Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസറിന്റെ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണ മാത്രമേ ഉള്ളൂ. മികച്ച ഫലങ്ങൾക്കായി, നിങ്ങളുടെ ബ്രൗസറിന്റെ പുതിയ പതിപ്പ് ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക). അതേസമയം, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലിംഗോ ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റോ ഇല്ലാതെ ഞങ്ങൾ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
ഓട്ടിസം സ്പെക്ട്രം ഡിസോർഡർ പോലുള്ള നാഡീ വികസന വൈകല്യങ്ങളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തന വൈകല്യത്തിന്റെ പങ്ക് പഠിക്കാൻ പ്രൊപ്പിയോണിക് ആസിഡ് (PPA) ഉപയോഗിക്കുന്നു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോജെനിസിസ്, മെറ്റബോളിസം, ടേൺ‌ഓവർ എന്നിവയെ തടസ്സപ്പെടുത്താൻ PPA അറിയപ്പെടുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ഈ സംവിധാനങ്ങളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ താൽക്കാലിക സ്വഭാവം കാരണം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ്, ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ എന്നിവയിൽ PPA യുടെ ഫലങ്ങൾ പ്രശ്‌നകരമായി തുടരുന്നു. ഇവിടെ, ന്യൂറോൺ പോലുള്ള SH-SY5Y കോശങ്ങളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ അൾട്രാസ്ട്രക്ചർ, മോർഫോളജി, ഡൈനാമിക്സ് എന്നിവയെ PPA എങ്ങനെ ബാധിക്കുന്നു എന്ന് അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങൾ പൂരക ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ഇമേജിംഗ് ടെക്നിക്കുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. PPA (5 mM) മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഏരിയ (p < 0.01), ഫെറെറ്റ് വ്യാസം, ചുറ്റളവ് (p < 0.05), ഏരിയ 2 (p < 0.01) എന്നിവയിൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടാക്കി. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഇവന്റ് ലൊക്കേറ്റർ വിശകലനം ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ ഇവന്റുകളിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവ് (p < 0.05) കാണിച്ചു, അതുവഴി സമ്മർദ്ദ സാഹചര്യങ്ങളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കിന്റെ സമഗ്രത നിലനിർത്തി. കൂടാതെ, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001), OPA1 (p < 0.05) എന്നിവയുടെ mRNA എക്സ്പ്രഷൻ ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു. 01). സമ്മർദ്ദ സാഹചര്യങ്ങളിൽ പ്രവർത്തനം നിലനിർത്തുന്നതിന് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടന, ബയോജെനിസിസ്, ഡൈനാമിക്സ് എന്നിവയുടെ പുനർനിർമ്മാണത്തെ ഇത് വ്യക്തമാക്കുന്നു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിൽ PPA യുടെ ഫലങ്ങളെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ പുതിയ ഉൾക്കാഴ്ച നൽകുന്നു, കൂടാതെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സ്ട്രെസ് പ്രതികരണങ്ങളിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന സങ്കീർണ്ണമായ നിയന്ത്രണ സംവിധാനങ്ങൾ പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഇമേജിംഗ് ടെക്നിക്കുകളുടെ പ്രയോജനം എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.
ഊർജ്ജ ഉൽപാദനത്തിലും ബയോസിന്തസിസിലും സാധാരണ പങ്കുവഹിക്കുന്നതിനപ്പുറം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയകൾ വിവിധ കോശ പ്രവർത്തനങ്ങളിൽ അവിഭാജ്യ പങ്കാളികളാണ്. കാൽസ്യം സിഗ്നലിംഗ്, മെറ്റബോളിക്, റെഡോക്സ് ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ്, ഇൻഫ്ലമേറ്ററി സിഗ്നലിംഗ്, എപ്പിജെനെറ്റിക് മോഡിഫിക്കേഷനുകൾ, സെൽ പ്രൊലിഫറേഷൻ, ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ, പ്രോഗ്രാം ചെയ്ത സെൽ ഡെത്ത് എന്നിവയുടെ ഒരു പ്രധാന റെഗുലേറ്ററാണ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിസം. പ്രത്യേകിച്ച്, ന്യൂറോണൽ വികസനം, അതിജീവനം, പ്രവർത്തനം എന്നിവയ്ക്ക് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിസം നിർണായകമാണ്, കൂടാതെ ന്യൂറോപാഥോളജിയുടെ വിവിധ പ്രകടനങ്ങളിൽ ഇത് വ്യാപകമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു2,3,4.
കഴിഞ്ഞ ദശകത്തിൽ, ന്യൂറോജെനിസിസ്, ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ, പക്വത, പ്ലാസ്റ്റിറ്റി എന്നിവയുടെ കേന്ദ്ര റെഗുലേറ്ററായി മെറ്റബോളിക് സ്റ്റാറ്റസ് ഉയർന്നുവന്നിട്ടുണ്ട്5,6. അടുത്തിടെ, മൈറ്റോസിസിന്റെ പ്രത്യേകിച്ച് പ്രധാനപ്പെട്ട ഘടകങ്ങളായി മൈറ്റോസിസിന്റെ മൈറ്റോസിസിന്റെ രൂപഘടനയും ചലനാത്മകതയും മാറിയിരിക്കുന്നു, ഇത് കോശങ്ങൾക്കുള്ളിൽ ആരോഗ്യകരമായ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ ഒരു കൂട്ടം നിലനിർത്തുന്ന ഒരു ചലനാത്മക പ്രക്രിയയാണ്. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോജെനിസിസ്, ബയോഎനർജറ്റിക്സ് മുതൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ, ട്രാൻസ്പോർട്ട്, ക്ലിയറൻസ് വരെയുള്ള സങ്കീർണ്ണമായ പരസ്പരാശ്രിത പാതകളാണ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്നത്7,8. ഈ സംയോജിത സംവിധാനങ്ങളിൽ ഏതെങ്കിലും ഒന്നിന്റെ തടസ്സം ആരോഗ്യകരമായ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കുകളുടെ പരിപാലനത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും ന്യൂറോ ഡെവലപ്‌മെന്റിന് ആഴത്തിലുള്ള പ്രവർത്തനപരമായ പ്രത്യാഘാതങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു9,10. വാസ്തവത്തിൽ, ഓട്ടിസം സ്പെക്ട്രം ഡിസോർഡേഴ്സ് (ASD) ഉൾപ്പെടെ നിരവധി മാനസിക, ന്യൂറോഡീജനറേറ്റീവ്, ന്യൂറോ ഡെവലപ്‌മെന്റൽ ഡിസോർഡറുകളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിന്റെ ക്രമക്കേട് നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു11,12.
സങ്കീർണ്ണമായ ജനിതക, എപ്പിജെനെറ്റിക് ആർക്കിടെക്ചറുള്ള ഒരു വൈവിധ്യമാർന്ന നാഡീ വികസന വൈകല്യമാണ് എഎസ്ഡി. എഎസ്ഡിയുടെ പാരമ്പര്യം തർക്കമില്ലാത്തതാണ്, പക്ഷേ അടിസ്ഥാന തന്മാത്രാ രോഗകാരണം ഇപ്പോഴും മോശമായി മനസ്സിലാക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. പ്രീക്ലിനിക്കൽ മോഡലുകൾ, ക്ലിനിക്കൽ പഠനങ്ങൾ, മൾട്ടി-ഓമിക്സ് മോളിക്യുലാർ ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ എന്നിവയിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റ ശേഖരിക്കുന്നത് എഎസ്ഡിയിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന തെളിവുകൾ നൽകുന്നു13,14. എഎസ്ഡി ഉള്ള ഒരു കൂട്ടം രോഗികളിൽ ഞങ്ങൾ മുമ്പ് ഒരു ജീനോം-വൈഡ് ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷൻ സ്‌ക്രീൻ നടത്തുകയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിക് പാതകളിലൂടെ ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന ഡിഫറൻഷ്യലി മെത്തിലേറ്റഡ് ജീനുകളെ തിരിച്ചറിയുകയും ചെയ്തു15. എഎസ്ഡി16-ൽ വർദ്ധിച്ച എംടിഡിഎൻഎ പകർപ്പ് നമ്പറുമായും മാറ്റം വരുത്തിയ മൂത്ര മെറ്റബോളിക് പ്രൊഫൈലുമായും ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോജെനിസിസിന്റെയും ഡൈനാമിക്സിന്റെയും സെൻട്രൽ റെഗുലേറ്ററുകളുടെ ഡിഫറൻഷ്യൽ മെത്തിലേഷൻ ഞങ്ങൾ പിന്നീട് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു. എഎസ്ഡിയുടെ പാത്തോഫിസിയോളജിയിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സും ഹോമിയോസ്റ്റാസിസും ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു എന്നതിന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന തെളിവുകൾ നൽകുന്നു. അതിനാൽ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ്, മോർഫോളജി, ഫംഗ്ഷൻ എന്നിവ തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തെക്കുറിച്ചുള്ള മെക്കാനിസ്റ്റിക് ധാരണ മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നത് ദ്വിതീയ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയാൽ സവിശേഷതയുള്ള ന്യൂറോളജിക്കൽ രോഗങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള തുടർച്ചയായ ഗവേഷണത്തിന്റെ ഒരു പ്രധാന ലക്ഷ്യമാണ്.
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണങ്ങളിൽ നിർദ്ദിഷ്ട ജീനുകളുടെ പങ്ക് പഠിക്കാൻ തന്മാത്രാ സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ പലപ്പോഴും ഉപയോഗിക്കാറുണ്ട്. എന്നിരുന്നാലും, മൈറ്റോട്ടിക് നിയന്ത്രണ സംവിധാനങ്ങളുടെ ബഹുമുഖവും താൽക്കാലികവുമായ സ്വഭാവം ഈ സമീപനത്തെ പരിമിതപ്പെടുത്തിയേക്കാം. മാത്രമല്ല, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീനുകളുടെ ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷൻ പ്രവർത്തനപരമായ മാറ്റങ്ങളുടെ ഒരു പരോക്ഷ സൂചകമാണ്, പ്രത്യേകിച്ചും പരിമിതമായ എണ്ണം ജീനുകൾ മാത്രമേ സാധാരണയായി വിശകലനം ചെയ്യപ്പെടുന്നുള്ളൂ. അതിനാൽ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനവും ബയോ എനർജറ്റിക്സും പഠിക്കുന്നതിനുള്ള കൂടുതൽ നേരിട്ടുള്ള രീതികൾ നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്17. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സുമായി അടുത്ത ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ആകൃതി, കണക്റ്റിവിറ്റി, ഘടന എന്നിവ ഊർജ്ജ ഉൽപാദനത്തിനും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ, കോശ അതിജീവനത്തിനും നിർണായകമാണ്5,18. മാത്രമല്ല, മൈറ്റോസിസിന്റെ വിവിധ ഘടകങ്ങൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയിലെ മാറ്റങ്ങളിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിക്കുന്നു, ഇത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ ഉപയോഗപ്രദമായ അന്തിമ പോയിന്റുകളായി വർത്തിക്കുകയും തുടർന്നുള്ള മെക്കാനിസ്റ്റിക് പഠനങ്ങൾക്ക് അടിസ്ഥാനം നൽകുകയും ചെയ്തേക്കാം.
ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി (TEM) ഉപയോഗിച്ച് മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ മോർഫോളജി നേരിട്ട് നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് സെല്ലുലാർ അൾട്രാസ്ട്രക്ചറിനെക്കുറിച്ചുള്ള വിശദമായ പഠനം അനുവദിക്കുന്നു. കോശ ജനസംഖ്യയിലെ ജീൻ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ അല്ലെങ്കിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫങ്ഷണൽ പാരാമീറ്ററുകൾ എന്നിവയെ മാത്രം ആശ്രയിക്കുന്നതിനുപകരം, വ്യക്തിഗത മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ റെസല്യൂഷനിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ക്രിസ്റ്റയുടെ രൂപഘടന, ആകൃതി, ഘടന എന്നിവ TEM നേരിട്ട് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നു. കൂടാതെ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനത്തിലും ഹോമിയോസ്റ്റാസിസിലും പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്ന എൻഡോപ്ലാസ്മിക് റെറ്റിക്യുലം, ഓട്ടോഫാഗോസോമുകൾ പോലുള്ള മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയും മറ്റ് അവയവങ്ങളും തമ്മിലുള്ള ഇടപെടലുകളെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തിന് TEM സൗകര്യമൊരുക്കുന്നു. അതിനാൽ, നിർദ്ദിഷ്ട പാതകളിലോ ജീനുകളിലോ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതത പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു നല്ല ആരംഭ പോയിന്റായി ഇത് TEM-നെ മാറ്റുന്നു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫംഗ്ഷൻ ന്യൂറോപാതോളജിയിൽ കൂടുതൽ പ്രസക്തമാകുമ്പോൾ, ഇൻ വിട്രോ ന്യൂറോണൽ മോഡലുകളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജിയും ഡൈനാമിക്സും നേരിട്ടും അളവിലും പഠിക്കാൻ കഴിയേണ്ടതിന്റെ ആവശ്യകത വ്യക്തമാണ്.
