.
ക്രിയേറ്റീവ് കോമൺസ് ആട്രിബ്യൂഷൻ-നോൺ-കൊമേഴ്‌സ്യൽ ലൈസൻസിന്റെ നിബന്ധനകൾക്ക് കീഴിൽ വിതരണം ചെയ്യുന്ന ഒരു ഓപ്പൺ ആക്‌സസ് ലേഖനമാണിത്, അന്തിമ ഉപയോഗം വാണിജ്യ നേട്ടത്തിനായിട്ടല്ലാത്തിടത്തോളം, യഥാർത്ഥ കൃതി ശരിയാണെന്നാണ് അടിസ്ഥാനം എങ്കിൽ, ഏത് മാധ്യമത്തിലും ഉപയോഗിക്കാനും വിതരണം ചെയ്യാനും പുനർനിർമ്മിക്കാനും ഇത് അനുവദിക്കുന്നു. റഫറൻസ്.
കുറിപ്പ്: നിങ്ങൾ പേജിലേക്ക് ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന വ്യക്തിക്ക് ഇമെയിൽ കാണണമെന്ന് നിങ്ങൾ ആഗ്രഹിക്കുന്നുണ്ടെന്നും അത് സ്പാം അല്ലെന്നും അറിയാൻ വേണ്ടി മാത്രമേ നിങ്ങളുടെ ഇമെയിൽ വിലാസം നൽകാൻ ഞങ്ങൾ ആവശ്യപ്പെടുകയുള്ളൂ. ഞങ്ങൾ ഒരു ഇമെയിൽ വിലാസവും പിടിച്ചെടുക്കില്ല.
നിങ്ങൾ ഒരു സന്ദർശകനാണോ എന്ന് പരിശോധിക്കുന്നതിനും സ്വയമേവയുള്ള സ്പാം സമർപ്പിക്കൽ തടയുന്നതിനും ഈ ചോദ്യം ഉപയോഗിക്കുന്നു.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. ശക്തിവേലു, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ലാർസൺ
പ്രവർത്തനരഹിതമായ ന്യൂറോണുകളുടെ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് വിശകലനം, ന്യൂറോ ഡീജനറേഷനെ പ്രതിരോധിക്കാൻ മെറ്റബോളിക് പ്രോഗ്രാമുകൾ സജീവമാക്കുന്നുവെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. ശക്തിവേലു, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ലാർസൺ
പ്രവർത്തനരഹിതമായ ന്യൂറോണുകളുടെ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് വിശകലനം, ന്യൂറോ ഡീജനറേഷനെ പ്രതിരോധിക്കാൻ മെറ്റബോളിക് പ്രോഗ്രാമുകൾ സജീവമാക്കുന്നുവെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി.
©2020 അമേരിക്കൻ അസോസിയേഷൻ ഫോർ ദി അഡ്വാൻസ്‌മെൻ്റ് ഓഫ് സയൻസ്. എല്ലാ അവകാശങ്ങളും നിക്ഷിപ്തം. HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef, COUNTER എന്നിവയുടെ പങ്കാളിയാണ് AAAS. സയൻസ് അഡ്വാൻസസ് ISSN 2375-2548.