ഈ ലേഖനത്തിൽ, ഓട്ടിസം സ്പെക്ട്രം ഡിസോർഡറിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ ന്യൂറോണൽ മാതൃകയിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ് ഞങ്ങൾ പരിശോധിക്കുന്നു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രൊപ്പിയോണൈൽ-CoA കാർ‌ബോക്‌സിലേസ് എൻസൈം പി‌സി‌സിയുടെ ഒരു ഉപയൂണിറ്റായ ASD15-ൽ പ്രൊപ്പിയോണൈൽ-CoA കാർ‌ബോക്‌സിലേസ് ബീറ്റ (PCCB) യുടെ ഡിഫറൻഷ്യൽ മെത്തിലേഷൻ ഞങ്ങൾ മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിരുന്നു. പി‌സി‌സിയുടെ ക്രമക്കേട് പ്രൊപ്പിയോണിക് ആസിഡ് (PPA)23,24,25 ഉൾപ്പെടെയുള്ള പ്രൊപ്പിയോണൈൽ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെ വിഷ ശേഖരണത്തിന് കാരണമാകുമെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു. PPA ന്യൂറോണൽ മെറ്റബോളിസത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും ഇൻ വിവോയിൽ സ്വഭാവം മാറ്റുകയും ചെയ്യുന്നതായി തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ ASD26,27,28-ൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ന്യൂറോ ഡെവലപ്‌മെന്റൽ മെക്കാനിസങ്ങൾ പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു സ്ഥാപിത മൃഗ മാതൃകയാണിത്. കൂടാതെ, PPA മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെംബ്രൺ പൊട്ടൻഷ്യൽ, ബയോജെനിസിസ്, ശ്വസനം എന്നിവ ഇൻ വിട്രോയിൽ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ ന്യൂറോണുകളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയെ മാതൃകയാക്കാൻ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിച്ചുവരുന്നു29,30. എന്നിരുന്നാലും, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയിലും ചലനാത്മകതയിലും PPA-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയുടെ സ്വാധീനം ഇപ്പോഴും മോശമായി മനസ്സിലാക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല.
SH-SY5Y കോശങ്ങളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജി, ഡൈനാമിക്സ്, ഫംഗ്ഷൻ എന്നിവയിൽ PPA യുടെ സ്വാധീനം അളക്കുന്നതിന് ഈ പഠനം പൂരക ഇമേജിംഗ് ടെക്നിക്കുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ആദ്യം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജിയിലും അൾട്രാസ്ട്രക്ചറിലുമുള്ള മാറ്റങ്ങൾ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ ഒരു TEM രീതി വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ ചലനാത്മക സ്വഭാവം കണക്കിലെടുത്ത്33, പി‌പി‌എ സമ്മർദ്ദത്തിൽ വിഘടനം, സംയോജനം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നമ്പർ, വോളിയം എന്നിവയ്ക്കിടയിലുള്ള സന്തുലിതാവസ്ഥയിലെ മാറ്റങ്ങൾ അളക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഇവന്റ് ലോക്കലൈസർ (MEL) വിശകലനവും ഉപയോഗിച്ചു. അവസാനമായി, ബയോജെനിസിസ്, ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ എന്നിവയിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ജീനുകളുടെ പ്രകടനത്തിലെ മാറ്റങ്ങളുമായി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജിയും ഡൈനാമിക്സും ബന്ധപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന സംവിധാനങ്ങളുടെ സങ്കീർണ്ണത വ്യക്തമാക്കുന്നതിന്റെ വെല്ലുവിളിയെ ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ വ്യക്തമാക്കുന്നു. SH-SY5Y കോശങ്ങളിലെ മൈറ്റോസിസിന്റെ അളക്കാവുന്ന കൺ‌വേർജന്റ് എൻഡ്‌പോയിന്റായി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജി പഠിക്കുന്നതിൽ TEM ന്റെ പ്രയോജനം ഞങ്ങൾ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. കൂടാതെ, മെറ്റബോളിക് സമ്മർദ്ദത്തോടുള്ള പ്രതികരണമായി ചലനാത്മക സംഭവങ്ങൾ പിടിച്ചെടുക്കുന്ന ഇമേജിംഗ് ടെക്നിക്കുകളുമായി സംയോജിപ്പിക്കുമ്പോൾ TEM ഡാറ്റ ഏറ്റവും സമ്പന്നമായ വിവരങ്ങൾ നൽകുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. ന്യൂറോണൽ സെൽ മൈറ്റോസിസിനെ പിന്തുണയ്ക്കുന്ന തന്മാത്രാ നിയന്ത്രണ സംവിധാനങ്ങളുടെ കൂടുതൽ സ്വഭാവം നാഡീവ്യവസ്ഥയുടെയും ന്യൂറോഡീജനറേറ്റീവ് രോഗങ്ങളുടെയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഘടകത്തെക്കുറിച്ച് പ്രധാനപ്പെട്ട ഉൾക്കാഴ്ച നൽകിയേക്കാം.
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സമ്മർദ്ദം ഉണ്ടാക്കുന്നതിനായി, SH-SY5Y കോശങ്ങളെ 3 mM ഉം 5 mM ഉം സോഡിയം പ്രൊപ്പിയോണേറ്റ് (NaP) ഉപയോഗിച്ച് PPA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു. TEM-ന് മുമ്പ്, ഉയർന്ന മർദ്ദത്തിലുള്ള ഫ്രീസിംഗും ഫ്രീസിംഗും ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിളുകൾ ക്രയോജനിക് സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കലിന് വിധേയമാക്കി (ചിത്രം 1a). മൂന്ന് ജൈവ പകർപ്പുകളിലായി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പോപ്പുലേഷന്റെ എട്ട് രൂപാന്തര പാരാമീറ്ററുകൾ അളക്കുന്നതിനായി ഞങ്ങൾ ഒരു ഓട്ടോമേറ്റഡ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഇമേജ് വിശകലന പൈപ്പ്‌ലൈൻ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. PPA ചികിത്സ നാല് പാരാമീറ്ററുകളെ ഗണ്യമായി മാറ്റിയതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി: ഏരിയ 2, ഏരിയ, ചുറ്റളവ്, ഫെററ്റ് വ്യാസം (ചിത്രം 1b–e). 3 mM ഉം 5 mM ഉം PPA ചികിത്സ ഉപയോഗിച്ച് ഏരിയ 2 ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു (യഥാക്രമം p = 0.0183 ഉം p = 0.002 ഉം) (ചിത്രം 1b), അതേസമയം ഏരിയ (p = 0.003), ചുറ്റളവ് (p = 0.0106), ഫെററ്റ് വ്യാസം എന്നിവയെല്ലാം ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു. നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുമായി (ചിത്രം 1c–e) താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ 5 mM ചികിത്സാ ഗ്രൂപ്പിൽ ഗണ്യമായ കുറവ് (p = 0.0172) ഉണ്ടായി. വിസ്തൃതിയിലും ചുറ്റളവിലും ഉണ്ടായ ഗണ്യമായ കുറവ്, 5 mM PPA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച കോശങ്ങളിൽ ചെറുതും കൂടുതൽ വൃത്താകൃതിയിലുള്ളതുമായ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ ഉണ്ടെന്നും, ഈ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ നിയന്ത്രണ കോശങ്ങളിലേതിനേക്കാൾ നീളം കുറഞ്ഞതാണെന്നും കാണിച്ചു. കണികകളുടെ അരികുകൾക്കിടയിലുള്ള ഏറ്റവും വലിയ ദൂരത്തിലെ കുറവിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്ന ഒരു സ്വതന്ത്ര പാരാമീറ്ററായ ഫെററ്റ് വ്യാസത്തിലെ ഗണ്യമായ കുറവുമായും ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. ക്രിസ്റ്റയുടെ അൾട്രാസ്ട്രക്ചറിലെ മാറ്റങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു: PPA സമ്മർദ്ദത്തിന്റെ സ്വാധീനത്തിൽ ക്രിസ്റ്റയ്ക്ക് കുറവ് പ്രകടമായി (ചിത്രം 1a, പാനൽ B). എന്നിരുന്നാലും, എല്ലാ ചിത്രങ്ങളും ക്രിസ്റ്റയുടെ അൾട്രാസ്ട്രക്ചറിനെ വ്യക്തമായി പ്രതിഫലിപ്പിച്ചില്ല, അതിനാൽ ഈ മാറ്റങ്ങളുടെ ഒരു അളവ് വിശകലനം നടത്തിയില്ല. ഈ TEM ഡാറ്റ മൂന്ന് സാധ്യമായ സാഹചര്യങ്ങളെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കാം: (1) PPA വിഘടനം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയോ സംയോജനത്തെ തടയുകയോ ചെയ്യുന്നു, ഇത് നിലവിലുള്ള മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ വലുപ്പം ചുരുങ്ങാൻ കാരണമാകുന്നു; (2) മെച്ചപ്പെടുത്തിയ ബയോജെനിസിസ് പുതിയതും ചെറുതുമായ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ സൃഷ്ടിക്കുന്നു അല്ലെങ്കിൽ (3) രണ്ട് സംവിധാനങ്ങളെയും ഒരേസമയം പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു. ഈ അവസ്ഥകളെ TEM ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചറിയാൻ കഴിയില്ലെങ്കിലും, PPA സമ്മർദ്ദത്തിൻ കീഴിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഹോമിയോസ്റ്റാസിസിലും ഡൈനാമിക്സിലുമുള്ള മാറ്റങ്ങളെ ഗണ്യമായ രൂപാന്തര മാറ്റങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഈ ചലനാത്മകതയെയും അവയ്ക്ക് അടിസ്ഥാനമായ സാധ്യതയുള്ള സംവിധാനങ്ങളെയും കൂടുതൽ ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ പിന്നീട് അധിക പാരാമീറ്ററുകൾ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്തു.
പ്രൊപ്പിയോണിക് ആസിഡ് (PPA) മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയെ പുനർനിർമ്മിക്കുന്നു. (a) PPA ചികിത്സ വർദ്ധിക്കുന്നതിനനുസരിച്ച് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വലുപ്പം കുറയുകയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ ചെറുതും വൃത്താകൃതിയിലാകുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് കാണിക്കുന്ന പ്രതിനിധി ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി (TEM) ചിത്രങ്ങൾ; യഥാക്രമം 0 mM (ചികിത്സിക്കപ്പെടാത്തത്), 3 mM, 5 mM എന്നിവയാണ്. ചുവന്ന അമ്പടയാളങ്ങൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. (b–e) 24 മണിക്കൂർ PPA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച SH-SY5Y സെല്ലുകൾ TEM-നായി തയ്യാറാക്കി, ഫിജി/ഇമേജ്ജെ ഉപയോഗിച്ച് ഫലങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു. എട്ട് പാരാമീറ്ററുകളിൽ നാലെണ്ണം നിയന്ത്രണ (ചികിത്സിക്കപ്പെടാത്തത്, 0 mM PPA) കോശങ്ങൾക്കും ചികിത്സിച്ച (3 mM, 5 mM PPA) കോശങ്ങൾക്കും ഇടയിൽ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ കാണിച്ചു. (b) മേഖല 2, (c) വിസ്തീർണ്ണം, (d) ചുറ്റളവ്, (e) ഫെററ്റ് വ്യാസം. വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം (കൺട്രോൾ vs. ചികിത്സ), ഡണ്ണറ്റിന്റെ മൾട്ടിപ്പിൾ താരതമ്യ പരിശോധന എന്നിവ ഗണ്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു (p < 0.05). ഡാറ്റ പോയിന്റുകൾ ഓരോ വ്യക്തിഗത സെല്ലിനുമുള്ള ശരാശരി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മൂല്യത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, കൂടാതെ പിശക് ബാറുകൾ ശരാശരി ± SEM-നെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഡാറ്റ n = 3 നെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, ഓരോ പകർപ്പിലും കുറഞ്ഞത് 24 സെല്ലുകൾ; ആകെ 266 ചിത്രങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു; * p < 0.05 സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ** p < 0.01 സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ് പി‌പി‌എയോട് എങ്ങനെ പ്രതികരിക്കുന്നു എന്ന് കൂടുതൽ വിശദീകരിക്കുന്നതിന്, ടെട്രാമെഥൈൽറോഡാമൈൻ എഥൈൽ ഈസ്റ്റർ (TMRE) ഉപയോഗിച്ച് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയെ കളർ ചെയ്തു, 3, 5 mM PPA യിൽ 24 മണിക്കൂറിനു ശേഷം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയെ പ്രാദേശികവൽക്കരിക്കാനും അളക്കാനും ടൈം-ലാപ്സ് മൈക്രോസ്കോപ്പിയും MEL വിശകലനവും ഉപയോഗിച്ചു. ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ ഇവന്റുകളുടെ ചികിത്സ. (ചിത്രം 2a). MEL വിശകലനത്തിനുശേഷം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഘടനകളുടെ എണ്ണവും അവയുടെ ശരാശരി വ്യാപ്തവും അളക്കാൻ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ കൂടുതൽ വിശകലനം ചെയ്തു. നിയന്ത്രണ സംവിധാനവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ 3 mM ൽ [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)], സംയോജനം [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)], സംയോജനം [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] ഇവന്റുകളിൽ സംഭവിക്കുന്ന വിഘടന സംഭവങ്ങളുടെ എണ്ണത്തിൽ ചെറുതും എന്നാൽ ഗണ്യമായതുമായ വർദ്ധനവ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 3b). 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)], 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] എന്നിവയിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ എണ്ണം ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു, അതേസമയം ഓരോ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഘടനയുടെയും ശരാശരി വ്യാപ്തം മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു (ചിത്രം 3c). 3d). ഒരുമിച്ച് നോക്കുമ്പോൾ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിന്റെ പുനർനിർമ്മാണം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശൃംഖലയുടെ സമഗ്രത വിജയകരമായി നിലനിർത്തുന്ന ഒരു നഷ്ടപരിഹാര പ്രതികരണമായി വർത്തിക്കുന്നുവെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. 3 mM PPA-യിൽ വിഘടന സംഭവങ്ങളുടെ എണ്ണത്തിലെ വർദ്ധനവ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ എണ്ണത്തിലെ വർദ്ധനവ് ഭാഗികമായി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വിഘടനം മൂലമാണെന്ന്, എന്നാൽ ശരാശരി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വോളിയം അടിസ്ഥാനപരമായി മാറ്റമില്ലാതെ തുടരുന്നതിനാൽ, ബയോജെനിസിസിനെ ഒരു അധിക നഷ്ടപരിഹാര പ്രതികരണമായി തള്ളിക്കളയാനാവില്ല. എന്നിരുന്നാലും, ഈ ഡാറ്റ TEM നിരീക്ഷിക്കുന്ന ചെറുതും വൃത്താകൃതിയിലുള്ളതുമായ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഘടനകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ PPA പ്രേരിപ്പിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിൽ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങൾ പ്രകടമാക്കുന്നു.
പ്രൊപ്പിയോണിക് ആസിഡ് (PPA) നെറ്റ്‌വർക്ക് സമഗ്രത നിലനിർത്തുന്നതിനായി ഡൈനാമിക് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പുനർനിർമ്മാണത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു. SH-SY5Y സെല്ലുകളെ കൾച്ചർ ചെയ്തു, 3 ഉം 5 mM PPA ഉം ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂർ ചികിത്സിച്ചു, തുടർന്ന് TMRE, Hoechst 33342 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു, തുടർന്ന് MEL വിശകലനം നടത്തി. (a) ഓരോ അവസ്ഥയ്ക്കും സമയം 2 (t2)-ൽ നിറവും ബൈനറൈസ് ചെയ്ത പരമാവധി തീവ്രത പ്രൊജക്ഷനുകളും ചിത്രീകരിക്കുന്ന പ്രതിനിധി ടൈം-ലാപ്സ് മൈക്രോസ്കോപ്പി ചിത്രങ്ങൾ. ഓരോ ബൈനറി ഇമേജിലും സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന തിരഞ്ഞെടുത്ത പ്രദേശങ്ങൾ മെച്ചപ്പെടുത്തി മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത സമയ ഫ്രെയിമുകളിൽ (t1-t3) 3D-യിൽ കാലക്രമേണ ചലനാത്മകത ചിത്രീകരിക്കുന്നു; സംയോജന ഇവന്റുകൾ പച്ചയിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു; വിഘടന ഇവന്റുകൾ പച്ചയിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു. ചുവപ്പിൽ പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. (b) ഓരോ അവസ്ഥയ്ക്കും ഡൈനാമിക് ഇവന്റുകളുടെ ശരാശരി എണ്ണം. (c) ഓരോ സെല്ലിനും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഘടനകളുടെ ശരാശരി എണ്ണം. (d) ഓരോ സെല്ലിനും ഓരോ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഘടനയുടെയും ശരാശരി വോളിയം (µm3). കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഡാറ്റ ചികിത്സാ ഗ്രൂപ്പിന് n = 15 സെല്ലുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. കാണിച്ചിരിക്കുന്ന പിശക് ബാറുകൾ ശരാശരി ± SEM, സ്കെയിൽ ബാർ = 10 μm, * p < 0.05 എന്നിവയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
പ്രൊപ്പിയോണിക് ആസിഡ് (PPA) മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ അടിച്ചമർത്തലിന് കാരണമാകുന്നു. SH-SY5Y കോശങ്ങളെ 3 ഉം 5 mM PPA ഉം ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂർ ചികിത്സിച്ചു. RT-qPCR ഉപയോഗിച്ച് ആപേക്ഷിക ജീൻ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ നടത്തി B2M ആയി നോർമലൈസ് ചെയ്തു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോജെനിസിസ് ജീനുകൾ (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1, (d) NFE2L2. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്യൂഷനും ഫിഷൻ ജീനുകളും (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2, (i) DRP1. ഗണ്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ (p < 0.05) വൺ-വേ ANOVA (നിയന്ത്രണം vs. ചികിത്സ) ഉപയോഗിച്ച് പരീക്ഷിച്ചു, ഡണ്ണറ്റിന്റെ മൾട്ടിപ്പിൾ താരതമ്യ പരിശോധന: * p < 0.05 സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ** p < 0.01 സൂചിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ **** p < 0.0001 സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ബാറുകൾ ശരാശരി എക്സ്പ്രഷനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു ± SEM. കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഡാറ്റ n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) ജൈവ പകർപ്പുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
TEM, MEL വിശകലനങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റ ഒരുമിച്ച് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് PPA മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയെയും ചലനാത്മകതയെയും മാറ്റുന്നു എന്നാണ്. എന്നിരുന്നാലും, ഈ ഇമേജിംഗ് ടെക്നിക്കുകൾ ഈ പ്രക്രിയകളെ നയിക്കുന്ന അടിസ്ഥാന സംവിധാനങ്ങളെക്കുറിച്ച് ഉൾക്കാഴ്ച നൽകുന്നില്ല. അതിനാൽ, PPA ചികിത്സയ്ക്കുള്ള പ്രതികരണമായി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ്, ബയോജെനിസിസ്, മൈറ്റോസിസ് എന്നിവയുടെ ഒമ്പത് പ്രധാന റെഗുലേറ്ററുകളുടെ mRNA എക്സ്പ്രഷൻ ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. 3 mM ഉം 5 mM ഉം PPA ഉപയോഗിച്ചുള്ള 24 മണിക്കൂർ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം, സെൽ മൈലോമ ഓങ്കോജീൻ (cMYC), ന്യൂക്ലിയർ റെസ്പിറേറ്ററി ഫാക്ടർ (NRF1), മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ 1 (TFAM), NFE2-പോലുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ BZIP (NFE2L2), ഗ്യാസ്ട്രിൻ പോലുള്ള പ്രോട്ടീൻ 2 (STOML2), ഒപ്റ്റിക് നാഡി അട്രോഫി 1 (OPA1), മൈറ്റോഫുസിൻ 1 (MFN1), മൈറ്റോഫുസിൻ 2 (MFN2), ഡൈനാമിൻ-ബന്ധിത പ്രോട്ടീൻ 1 (DRP1) എന്നിവ ഞങ്ങൾ അളന്നു. ഞങ്ങൾ 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415, p < 0.0001, യഥാക്രമം) ഉം 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) ഉം PPA ചികിത്സ നിരീക്ഷിച്ചു. (ചിത്രം 3a–c). mRNA എക്സ്പ്രഷനിലെ കുറവ് ഡോസ്-ആശ്രിതമായിരുന്നു: cMYC, NRF1, TFAM എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ 3 mM-ൽ യഥാക്രമം 5.7, 2.6, 1.9 തവണയും 5 mM-ൽ 11.2, 3, 2.2 തവണയും കുറഞ്ഞു. ഇതിനു വിപരീതമായി, PPA-യുടെ ഒരു സാന്ദ്രതയിലും സെൻട്രൽ റെഡോക്സ് ബയോജെനിസിസ് ജീൻ NFE2L2 മാറിയില്ല, എന്നിരുന്നാലും സമാനമായ ഡോസ്-ആശ്രിത എക്സ്പ്രഷൻ കുറയുന്ന പ്രവണത നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം 3d).
ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ എന്നിവയുടെ നിയന്ത്രണത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ക്ലാസിക്കൽ ജീനുകളുടെ എക്സ്പ്രഷനും ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. STOML2 ഫ്യൂഷൻ, മൈറ്റോഫാഗി, ബയോജെനിസിസ് എന്നിവയിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് കരുതപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ അതിന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ 3 mM (2.4-മടങ്ങ് മാറ്റം) ഉം 5 mM (2.8-മടങ്ങ് മാറ്റം) PPA (ചിത്രം 1) ഉം ഗണ്യമായി കുറച്ചു (p < 0.0001). അതുപോലെ, OPA1 ഫ്യൂഷൻ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ 3 mM (1.6-മടങ്ങ് മാറ്റം) ഉം 5 mM (1.9-മടങ്ങ് മാറ്റം) PPA (യഥാക്രമം p = 0.006 ഉം p = 0.0024 ഉം) ആയി കുറഞ്ഞു (ചിത്രം 3f). എന്നിരുന്നാലും, 24-h PPA സമ്മർദ്ദത്തിൽ (ചിത്രം 3g–i) ഫ്യൂഷൻ ജീനുകൾ MFN1, MFN2 അല്ലെങ്കിൽ ഫിഷൻ ജീൻ DRP1 എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷനിൽ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയില്ല. കൂടാതെ, നാല് ഫ്യൂഷൻ, ഫിഷൻ പ്രോട്ടീനുകളുടെ (OPA1, MFN1, MFN2, DRP1) അളവ് ഒരേ സാഹചര്യങ്ങളിൽ മാറിയിട്ടില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 4a–d). ഈ ഡാറ്റ ഒരു സമയ ബിന്ദുവിനെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നുവെന്നും PPA സമ്മർദ്ദത്തിന്റെ പ്രാരംഭ ഘട്ടങ്ങളിൽ പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷനിലോ പ്രവർത്തന നിലയിലോ ഉള്ള മാറ്റങ്ങളെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കില്ലെന്നും ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. എന്നിരുന്നാലും, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, OPA1 എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷനിലെ ഗണ്യമായ കുറവുകൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിസം, ബയോജെനിസിസ്, ഡൈനാമിക്സ് എന്നിവയുടെ ഗണ്യമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ ഡിസ്റെഗുലേഷനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. കൂടാതെ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫംഗ്ഷനിലെ എൻഡ്-സ്റ്റേറ്റ് മാറ്റങ്ങൾ നേരിട്ട് പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഇമേജിംഗ് ടെക്നിക്കുകളുടെ പ്രയോജനത്തെ ഈ ഡാറ്റ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.
പ്രൊപ്പിയോണിക് ആസിഡ് (PPA) ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷവും ഫ്യൂഷൻ, ഫിഷൻ ഫാക്ടർ പ്രോട്ടീൻ ലെവലുകൾ മാറിയില്ല. SH-SY5Y സെല്ലുകളെ 3 ഉം 5 mM PPA ഉം ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂർ ചികിത്സിച്ചു. വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് വിശകലനം വഴി പ്രോട്ടീൻ ലെവലുകൾ കണക്കാക്കി, എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ മൊത്തം പ്രോട്ടീനിലേക്ക് സാധാരണമാക്കി. ശരാശരി പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷനും ടാർഗെറ്റിന്റെയും മൊത്തം പ്രോട്ടീന്റെയും പ്രതിനിധി വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടുകളും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. ബാറുകൾ ശരാശരി ± SEM നെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഡാറ്റ n = 3 ബയോളജിക്കൽ റെപ്ലിക്കേറ്റുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനവും ഡണ്ണറ്റിന്റെ പരിശോധനയും ഉപയോഗിച്ച് ഒന്നിലധികം താരതമ്യങ്ങൾ (p < 0.05) നടത്തി. യഥാർത്ഥ ജെല്ലും ബ്ലോട്ടും ചിത്രം S1 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ഡിസ്ഫങ്ഷൻ, മെറ്റബോളിക്, കാർഡിയോവാസ്കുലാർ, പേശി രോഗങ്ങൾ മുതൽ ന്യൂറോളജിക്കൽ രോഗങ്ങൾ വരെയുള്ള മൾട്ടിസിസ്റ്റം രോഗങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു1,10. പല ന്യൂറോഡീജനറേറ്റീവ്, ന്യൂറോഡീജനറേറ്റീവ് രോഗങ്ങളും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡിസ്ഫങ്ഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് തലച്ചോറിന്റെ ആയുസ്സ് മുഴുവൻ ഈ അവയവങ്ങളുടെ പ്രാധാന്യം എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. പാർക്കിൻസൺസ് രോഗം, അൽഷിമേഴ്സ് രോഗം, ASD3,4,18 എന്നിവ ഈ രോഗങ്ങളിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ഈ രോഗങ്ങളെക്കുറിച്ച് പഠിക്കാൻ മസ്തിഷ്ക കലകളിലേക്കുള്ള പ്രവേശനം ബുദ്ധിമുട്ടാണ്, പ്രത്യേകിച്ച് മെക്കാനിസ്റ്റിക് തലത്തിൽ, സെല്ലുലാർ മോഡൽ സിസ്റ്റങ്ങളെ ഒരു ആവശ്യമായ ബദലാക്കി മാറ്റുന്നു. ഈ പഠനത്തിൽ, ന്യൂറോണൽ രോഗങ്ങളിൽ, പ്രത്യേകിച്ച് ഓട്ടിസം സ്പെക്ട്രം ഡിസോർഡറുകളിൽ കാണപ്പെടുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡിസ്ഫങ്ഷൻ പുനഃസംഗ്രഹിക്കാൻ PPA- ചികിത്സിച്ച SH-SY5Y സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു സെല്ലുലാർ മോഡൽ സിസ്റ്റം ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ന്യൂറോണുകളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ് പഠിക്കാൻ ഈ PPA മോഡൽ ഉപയോഗിക്കുന്നത് ASD യുടെ എറ്റിയോളജിയെക്കുറിച്ചുള്ള ഉൾക്കാഴ്ച നൽകിയേക്കാം.
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജിയിലെ മാറ്റങ്ങൾ കാണുന്നതിന് TEM ഉപയോഗിക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യത ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. അതിന്റെ ഫലപ്രാപ്തി പരമാവധിയാക്കാൻ TEM ശരിയായി ഉപയോഗിക്കണമെന്ന് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടത് പ്രധാനമാണ്. ക്രയോ-സ്പെസിമെൻ തയ്യാറാക്കൽ ഒരേസമയം സെല്ലുലാർ ഘടകങ്ങൾ ശരിയാക്കുന്നതിലൂടെയും ആർട്ടിഫാക്റ്റുകളുടെ രൂപീകരണം കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെയും ന്യൂറോണൽ ഘടനകളെ മികച്ച രീതിയിൽ സംരക്ഷിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു34. ഇതിന് അനുസൃതമായി, ന്യൂറോൺ പോലുള്ള SH-SY5Y കോശങ്ങൾക്ക് കേടുകൂടാത്ത ഉപകോശ അവയവങ്ങളും നീളമേറിയ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയും ഉണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 1a). ന്യൂറോണൽ സെൽ മോഡലുകളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജി പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ക്രയോജനിക് തയ്യാറെടുപ്പ് സാങ്കേതിക വിദ്യകളുടെ പ്രയോജനം ഇത് എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. TEM ഡാറ്റയുടെ വസ്തുനിഷ്ഠമായ വിശകലനത്തിന് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് അളവുകൾ നിർണായകമാണെങ്കിലും, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജിക്കൽ മാറ്റങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിന് ഏതൊക്കെ നിർദ്ദിഷ്ട പാരാമീറ്ററുകൾ അളക്കണമെന്ന് ഇപ്പോഴും സമവായമില്ല. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജി 17,31,32 അളവനുസരിച്ച് പരിശോധിച്ച നിരവധി പഠനങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, എട്ട് മോർഫോളജിക്കൽ പാരാമീറ്ററുകൾ അളക്കുന്ന ഒരു ഓട്ടോമേറ്റഡ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഇമേജ് വിശകലന പൈപ്പ്‌ലൈൻ ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു: വിസ്തീർണ്ണം, വിസ്തീർണ്ണം2, വീക്ഷണാനുപാതം, ചുറ്റളവ്, വൃത്താകൃതി, ഡിഗ്രി, ഫെററ്റ് വ്യാസം. വൃത്താകൃതി.
അവയിൽ, PPA വിസ്തീർണ്ണം 2, വിസ്തീർണ്ണം, ചുറ്റളവ്, ഫെററ്റ് വ്യാസം എന്നിവ ഗണ്യമായി കുറച്ചു (ചിത്രം 1b–e). മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ ചെറുതും വൃത്താകൃതിയിലുള്ളതുമായി മാറിയെന്ന് ഇത് കാണിച്ചു, PPA30-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സമ്മർദ്ദം 72 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞതിന് ശേഷം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വിസ്തൃതിയിൽ കുറവ് കാണിക്കുന്ന മുൻ പഠനങ്ങളുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. മൈറ്റോഫോളജിക്കൽ സവിശേഷതകൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വിഘടനത്തെ സൂചിപ്പിക്കാം, മൈറ്റോഫാഗി35,36,37 വഴി അവയുടെ അപചയം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കിൽ നിന്ന് കേടായ ഘടകങ്ങളെ വേർതിരിക്കുന്നതിന് ആവശ്യമായ പ്രക്രിയയാണിത്. മറുവശത്ത്, ശരാശരി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വലുപ്പത്തിലെ കുറവ് വർദ്ധിച്ച ബയോജെനിസിസുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം, ഇത് ചെറിയ നവജാത മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ രൂപീകരണത്തിന് കാരണമാകുന്നു. വർദ്ധിച്ച ഫിഷൻ അല്ലെങ്കിൽ ബയോജെനിസിസ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സമ്മർദ്ദത്തിനെതിരെ മൈറ്റോസിസ് നിലനിർത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു നഷ്ടപരിഹാര പ്രതികരണത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വളർച്ച കുറയൽ, വൈകല്യമുള്ള സംയോജനം അല്ലെങ്കിൽ മറ്റ് അവസ്ഥകൾ എന്നിവ ഒഴിവാക്കാനാവില്ല.
TEM സൃഷ്ടിച്ച ഉയർന്ന റെസല്യൂഷൻ ചിത്രങ്ങൾ വ്യക്തിഗത മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ തലത്തിൽ രൂപാന്തര സവിശേഷതകൾ നിർണ്ണയിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, ഈ രീതി ഒരൊറ്റ ഘട്ടത്തിൽ ദ്വിമാന സ്നാപ്പ്ഷോട്ടുകൾ നിർമ്മിക്കുന്നു. ഉപാപചയ സമ്മർദ്ദത്തോടുള്ള ചലനാത്മക പ്രതികരണങ്ങൾ പഠിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ TMRE ഉപയോഗിച്ച് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയെ കളർ ചെയ്യുകയും MEL വിശകലനത്തോടുകൂടിയ ടൈം-ലാപ്സ് മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു, ഇത് കാലക്രമേണ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കിലെ മാറ്റങ്ങളുടെ ഉയർന്ന-ത്രൂപുട്ട് 3D ദൃശ്യവൽക്കരണം അനുവദിക്കുന്നു33,38. PPA സമ്മർദ്ദത്തിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിൽ സൂക്ഷ്മവും എന്നാൽ പ്രധാനപ്പെട്ടതുമായ മാറ്റങ്ങൾ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 2). 3 mM-ൽ, ഫിഷൻ ഇവന്റുകളുടെ എണ്ണം ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു, അതേസമയം ഫ്യൂഷൻ ഇവന്റുകൾ നിയന്ത്രണത്തിലെന്നപോലെ തന്നെ തുടർന്നു. ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ ഇവന്റുകളുടെ എണ്ണത്തിൽ 5 mM PPA-യിൽ വർദ്ധനവ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, പക്ഷേ ഈ മാറ്റങ്ങൾ ഏകദേശം ആനുപാതികമായിരുന്നു, ഇത് ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ ചലനാത്മകത സന്തുലിതാവസ്ഥയിലെത്തുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 2b). 3, 5 mM PPA-കളിൽ ശരാശരി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വോളിയം മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു, ഇത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കിന്റെ സമഗ്രത സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 2d). ഇത് ചലനാത്മകമായ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കുകളുടെ നേരിയ മെറ്റബോളിക് സമ്മർദ്ദത്തോട് പ്രതികരിക്കാനുള്ള കഴിവിനെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു, അതുവഴി നെറ്റ്‌വർക്ക് വിഘടനത്തിന് കാരണമാകാതെ ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ് ഫലപ്രദമായി നിലനിർത്താൻ കഴിയും. 3 mM PPA-യിൽ, ഫിഷനിലെ വർദ്ധനവ് ഒരു പുതിയ സന്തുലിതാവസ്ഥയിലേക്കുള്ള പരിവർത്തനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് പര്യാപ്തമാണ്, എന്നാൽ PPA-യുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത മൂലമുണ്ടാകുന്ന സമ്മർദ്ദത്തിന് പ്രതികരണമായി കൂടുതൽ ആഴത്തിലുള്ള ചലനാത്മക പുനർനിർമ്മാണം ആവശ്യമാണ്.
രണ്ട് പിപിഎ സ്ട്രെസ് സാന്ദ്രതകളിലും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ എണ്ണം വർദ്ധിച്ചു, പക്ഷേ ശരാശരി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വോളിയം കാര്യമായി മാറിയില്ല (ചിത്രം 2c). ഇത് വർദ്ധിച്ച ബയോജെനിസിസ് അല്ലെങ്കിൽ വർദ്ധിച്ച ഡിവിഷൻ മൂലമാകാം; എന്നിരുന്നാലും, ശരാശരി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വോള്യത്തിൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടാകാത്ത സാഹചര്യത്തിൽ, ബയോസിന്തസിസ് വർദ്ധിക്കാനുള്ള സാധ്യത കൂടുതലാണ്. എന്നിരുന്നാലും, ചിത്രം 2 ലെ ഡാറ്റ രണ്ട് കോമ്പൻസേറ്ററി മെക്കാനിസങ്ങളുടെ നിലനിൽപ്പിനെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു: മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫിഷന്റെ അപ്‌റെഗുലേഷനുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ഫിഷൻ ഇവന്റുകളുടെ എണ്ണത്തിലെ വർദ്ധനവ്, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോജെനിസിസുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ഇവന്റുകളുടെ എണ്ണത്തിലെ വർദ്ധനവ്. ആത്യന്തികമായി, നേരിയ സമ്മർദ്ദത്തിനുള്ള ഡൈനാമിക് നഷ്ടപരിഹാരത്തിൽ ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ, ബയോജെനിസിസ്, മൈറ്റോഫാഗി എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരേസമയം പ്രക്രിയകൾ അടങ്ങിയിരിക്കാം. മുൻ രചയിതാക്കൾ പിപിഎ മൈറ്റോസിസ് 30,39, മൈറ്റോഫാഗി 29 എന്നിവ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് കാണിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, പിപിഎയ്ക്കുള്ള പ്രതികരണമായി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ ഡൈനാമിക്സ് എന്നിവയുടെ പുനർനിർമ്മാണത്തിനുള്ള തെളിവുകൾ ഞങ്ങൾ നൽകുന്നു. ഈ ഡാറ്റ TEM നിരീക്ഷിച്ച രൂപാന്തരപരമായ മാറ്റങ്ങളെ സ്ഥിരീകരിക്കുകയും PPA-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡിസ്ഫൻക്ഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ട മെക്കാനിസങ്ങളെക്കുറിച്ച് കൂടുതൽ ഉൾക്കാഴ്ച നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു.
TEM അല്ലെങ്കിൽ MEL വിശകലനം നിരീക്ഷിച്ച രൂപാന്തര മാറ്റങ്ങൾക്ക് അടിസ്ഥാനമായ ജീൻ നിയന്ത്രണ സംവിധാനങ്ങളുടെ നേരിട്ടുള്ള തെളിവുകൾ നൽകിയിട്ടില്ലാത്തതിനാൽ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിസം, ബയോജെനിസിസ്, ഡൈനാമിക്സ് എന്നിവയിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ജീനുകളുടെ RNA എക്സ്പ്രഷൻ ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. cMYC പ്രോട്ടോ-ഓങ്കോജീൻ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ, ഗ്ലൈക്കോളിസിസ്, അമിനോ ആസിഡ്, ഫാറ്റി ആസിഡ് മെറ്റബോളിസം എന്നിവയുടെ നിയന്ത്രണത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ഒരു ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകമാണ്. കൂടാതെ, NRF1, TFAM41 എന്നിവയുൾപ്പെടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, വിവർത്തനം, സങ്കീർണ്ണമായ അസംബ്ലി എന്നിവയിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ഏകദേശം 600 മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീനുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്നതായി cMYC അറിയപ്പെടുന്നു. mtDNA റെപ്ലിക്കേഷൻ സജീവമാക്കുന്നതിന് PGC-1α യുടെ താഴേക്ക് പ്രവർത്തിക്കുന്ന മൈറ്റോസിസിന്റെ രണ്ട് കേന്ദ്ര റെഗുലേറ്ററുകളാണ് NRF1, TFAM എന്നിവ. ഈ പാത cAMP, AMPK സിഗ്നലിംഗ് വഴി സജീവമാക്കുകയും ഊർജ്ജ ചെലവിനും ഉപാപചയ സമ്മർദ്ദത്തിനും സെൻസിറ്റീവ് ആകുകയും ചെയ്യുന്നു. PPA യുടെ ഫലങ്ങൾ ഓക്സിഡേറ്റീവ് സ്ട്രെസ് വഴി മധ്യസ്ഥത വഹിക്കപ്പെടുമോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോജെനിസിസിന്റെ ഒരു റെഡോക്സ് റെഗുലേറ്ററായ NFE2L2 ഉം ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.
NFE2L2 എക്സ്പ്രഷൻ മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നെങ്കിലും, 3 mM ഉം 5 mM PPA ഉം ഉപയോഗിച്ചുള്ള 24 മണിക്കൂർ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം cMYC, NRF1, TFAM എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷനിൽ സ്ഥിരമായ ഡോസ്-ആശ്രിത കുറവ് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 3a-c). മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സമ്മർദ്ദത്തോടുള്ള പ്രതികരണമായി cMYC എക്സ്പ്രഷന്റെ കുറവ് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്42, കൂടാതെ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിസം, നെറ്റ്‌വർക്ക് കണക്റ്റിവിറ്റി, മെംബ്രൻ പോളറൈസേഷൻ എന്നിവ പുനർനിർമ്മിക്കുന്നതിലൂടെ cMYC എക്സ്പ്രഷന്റെ കുറവ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയ്ക്ക് കാരണമാകും43. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, cMYC മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ42,43 എന്നിവയുടെ നിയന്ത്രണത്തിലും പങ്കാളിയാണ്, കൂടാതെ കോശവിഭജന സമയത്ത് DRP1 ഫോസ്ഫോറിലേഷനും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ലോക്കലൈസേഷനും വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ന്യൂറോണൽ സ്റ്റെം സെല്ലുകളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജിക്കൽ റീമോഡലിംഗിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു45. വാസ്തവത്തിൽ, cMYC-കുറവുള്ള ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകൾ PPA43 സമ്മർദ്ദം മൂലമുണ്ടാകുന്ന മാറ്റങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വലുപ്പം കുറയുന്നു. ഈ ഡാറ്റ cMYC യും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സും തമ്മിലുള്ള രസകരവും എന്നാൽ ഇതുവരെ വ്യക്തമല്ലാത്തതുമായ ഒരു ബന്ധത്തെ ചിത്രീകരിക്കുന്നു, ഇത് PPA സമ്മർദ്ദം മൂലമുണ്ടാകുന്ന പുനർനിർമ്മാണത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഭാവി പഠനങ്ങൾക്ക് രസകരമായ ഒരു ലക്ഷ്യം നൽകുന്നു.
NRF1, TFAM എന്നിവയുടെ കുറവ് ഒരു പ്രധാന ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ ആക്റ്റിവേറ്ററായി cMYC യുടെ പങ്കിനോട് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. മനുഷ്യ വൻകുടൽ കാൻസർ കോശങ്ങളിലെ മുൻ പഠനങ്ങളുമായി ഈ ഡാറ്റ പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, PPA 22 മണിക്കൂറിൽ NRF1 mRNA എക്സ്പ്രഷൻ കുറച്ചുവെന്ന് ഇത് കാണിക്കുന്നു, ഇത് ATP ശോഷണവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ROS46 വർദ്ധിപ്പിച്ചു. TFAM എക്സ്പ്രഷൻ 8.5 മണിക്കൂറിൽ വർദ്ധിച്ചെങ്കിലും 22 മണിക്കൂറിൽ അടിസ്ഥാന നിലയിലേക്ക് മടങ്ങിയെന്നും ഈ രചയിതാക്കൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു. ഇതിനു വിപരീതമായി, SH-SY5Y കോശങ്ങളിൽ 4 മണിക്കൂർ PPA സമ്മർദ്ദത്തിന് ശേഷം TFAM mRNA എക്സ്പ്രഷൻ ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞുവെന്ന് കിം തുടങ്ങിയവർ (2019) കാണിച്ചു; എന്നിരുന്നാലും, 72 മണിക്കൂറിനു ശേഷം, TFAM പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു, mtDNA പകർപ്പ് എണ്ണം ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു. അതിനാൽ, 24 മണിക്കൂറിനു ശേഷം ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ച മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോജെനിസിസ് ജീനുകളുടെ എണ്ണത്തിലെ കുറവ്, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ എണ്ണത്തിലെ വർദ്ധനവ് മുമ്പത്തെ സമയ പോയിന്റുകളിൽ ബയോജെനിസിസ് സജീവമാക്കുന്നതുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു എന്ന സാധ്യതയെ ഒഴിവാക്കുന്നില്ല. മുൻ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് PPA 4 മണിക്കൂർ 30 മിനിറ്റിൽ SH-SY5Y കോശങ്ങളിൽ PGC-1α mRNA, പ്രോട്ടീൻ എന്നിവയെ ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു എന്നാണ്, അതേസമയം പ്രൊപ്പിയോണിക് ആസിഡ് 12 മണിക്കൂർ 39 മിനിറ്റിൽ PGC-1α വഴി കാൾഫ് ഹെപ്പറ്റോസൈറ്റുകളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോജെനിസിസ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, PGC-1α NRF1, TFAM എന്നിവയുടെ നേരിട്ടുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ റെഗുലേറ്റർ മാത്രമല്ല, ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ എന്നിവ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ MFN2, DRP1 എന്നിവയുടെ പ്രവർത്തനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതായും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, PPA പ്രേരിപ്പിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ കോമ്പൻസേറ്ററി പ്രതികരണങ്ങളെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന സംവിധാനങ്ങളുടെ അടുത്ത സംയോജനത്തെ ഇത് എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. മാത്രമല്ല, PPA സമ്മർദ്ദത്തിൽ ബയോജെനിസിസിന്റെയും മെറ്റബോളിസത്തിന്റെയും ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ റെഗുലേഷന്റെ ഗണ്യമായ ക്രമക്കേടുകൾ ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു.
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫിഷൻ, ഫ്യൂഷൻ, ഡൈനാമിക്സ് എന്നിവയുടെ കേന്ദ്ര റെഗുലേറ്ററുകളിൽ STOML2, OPA1, MFN1, MFN2, DRP1 ജീനുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു37,48,49. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന മറ്റ് നിരവധി ജീനുകൾ ഉണ്ട്, എന്നിരുന്നാലും, ASD കൂട്ടങ്ങളിൽ STOML2, OPA1, MFN2 എന്നിവ വ്യത്യസ്തമായി മെത്തിലേറ്റ് ചെയ്യപ്പെട്ടതായി മുമ്പ് കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്,16 കൂടാതെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സമ്മർദ്ദത്തോടുള്ള പ്രതികരണമായി ഈ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളിൽ മാറ്റങ്ങൾ നിരവധി സ്വതന്ത്ര പഠനങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്50,51. 52. OPA1, STOML2 എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ 3 mM ഉം 5 mM ഉം PPA ചികിത്സ ഗണ്യമായി കുറച്ചു (ചിത്രം 3e, f). MFN1, 2 എന്നിവയുമായുള്ള നേരിട്ടുള്ള ഇടപെടലിലൂടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്യൂഷന്റെ ക്ലാസിക്കൽ റെഗുലേറ്ററുകളിൽ ഒന്നാണ് OPA1, ക്രിസ്റ്റേ പുനർനിർമ്മാണത്തിലും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയിലും ഒരു പങ്ക് വഹിക്കുന്നു53. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിൽ STOML2 ന്റെ കൃത്യമായ പങ്ക് വ്യക്തമല്ല, പക്ഷേ തെളിവുകൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്യൂഷൻ, ബയോജെനിസിസ്, മൈറ്റോഫാഗി എന്നിവയിൽ ഇത് ഒരു പങ്കു വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്നാണ്.
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ റെസ്പിറേറ്ററി കപ്ലിംഗ്, റെസ്പിറേറ്ററി ചെയിൻ കോംപ്ലക്സുകളുടെ രൂപീകരണം എന്നിവ നിലനിർത്തുന്നതിൽ STOML2 പങ്കാളിയാണ്54,55 കൂടാതെ കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ ഉപാപചയ സ്വഭാവസവിശേഷതകളെ ആഴത്തിൽ മാറ്റുന്നതായി തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്56. BAN, കാർഡിയോലിപിൻ എന്നിവയുമായുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിലൂടെ STOML2 മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെംബ്രൻ സാധ്യതയെയും ബയോജെനിസിസിനെയും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് 55,57,58. കൂടാതെ, STOML2 ഉം PINK1 ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം മൈറ്റോഫാഗിയെ നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്ന് സ്വതന്ത്ര പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്59,60. ശ്രദ്ധേയമായി, STOML2 MFN2 മായി നേരിട്ട് ഇടപഴകുകയും സ്ഥിരപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ OPA1 ഡീഗ്രഡേഷന് കാരണമായ പ്രോട്ടീസിനെ തടഞ്ഞുകൊണ്ട് ദൈർഘ്യമേറിയ OPA1 ഐസോഫോമുകളെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നതിലും ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. PPA പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളിൽ കാണപ്പെടുന്ന STOML2 എക്സ്പ്രഷനിലെ കുറവ് ഈ ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകളെ ubiquitin- ഉം പ്രോട്ടീസോമിനെ ആശ്രയിച്ചുള്ള പാതകളിലൂടെ ഡീഗ്രഡേഷന് കൂടുതൽ സാധ്യതയുള്ളതാക്കും48. PPA യോടുള്ള ചലനാത്മക പ്രതികരണത്തിൽ STOML2 ഉം OPA1 ഉം തമ്മിലുള്ള കൃത്യമായ പങ്ക് വ്യക്തമല്ലെങ്കിലും, ഈ ഫ്യൂഷൻ ജീനുകളുടെ പ്രകടനത്തിലെ കുറവ് (ചിത്രം 3) വിഘടനത്തിനും സംയോജനത്തിനും ഇടയിലുള്ള സന്തുലിതാവസ്ഥയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വലുപ്പം കുറയാൻ കാരണമാവുകയും ചെയ്യും (ചിത്രം 3). 1).
മറുവശത്ത്, 24 മണിക്കൂറിനു ശേഷവും OPA1 പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു, അതേസമയം PPA ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം MFN1, MFN2 അല്ലെങ്കിൽ DRP1 എന്നിവയുടെ mRNA, പ്രോട്ടീൻ അളവ് കാര്യമായി മാറിയില്ല (ചിത്രം 3g-i, ചിത്രം 4). മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്യൂഷനിലും വിഘടനത്തിലും ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ഈ ഘടകങ്ങളുടെ നിയന്ത്രണത്തിൽ മാറ്റങ്ങളൊന്നുമില്ലെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കാം. എന്നിരുന്നാലും, ഈ നാല് ജീനുകളിൽ ഓരോന്നും പ്രോട്ടീൻ പ്രവർത്തനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന പോസ്റ്റ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ മോഡിഫിക്കേഷനുകൾ (PTM-കൾ) വഴി നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. OPA1-ന് എട്ട് ഇതര സ്പ്ലൈസ് വകഭേദങ്ങളുണ്ട്, അവ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത ഐസോഫോമുകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയിൽ പ്രോട്ടിയോലൈറ്റിക്കലായി പിളർന്നിരിക്കുന്നു 63. ദീർഘവും ഹ്രസ്വവുമായ ഐസോഫോമുകൾ തമ്മിലുള്ള സന്തുലിതാവസ്ഥ ആത്യന്തികമായി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്യൂഷനിലും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കിന്റെ പരിപാലനത്തിലും OPA1 ന്റെ പങ്ക് നിർണ്ണയിക്കുന്നു64. കാൽസ്യം/കാൽമോഡുലിൻ-ആശ്രിത പ്രോട്ടീൻ കൈനേസ് II (CaMKII) ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ വഴിയാണ് DRP1 പ്രവർത്തനം നിയന്ത്രിക്കുന്നത്, അതേസമയം DRP1 ഡീഗ്രഡേഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്നത് ubiquitination, SUMOylation65 എന്നിവയിലൂടെയാണ്. അവസാനമായി, DRP1 ഉം MFN1/2 ഉം GTPases ആണ്, അതിനാൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയിലെ GTP ഉൽ‌പാദന നിരക്ക് പ്രവർത്തനത്തെ സ്വാധീനിച്ചേക്കാം [66]. അതിനാൽ, ഈ പ്രോട്ടീനുകളുടെ പ്രകടനത്തിൽ സ്ഥിരമായ ഒരു മാറ്റമുണ്ടെങ്കിലും, ഇത് മാറ്റമില്ലാത്ത പ്രോട്ടീൻ പ്രവർത്തനത്തെയോ പ്രാദേശികവൽക്കരണത്തെയോ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കില്ല. വാസ്തവത്തിൽ, നിലവിലുള്ള PTM പ്രോട്ടീൻ ശേഖരങ്ങൾ പലപ്പോഴും അക്യൂട്ട് സ്ട്രെസ് പ്രതികരണങ്ങൾക്ക് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്ന പ്രതിരോധത്തിന്റെ ആദ്യ നിരയായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു. ഞങ്ങളുടെ മോഡലിൽ മിതമായ മെറ്റബോളിക് സ്ട്രെസ് സാന്നിധ്യത്തിൽ, mRNA അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടീൻ തലത്തിൽ ഈ ജീനുകളുടെ അധിക സജീവമാക്കൽ ആവശ്യമില്ലാതെ തന്നെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സമഗ്രത പുനഃസ്ഥാപിക്കുന്നതിന് PTM ഫ്യൂഷൻ, ഫിഷൻ പ്രോട്ടീനുകളുടെ വർദ്ധിച്ച പ്രവർത്തനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്.
മുകളിൽ പറഞ്ഞ ഡാറ്റ ഒരുമിച്ച് എടുത്തുകാണിക്കുന്നത്, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയുടെ സങ്കീർണ്ണവും സമയബന്ധിതവുമായ നിയന്ത്രണത്തെയും ഈ സംവിധാനങ്ങൾ വ്യക്തമാക്കുന്നതിലെ വെല്ലുവിളികളെയും എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ പഠിക്കാൻ, പാതയിലെ നിർദ്ദിഷ്ട ലക്ഷ്യ ജീനുകളെ തിരിച്ചറിയേണ്ടത് ആദ്യം ആവശ്യമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, ഒരേ പാതയിലെ ജീനുകൾ ഒരേ സമ്മർദ്ദത്തോട് ഒരേ രീതിയിൽ പ്രതികരിക്കുന്നില്ലെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നു. വാസ്തവത്തിൽ, ഒരേ പാതയിലെ വ്യത്യസ്ത ജീനുകൾ വ്യത്യസ്ത താൽക്കാലിക പ്രതികരണ പ്രൊഫൈലുകൾ പ്രദർശിപ്പിച്ചേക്കാമെന്ന് മുൻ പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്30,46. കൂടാതെ, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും ജീൻ പ്രവർത്തനവും തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന സങ്കീർണ്ണമായ പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ സംവിധാനങ്ങളുണ്ട്. പ്രോട്ടിയോമിക് പഠനങ്ങൾക്ക് PTM-കളുടെയും പ്രോട്ടീൻ പ്രവർത്തനത്തിന്റെയും സ്വാധീനത്തെക്കുറിച്ച് ഉൾക്കാഴ്ച നൽകാൻ കഴിയും, പക്ഷേ അവ കുറഞ്ഞ-ത്രൂപുട്ട് രീതികൾ, ഉയർന്ന സിഗ്നൽ-ടു-നോയ്‌സ് അനുപാതങ്ങൾ, മോശം റെസല്യൂഷൻ എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള വെല്ലുവിളികളും ഉയർത്തുന്നു.
ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, TEM, MEL എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജി പഠിക്കുന്നത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സും പ്രവർത്തനവും തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തെക്കുറിച്ചും ഇത് രോഗത്തെ എങ്ങനെ സ്വാധീനിക്കുന്നു എന്നതിനെക്കുറിച്ചുമുള്ള അടിസ്ഥാന ചോദ്യങ്ങൾക്ക് ഉത്തരം നൽകാൻ വളരെയധികം സാധ്യതയുണ്ട്. ഏറ്റവും പ്രധാനമായി, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡിസ്‌ഫങ്‌ഷന്റെയും ഡൈനാമിക്‌സിന്റെയും കൺ‌വെർജന്റ് എൻഡ്‌പോയിന്റായി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജി അളക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു നേരിട്ടുള്ള രീതി TEM നൽകുന്നു. ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിൽ മാറ്റങ്ങളുടെ അഭാവത്തിൽ പോലും ഡൈനാമിക് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ റീമോഡലിംഗിന്റെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്ന ഒരു ത്രിമാന സെല്ലുലാർ പരിതസ്ഥിതിയിൽ വിഘടനവും സംയോജനവും ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു നേരിട്ടുള്ള രീതിയും MEL നൽകുന്നു. ദ്വിതീയ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രോഗങ്ങളിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഇമേജിംഗ് ടെക്നിക്കുകളുടെ പ്രയോജനം ഞങ്ങൾ ഇവിടെ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. അക്യൂട്ട് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കുകളുടെ സൂക്ഷ്മമായ പുനർനിർമ്മാണത്താൽ സവിശേഷതയുള്ള ക്രോണിക് മൈൽഡ് മെറ്റബോളിക് സ്ട്രെസ് ആണ് ഈ രോഗങ്ങളുടെ സവിശേഷത. എന്നിരുന്നാലും, വിട്ടുമാറാത്ത സമ്മർദ്ദത്തിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നഷ്ടപരിഹാരം അഗാധമായ പ്രവർത്തനപരമായ പ്രത്യാഘാതങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു. ന്യൂറോ സയൻസിന്റെ പശ്ചാത്തലത്തിൽ, ഈ നഷ്ടപരിഹാര സംവിധാനങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള മികച്ച ധാരണ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡിസ്‌ഫങ്‌ഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്ലിയോട്രോപിക് ന്യൂറോപാഥോളജിയെക്കുറിച്ചുള്ള പ്രധാന വിവരങ്ങൾ നൽകിയേക്കാം.
ആത്യന്തികമായി, ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ, പ്രോട്ടീൻ പരിഷ്കാരങ്ങൾ, ന്യൂറോണൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ പ്രവർത്തനം എന്നിവ തമ്മിലുള്ള സങ്കീർണ്ണമായ ഇടപെടലുകളുടെ പ്രവർത്തനപരമായ അനന്തരഫലങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കുന്നതിനുള്ള ഇമേജിംഗ് ടെക്നിക്കുകളുടെ ഉപയോഗത്തെ ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. ASD യുടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഘടകത്തെക്കുറിച്ച് ഉൾക്കാഴ്ച നേടുന്നതിനായി ഒരു ന്യൂറോണൽ സെൽ മോഡലിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതതയെ മാതൃകയാക്കാൻ ഞങ്ങൾ PPA ഉപയോഗിച്ചു. PPA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച SH-SY5Y കോശങ്ങൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയിൽ മാറ്റങ്ങൾ കാണിച്ചു: മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ ചെറുതും വൃത്താകൃതിയിലുള്ളതുമായി മാറി, TEM നിരീക്ഷിച്ചപ്പോൾ ക്രിസ്റ്റയെ മോശമായി നിർവചിച്ചു. നേരിയ മെറ്റബോളിക് സമ്മർദ്ദത്തിന് പ്രതികരണമായി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശൃംഖല നിലനിർത്തുന്നതിന് വിഘടനത്തിന്റെയും സംയോജനത്തിന്റെയും വർദ്ധനവിനൊപ്പം ഈ മാറ്റങ്ങൾ സംഭവിക്കുന്നുവെന്ന് MEL വിശകലനം കാണിക്കുന്നു. മാത്രമല്ല, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിസത്തിന്റെയും ഹോമിയോസ്റ്റാസിസിന്റെയും ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ നിയന്ത്രണത്തെ PPA ഗണ്യമായി തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു. PPA സമ്മർദ്ദം മൂലം തടസ്സപ്പെടുന്ന പ്രധാന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ റെഗുലേറ്ററുകളായി cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, OPA1 എന്നിവ ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, കൂടാതെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയിലും പ്രവർത്തനത്തിലും PPA- പ്രേരിത മാറ്റങ്ങൾക്ക് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നതിൽ ഒരു പങ്കു വഹിച്ചേക്കാം. ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിലും പ്രോട്ടീൻ പ്രവർത്തനത്തിലും, പ്രാദേശികവൽക്കരണത്തിലും, പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ലേഷണൽ പരിഷ്കാരങ്ങളിലും PPA- പ്രേരിതമായ താൽക്കാലിക മാറ്റങ്ങളെ നന്നായി ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന് ഭാവിയിലെ പഠനങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സ്ട്രെസ് പ്രതികരണത്തിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്ന നിയന്ത്രണ സംവിധാനങ്ങളുടെ സങ്കീർണ്ണതയും പരസ്പരാശ്രിതത്വവും ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ കൂടുതൽ ലക്ഷ്യബോധമുള്ള മെക്കാനിസ്റ്റിക് പഠനങ്ങൾക്ക് TEM-ന്റെയും മറ്റ് ഇമേജിംഗ് ടെക്നിക്കുകളുടെയും പ്രയോജനം പ്രകടമാക്കുന്നു.
SH-SY5Y സെൽ ലൈൻ (ECACC, 94030304-1VL) സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ചിൽ നിന്ന് വാങ്ങി. SH-SY5Y സെല്ലുകൾ ഡൽബെക്കോയുടെ പരിഷ്കരിച്ച ഈഗിൾസ് മീഡിയം/F-12 പോഷക മിശ്രിതം (DMEM/F-12), എൽ-ഗ്ലൂട്ടാമൈൻ (SC09411, ScienCell) എന്നിവയിൽ 25 cm2 ഫ്ലാസ്കുകളിൽ വളർത്തി, 20% ഫെറ്റൽ ബോവിൻ സെറം (FBS) (10493106, തെർമോഫിഷർ സയന്റിഫിക്), 1% പെൻസിലിൻ-സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (P4333-20ML, സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) എന്നിവ 37 °C, 5% CO2 താപനിലയിൽ ചേർത്തു. 0.05% ട്രിപ്‌സിൻ-ഇഡിടിഎ (15400054, തെർമോഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങളെ 80% സംഗമത്തിലേക്ക് ഉപസംസ്‌ക്കരിച്ചു, 300 ഗ്രാം സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്‌ത് ഏകദേശം 7 × 105 സെല്ലുകൾ/മില്ലി സാന്ദ്രതയിൽ പൂശി. എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളും 19–22 പാസേജുകൾക്കിടയിലുള്ള വ്യത്യാസമില്ലാത്ത SH-SY5Y സെല്ലുകളിലാണ് നടത്തിയത്. PPA NaP ആയി നൽകുന്നു. NaP പൊടി (CAS നമ്പർ 137-40-6, കെമിക്കൽ ഫോർമുല C3H5NaO2, P5436-100G, സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ചൂടുള്ള മില്ലിക്യു വെള്ളത്തിൽ 1 M സാന്ദ്രതയിലേക്ക് ലയിപ്പിച്ച് 4 °C യിൽ സൂക്ഷിക്കുക. ചികിത്സയുടെ ദിവസം, ഈ ലായനി 1 M PPA മുതൽ 3 mM വരെയും 5 mM PPA വരെയും സെറം-ഫ്രീ മീഡിയത്തിൽ (DMEM/F-12 with L-glutamine) നേർപ്പിക്കുക. എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കും ചികിത്സാ സാന്ദ്രത PPA ഇല്ല (0 mM, നിയന്ത്രണം), 3 mM, 5 mM PPA എന്നിവയായിരുന്നു. കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് ജൈവ പകർപ്പുകളിലെങ്കിലും പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി.
SH-SY5Y കോശങ്ങളെ 5.5 × 105 കോശങ്ങൾ/മില്ലി എന്ന നിരക്കിൽ 25 സെ.മീ5 ഫ്ലാസ്കുകളായി വിത്ത് പാകി 24 മണിക്കൂർ വളർത്തി. ഇൻകുബേഷന് 24 മണിക്കൂർ മുമ്പ് PPA ചികിത്സ ഫ്ലാസ്കിൽ ചേർത്തു. സാധാരണ സസ്തനി ടിഷ്യു ഉപസംസ്കാര പ്രോട്ടോക്കോളുകൾ പിന്തുടർന്ന് സെൽ പെല്ലറ്റുകൾ ശേഖരിക്കുക (മുകളിൽ വിവരിച്ചത്). 100 µl 2.5% ഗ്ലൂട്ടറാൾഡിഹൈഡ്, 1× PBS എന്നിവയിൽ സെൽ പെല്ലറ്റ് വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്ത് പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നതുവരെ 4 °C-ൽ സൂക്ഷിക്കുക. SH-SY5Y കോശങ്ങളെ ഹ്രസ്വമായി സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്ത് കോശങ്ങളെ പെല്ലറ്റ് ചെയ്ത് 2.5% ഗ്ലൂട്ടറാൾഡിഹൈഡ്, 1× PBS ലായനി എന്നിവ നീക്കം ചെയ്തു. വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ തയ്യാറാക്കിയ 4% അഗറോസ് ജെല്ലിൽ അവശിഷ്ടം വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുക (അഗറോസിന്റെയും അവശിഷ്ടത്തിന്റെയും അനുപാതം 1:1 ആണ്). അഗറോസ് കഷണങ്ങൾ പരന്ന പ്ലേറ്റുകളിൽ ഗ്രിഡുകളിൽ സ്ഥാപിച്ച് ഉയർന്ന മർദ്ദത്തിൽ മരവിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് 1-ഹെക്സാഡെസീൻ കൊണ്ട് പൊതിഞ്ഞു. സാമ്പിളുകൾ -90°C-ൽ 100% ഉണങ്ങിയ അസെറ്റോണിൽ 24 മണിക്കൂർ ഫ്രീസ് ചെയ്തു. പിന്നീട് താപനില -80°C ആയി ഉയർത്തി, 1% ഓസ്മിയം ടെട്രോക്സൈഡും 0.1% ഗ്ലൂട്ടറാൾഡിഹൈഡും ചേർന്ന ഒരു ലായനി ചേർത്തു. സാമ്പിളുകൾ -80°C-യിൽ 24 മണിക്കൂർ സൂക്ഷിച്ചു. ഇതിനുശേഷം, നിരവധി ദിവസങ്ങളിൽ താപനില ക്രമേണ മുറിയിലെ താപനിലയിലേക്ക് വർദ്ധിപ്പിച്ചു: 24 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് – 80°C മുതൽ – 50°C വരെയും, 24 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് – 30°C വരെയും, 24 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് – 10°C വരെയും ഒടുവിൽ മുറിയിലെ താപനിലയിലേക്കും. താപനില.
ക്രയോജനിക് തയ്യാറാക്കലിനുശേഷം, സാമ്പിളുകൾ റെസിൻ ഉപയോഗിച്ച് നിറയ്ക്കുകയും അൾട്രാതിൻ ഭാഗങ്ങൾ (~100 nm) ഒരു ലെയ്‌ക റീച്ചേർട്ട് അൾട്രാകട്ട്‌സ് അൾട്രാമൈക്രോടോം (ലെയ്‌ക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ്) ഉപയോഗിച്ച് നിർമ്മിക്കുകയും ചെയ്തു. 2% യുറാനൈൽ അസറ്റേറ്റും ലെഡ് സിട്രേറ്റും ഉപയോഗിച്ച് ഭാഗങ്ങൾ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്‌തു. 200 kV (ലാബ്6 ട്രാൻസ്മിറ്റർ)-ൽ പ്രവർത്തിക്കുന്ന ഒരു FEI ടെക്‌നൈ 20 ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പും (തെർമോഫിഷർ (മുമ്പ് FEI), ഐൻഡ്‌ഹോവൻ, നെതർലാൻഡ്‌സ്) ട്രൈഡിയം എനർജി ഫിൽട്ടർ ഘടിപ്പിച്ച ഒരു ഗാറ്റൻ സിസിഡി ക്യാമറയും (ഗാറ്റൻ, യുകെ) ഉപയോഗിച്ചാണ് സാമ്പിളുകൾ നിരീക്ഷിച്ചത്.
ഓരോ സാങ്കേതിക പകർപ്പിലും, കുറഞ്ഞത് 24 സിംഗിൾ സെൽ ഇമേജുകളെങ്കിലും ലഭിച്ചു, ആകെ 266 ചിത്രങ്ങൾ. എല്ലാ ചിത്രങ്ങളും റീജിയൻ ഓഫ് ഇന്ററസ്റ്റ് (ROI) മാക്രോയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ മാക്രോയും ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മാക്രോ പ്രസിദ്ധീകരിച്ച രീതികളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്17,31,32 കൂടാതെ ഫിജി/ഇമേജ്ജെ69-ൽ TEM ഇമേജുകളുടെ സെമി-ഓട്ടോമേറ്റഡ് ബാച്ച് പ്രോസസ്സിംഗ് അനുവദിക്കുന്നു. ചുരുക്കത്തിൽ: റോളിംഗ് ബോൾ പശ്ചാത്തല കുറയ്ക്കൽ (60 പിക്സൽ ആരം), ഒരു FFT ബാൻഡ്‌പാസ് ഫിൽട്ടർ (യഥാക്രമം 60 ഉം 8 ഉം പിക്സൽ അപ്പർ, ലോവർ ബൗണ്ടുകൾ ഉപയോഗിച്ച്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രം വിപരീതമാക്കുകയും വിപരീതമാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ 5% ഓറിയന്റേഷൻ ടോളറൻസുള്ള ലംബ രേഖ സപ്രഷൻ ഉപയോഗിച്ചും. പ്രോസസ്സ് ചെയ്ത ചിത്രം പരമാവധി എൻട്രോപ്പി അൽഗോരിതം ഉപയോഗിച്ച് യാന്ത്രികമായി ത്രെഷോൾഡ് ചെയ്യുകയും ഒരു ബൈനറി മാസ്ക് സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. അസംസ്കൃത TEM ഇമേജുകളിൽ സ്വമേധയാ തിരഞ്ഞെടുത്ത ROI-കളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഇമേജ് മേഖലകൾ വേർതിരിച്ചെടുത്തു, ഇത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയെ ചിത്രീകരിക്കുകയും പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിനെയും മറ്റ് ഉയർന്ന-കോൺട്രാസ്റ്റ് മേഖലകളെയും ഒഴിവാക്കുകയും ചെയ്തു. വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഓരോ ROI യ്ക്കും, 600 പിക്സലുകളിൽ കൂടുതലുള്ള ബൈനറി കണികകൾ വിശകലനം ചെയ്തു, ഫിജി/ഇമേജ്ജെയുടെ ബിൽറ്റ്-ഇൻ മെഷർമെന്റ് ഫംഗ്ഷനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് കണികാ വിസ്തീർണ്ണം, ചുറ്റളവ്, മേജർ, മൈനർ അക്ഷങ്ങൾ, ഫെററ്റ് വ്യാസം, വൃത്താകൃതി, വൃത്താകൃതി എന്നിവ അളന്നു. മെറിൽ, ഫ്ലിപ്പോ, സ്ട്രാക്ക് (2017) എന്നിവയെ തുടർന്ന്, ഏരിയ 2, കണികാ വീക്ഷണാനുപാതം (മേജർ മുതൽ മൈനർ അക്ഷ അനുപാതം), ആകൃതി ഘടകം (FF) എന്നിവ ഈ ഡാറ്റയിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കി, ഇവിടെ FF = ചുറ്റളവ് 2/4pi x ഏരിയ. പാരാമെട്രിക് ഫോർമുലയുടെ നിർവചനം മെറിൽ, ഫ്ലിപ്പോ, സ്ട്രാക്ക് (2017) എന്നിവയിൽ കാണാം. പരാമർശിച്ച മാക്രോകൾ GitHub-ൽ ലഭ്യമാണ് (ഡാറ്റ ലഭ്യത പ്രസ്താവന കാണുക). ശരാശരി, ഒരു PPA ചികിത്സയിൽ ഏകദേശം 5,600 കണികകൾ വിശകലനം ചെയ്തു, ആകെ ഏകദേശം 17,000 കണികകൾ (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല).
SH-SH5Y സെല്ലുകൾ 8-ചേമ്പർ കൾച്ചർ ഡിഷുകളിൽ (ThermoFisher, #155411) സ്ഥാപിച്ച് രാത്രി മുഴുവൻ അഡീഷൻ അനുവദിച്ചു, തുടർന്ന് TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669), Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ഡൈയിംഗ്. 10 മിനിറ്റ് പരിതസ്ഥിതിയിൽ 405 nm, 561 nm ലേസറുകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് ചിത്രങ്ങൾ എടുത്തത്, തുടർന്നുള്ള 12 സമയ പോയിന്റുകളിൽ ഇമേജ് ഫ്രെയിമുകൾക്കിടയിൽ 0.2 μm az സ്റ്റെപ്പുള്ള 10 ഇമേജ് മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ അടങ്ങിയ z-സ്റ്റാക്കുകളായി അസംസ്കൃത ചിത്രങ്ങൾ എടുത്തു. LCI പ്ലാൻ അപ്പോക്രോമേറ്റ് 100x/1.4 ഓയിൽ DIC M27 ലെൻസ് ഉപയോഗിച്ച് കാൾ സീസ് LSM780 ELYRA PS.1 സൂപ്പർ-റെസല്യൂഷൻ പ്ലാറ്റ്‌ഫോം (കാൾ സീസ്, ഒബർകോച്ചൻ, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രങ്ങൾ ശേഖരിച്ചു. ഫ്യൂഷൻ, ഫിഷൻ ഇവന്റുകൾ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഘടനകളുടെ ശരാശരി എണ്ണം, ഓരോ സെല്ലിനും ശരാശരി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വോളിയം എന്നിവ അളക്കുന്നതിന് മുമ്പ് വിവരിച്ച പൈപ്പ്‌ലൈനും ഇമേജ്ജെ പ്ലഗിനും ഉപയോഗിച്ച് ഇമേജ്ജെയിൽ ചിത്രങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു33. MEL മാക്രോകൾ GitHub-ൽ ലഭ്യമാണ് (ഡാറ്റ ലഭ്യത പ്രസ്താവന കാണുക).
ചികിത്സയ്ക്ക് മുമ്പ് 24 മണിക്കൂർ 0.3 × 106 കോശങ്ങൾ/mL സാന്ദ്രതയിൽ ആറ് കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ SH-SY5Y കോശങ്ങൾ വളർത്തി. ക്വിക്ക്-ആർഎൻഎ™ മിനിപ്രെപ്പ് പ്രോട്ടോക്കോൾ (ZR R1055, സൈമോ റിസർച്ച്) ഉപയോഗിച്ച് ചെറിയ പരിഷ്കാരങ്ങളോടെ ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുത്തു: നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനുമുമ്പ് ഓരോ കിണറിലും 300 μl ആർഎൻഎ ലൈസിസ് ബഫർ ചേർക്കുക, 30 μl ഡിഎൻഎഎസ്/ആർഎൻഎഎസ് എല്യൂഷൻ ഉപയോഗിച്ച് അവസാന ഘട്ടമായി ഓരോ സാമ്പിളും ലൈസ് ചെയ്യുക. -സൗജന്യ വെള്ളം. ഒരു നാനോഡ്രോപ്പ് എൻഡി-1000 യുവി-വിസ് സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് എല്ലാ സാമ്പിളുകളുടെയും അളവും ഗുണനിലവാരവും പരിശോധിച്ചു. 200 μl ആർഐപിഎ ലൈസിസ് ബഫർ ഉപയോഗിച്ചാണ് സെൽ ലൈസേറ്റുകളിൽ നിന്നുള്ള മൊത്തം പ്രോട്ടീൻ ലഭിച്ചത്, ബ്രാഡ്ഫോർഡ് പ്രോട്ടീൻ അസ്സെ70 ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കി.
നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി, ചില പരിഷ്കാരങ്ങളോടെ, ടെട്രോ™ സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് കിറ്റ് (BIO-65043, മെറിഡിയൻ ബയോസയൻസ്) ഉപയോഗിച്ചാണ് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് നടത്തിയത്. മൊത്തം ആർഎൻഎയുടെ 0.7 മുതൽ 1 μg വരെ ഉപയോഗിച്ചുകൊണ്ട് 20-μl പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളിൽ സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് ചെയ്തു. മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച പേപ്പറുകൾ 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (പട്ടിക S1) ൽ നിന്ന് പ്രൈമറുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു, കൂടാതെ അനുബന്ധ പ്രോബുകൾ ഇന്റഗ്രേറ്റഡ് ഡിഎൻഎ ടെക്നോളജീസിൽ നിന്നുള്ള പ്രൈമർക്വസ്റ്റ് ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ച് രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തു. താൽപ്പര്യമുള്ള എല്ലാ ജീനുകളും ന്യൂക്ലിയർ B2M ജീനിലേക്ക് നോർമലൈസ് ചെയ്‌തു. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC, OPA1 എന്നിവയുടെ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ RT-qPCR ഉപയോഗിച്ച് അളന്നു. മാസ്റ്റർ മിക്സിൽ LUNA Taq പോളിമറേസ് (M3003L, ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്സ്), 10 μM ഫോർവേഡ്, റിവേഴ്സ് പ്രൈമറുകൾ, cDNA, PCR-ഗ്രേഡ് വാട്ടർ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇത് ഓരോ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിനും 10 μL എന്ന അന്തിമ വോളിയം നൽകുന്നു. TaqMan മൾട്ടിപ്ലക്സ് അസ്സേകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡിവിഷൻ, ഫിഷൻ ജീനുകളുടെ (DRP1, MFN1/2) എക്സ്പ്രഷൻ അളന്നത്. നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി ചെറിയ പരിഷ്കാരങ്ങളോടെ ലൂണ യൂണിവേഴ്സൽ പ്രോബ് qPCR മാസ്റ്റർ മിക്സ് (M3004S, ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്സ്) ഉപയോഗിച്ചു. മൾട്ടിപ്ലക്സ് RT-qPCR മാസ്റ്റർ മിക്സിൽ 1X LUNA Taq പോളിമറേസ്, 10 μM ഫോർവേഡ്, റിവേഴ്സ് പ്രൈമറുകൾ, 10 μM പ്രോബ്, cDNA, PCR-ഗ്രേഡ് വാട്ടർ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു, അതിന്റെ ഫലമായി ഓരോ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിനും 20 μL എന്ന അന്തിമ വോളിയം ലഭിച്ചു. റോട്ടർ-ജീൻ Q 6-plex (QIAGEN RG—സീരിയൽ നമ്പർ: R0618110) ഉപയോഗിച്ചാണ് RT-qPCR നടത്തിയത്. സൈക്ലിംഗ് അവസ്ഥകൾ പട്ടിക S1 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. എല്ലാ സിഡിഎൻഎ സാമ്പിളുകളും ട്രിപ്പിളിക്കേറ്റായി ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്യുകയും പത്ത് മടങ്ങ് നേർപ്പിക്കലുകളുടെ ഒരു പരമ്പര ഉപയോഗിച്ച് ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്തു. ഡാറ്റ പുനരുൽപാദനക്ഷമത ഉറപ്പാക്കാൻ സൈക്കിൾ ത്രെഷോൾഡ് സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ (സിടി) >0.5 ഉള്ള ട്രിപ്പിളിക്കേറ്റ് സാമ്പിളുകളിലെ ഔട്ട്‌ലിയറുകൾ വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്തു30,72. 2-ΔΔCt79 രീതി ഉപയോഗിച്ച് ആപേക്ഷിക ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ കണക്കാക്കി.
പ്രോട്ടീൻ സാമ്പിളുകൾ (60 μg) 2:1 അനുപാതത്തിൽ ലാംലി ലോഡിംഗ് ബഫറുമായി കലർത്തി 12% നിറമില്ലാത്ത പ്രോട്ടീൻ ജെല്ലിൽ (ബയോ-റാഡ് #1610184) പ്രവർത്തിപ്പിച്ചു. ട്രാൻസ്-ബ്ലോട്ട് ടർബോ സിസ്റ്റം (#170-4155, ബയോ-റാഡ്) ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീനുകൾ ഒരു PVDF (പോളി വിനൈലിഡീൻ ഫ്ലൂറൈഡ്) മെംബ്രണിലേക്ക് (#170-84156, ബയോ-റാഡ്) മാറ്റി. മെംബ്രൺ തടയുകയും ഉചിതമായ പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ (OPA1, MFN1, MFN2, DRP1) (1:1000 നേർപ്പിച്ചത്) ഉപയോഗിച്ച് 48 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും തുടർന്ന് സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡികൾ (1:10,000) ഉപയോഗിച്ച് 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. തുടർന്ന് ക്ലാരിറ്റി വെസ്റ്റേൺ ഇസിഎൽ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് (#170-5061, ബയോ-റാഡ്) ഉപയോഗിച്ച് മെംബ്രണുകൾ ചിത്രീകരിച്ച് ഒരു ബയോ-റാഡ് കെമിഡോക് എംപി സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് റെക്കോർഡുചെയ്‌തു. വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് വിശകലനത്തിനായി ഇമേജ് ലാബ് പതിപ്പ് 6.1 ഉപയോഗിച്ചു. യഥാർത്ഥ ജെല്ലും ബ്ലോട്ടും ചിത്രം S1-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ആന്റിബോഡി വിവരങ്ങൾ പട്ടിക S2-ൽ നൽകിയിരിക്കുന്നു.
കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര സാമ്പിളുകളുടെ ശരാശരിയുടെയും (SEM) സ്റ്റാൻഡേർഡ് പിശകിന്റെയും രൂപത്തിലാണ് ഡാറ്റാ സെറ്റുകൾ അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നത്. ഷാപ്പിറോ-വിൽക്സ് ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റാ സെറ്റുകൾ സാധാരണ നിലയ്ക്കായി പരിശോധിച്ചു (മറ്റുവിധത്തിൽ പറഞ്ഞിട്ടില്ലെങ്കിൽ), ഒരു ഗാസിയൻ വിതരണവും തുല്യ സ്റ്റാൻഡേർഡ് വ്യതിയാനങ്ങളും അനുമാനിച്ച് വിശകലനങ്ങളുമായി മുന്നോട്ട് പോയി. ഫിഷറിന്റെ MEL LSD (p < 0.05), വൺ-വേ ANOVA (ചികിത്സ vs. നിയന്ത്രണ ശരാശരി), പ്രാധാന്യം നിർണ്ണയിക്കാൻ ഡണറ്റിന്റെ മൾട്ടിപ്പിൾ താരതമ്യ പരിശോധന (p < 0.05) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റാ സെറ്റ് വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനു പുറമേ. ഗ്രാഫിൽ *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 എന്നിങ്ങനെ പ്രധാനപ്പെട്ട p മൂല്യങ്ങൾ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. എല്ലാ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനങ്ങളും ഗ്രാഫുകളും ഗ്രാഫ്പാഡ് പ്രിസം 9.4.0 ഉപയോഗിച്ച് നടത്തുകയും സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്തു.
TEM ഇമേജ് വിശകലനത്തിനായുള്ള ഫിജി/ഇമേജ്ജെ മാക്രോകൾ GitHub-ൽ പൊതുവായി ലഭ്യമാണ്: https://github.com/caaja/TEMPitoMacro. മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ഇവന്റ് ലൊക്കേറ്റർ (MEL) മാക്രോ GitHub-ൽ പൊതുവായി ലഭ്യമാണ്: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
മെലിയാന എ., ദേവി എൻഎം, വിജയ എ. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ: മെറ്റബോളിസം, ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ്, സമ്മർദ്ദം, വാർദ്ധക്യം, എപ്പിജെനെറ്റിക്സ് എന്നിവയുടെ മാസ്റ്റർ റെഗുലേറ്റർമാർ. ഇന്തോനേഷ്യൻ. ബയോമെഡിക്കൽ സയൻസ്. ജെ. 13, 221–241 (2021).
ബെൻ-ഷാച്ചർ, ഡി. സ്കീസോഫ്രീനിയയിലെ മൾട്ടിഫേസറ്റഡ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡിസ്ഫങ്ക്ഷൻ, കോംപ്ലക്സ് I ഒരു സാധ്യമായ രോഗാവസ്ഥാ ലക്ഷ്യമായി. സ്കീസോഫ്രീനിയ. റിസോഴ്‌സ്. 187, 3–10 (2017).
ബോസ്, എ., ബീൽ, എംഎഫ്. പാർക്കിൻസൺസ് രോഗത്തിലെ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ഡിസ്ഫങ്ഷൻ. ജെ. ന്യൂറോകെമിസ്ട്രി. 139, 216–231 (2016).
ശർമ്മ വി.കെ., സിംഗ് ടി.ജി., മേത്ത വി. സ്ട്രെസ്ഡ് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ: അൽഷിമേഴ്‌സ് രോഗത്തിലെ അധിനിവേശ ലക്ഷ്യങ്ങൾ. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ 59, 48–57 (2021).
ബെലെൻഗർ പി., ഡുവാർട്ടെ ജെഎംഎൻ, ഷൂക്ക് പിഎഫ്, ഫെറേറ ജികെ. മൈറ്റോകോൺഡ്രിയയും തലച്ചോറും: ബയോഎനർജറ്റിക്സും മറ്റും. ന്യൂറോടോക്സിനുകൾ. റിസോഴ്സ്. 36, 219–238 (2019).
രംഗരാജു, വി. തുടങ്ങിയവർ. പ്ലിയോട്രോപിക് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ: ന്യൂറോണൽ വികസനത്തിലും രോഗത്തിലും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ സ്വാധീനം. ജെ. ന്യൂറോസയൻസ്. 39, 8200–8208 (2019).
കാർഡാനോ-റാമോസ്, സി., മൊറൈസ്, വിഎ. ന്യൂറോണുകളിലെ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ബയോജെനിസിസ്: എങ്ങനെ, എവിടെ. അന്താരാഷ്ട്രത. ജെ. മോഹർ. ശാസ്ത്രം. 22, 13059 (2021).
യു, ആർ., ലെൻഡാൽ, യു., നിസ്റ്റർ, എം., ഷാവോ, ജെ. റെഗുലേഷൻ ഓഫ് മാമലിയൻ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ്: അവസരങ്ങളും വെല്ലുവിളികളും. ഫ്രണ്ട്. എൻ‌ഡോക്രൈൻ. (ലോസാൻ) 11, 374 (2020).
ഖാച്ചോ, എം., സ്ലാക്ക്, ആർ.എസ്. മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ് ഇൻ ദി റെഗുലേഷൻ ഓഫ് ന്യൂറോജെനിസിസ്: ഫ്രം ദി ഡെവലപ്പിംഗ് ടു അഡൽറ്റ് ബ്രെയിൻ. ഡെവലപ്മെന്റ്. ഡൈനാമിക്. 247, 47–53 (2018).