"രോഗകാരികൾക്കും കീടങ്ങൾക്കും എതിരായ പയർവർഗ്ഗങ്ങളുടെ പ്രതിരോധം മെച്ചപ്പെടുത്തൽ" എന്ന ഗവേഷണ വിഷയത്തിന്റെ ഭാഗമാണ് ഈ ലേഖനം, എല്ലാ 5 ലേഖനങ്ങളും കാണുക.
ഫംഗസ് സസ്യരോഗമായ നെക്രോസിസിന് കാരണമാകുന്ന സ്ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം (ലിബ്.) ഡി ബാരി വ്യത്യസ്ത ആതിഥേയ സസ്യങ്ങളെ ബാധിക്കാൻ ഒരു മൾട്ടി-ടയർ തന്ത്രം ഉപയോഗിക്കുന്നു. സ്യൂഡോമോണസ് സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം മൂലമുണ്ടാകുന്ന വെളുത്ത പൂപ്പലിനോട് ഫാസിയോലസ് വൾഗാരിസ് എൽ. ന്റെ തന്മാത്രാ, ശാരീരിക, ജൈവ രാസ പ്രതികരണങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു ബദൽ മാനേജ്മെന്റ് തന്ത്രമായി, മറ്റ് അവശ്യ അമിനോ ആസിഡുകളുടെ സമന്വയത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ ഇതര അമിനോ ആസിഡായ ഡയമിൻ എൽ-ഓർണിതിൻ ഉപയോഗിക്കാൻ ഈ പഠനം നിർദ്ദേശിക്കുന്നു. ഡോസ്-ആശ്രിത രീതിയിൽ എസ്. പൈറനോയ്ഡോസയുടെ മൈസീലിയൽ വളർച്ചയെ എൽ-ഓർണിതിൻ ഗണ്യമായി തടഞ്ഞതായി ഇൻ വിട്രോ പരീക്ഷണങ്ങൾ തെളിയിച്ചു. മാത്രമല്ല, ഹരിതഗൃഹ സാഹചര്യങ്ങളിൽ വെളുത്ത പൂപ്പലിന്റെ തീവ്രത ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കാൻ ഇതിന് കഴിയും. കൂടാതെ, എൽ-ഓർണിതിൻ ചികിത്സിച്ച സസ്യങ്ങളുടെ വളർച്ചയെ ഉത്തേജിപ്പിച്ചു, ഇത് എൽ-ഓർണിതൈനിന്റെ പരിശോധിച്ച സാന്ദ്രത ചികിത്സിച്ച സസ്യങ്ങൾക്ക് ഫൈറ്റോടോക്സിക് അല്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. കൂടാതെ, എൽ-ഓർണിതിൻ എൻസൈമാറ്റിക് അല്ലാത്ത ആന്റിഓക്‌സിഡന്റുകളുടെ (മൊത്തത്തിൽ ലയിക്കുന്ന ഫിനോളിക്‌സും ഫ്ലേവനോയിഡുകളും) പ്രകടനവും എൻസൈമാറ്റിക് ആന്റിഓക്‌സിഡന്റുകളുടെ (കാറ്റലേസ് (CAT), പെറോക്‌സിഡേസ് (POX), പോളിഫെനോൾ ഓക്‌സിഡേസ് (PPO)) പ്രകടനവും വർദ്ധിപ്പിച്ചു, കൂടാതെ മൂന്ന് ആന്റിഓക്‌സിഡന്റുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളുടെ (PvCAT1, PvSOD, PvGR) പ്രകടനവും വർദ്ധിപ്പിച്ചു. കൂടാതെ, സിലിക്കോ വിശകലനത്തിൽ, എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ജീനോമിൽ ഒരു പുട്ടേറ്റീവ് ഓക്‌സലോഅസെറ്റേറ്റ് അസറ്റൈൽഹൈഡ്രോലേസ് (SsOAH) പ്രോട്ടീനിന്റെ സാന്നിധ്യം വെളിപ്പെടുത്തി, ഇത് ഫങ്ഷണൽ വിശകലനം, സംരക്ഷിത ഡൊമെയ്‌നുകൾ, ടോപ്പോളജി എന്നിവയുടെ കാര്യത്തിൽ ആസ്പർജില്ലസ് ഫിജിയെൻസിസ് (AfOAH), പെൻസിലിയം എസ്‌പി. (PlOAH) എന്നിവയുടെ ഓക്‌സലോഅസെറ്റേറ്റ് അസറ്റൈൽഹൈഡ്രോലേസ് (SsOAH) പ്രോട്ടീനുകളുമായി വളരെ സാമ്യമുള്ളതാണ്. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഉരുളക്കിഴങ്ങ് ഡെക്‌സ്ട്രോസ് ചാറു (PDB) മീഡിയത്തിൽ എൽ-ഓർണിതിൻ ചേർക്കുന്നത് എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം മൈസീലിയയിലെ SsOAH ജീനിന്റെ പ്രകടനത്തെ ഗണ്യമായി കുറച്ചു. അതുപോലെ, എൽ-ഓർണിത്തിൻ പുറത്തു പ്രയോഗിക്കുന്നത് ചികിത്സിച്ച സസ്യങ്ങളിൽ നിന്ന് ശേഖരിക്കുന്ന ഫംഗസ് മൈസീലിയയിൽ SsOAH ജീനിന്റെ പ്രകടനത്തെ ഗണ്യമായി കുറച്ചു. ഒടുവിൽ, എൽ-ഓർണിത്തിൻ പ്രയോഗം പിഡിബി മീഡിയത്തിലും ബാധിച്ച ഇലകളിലും ഓക്സാലിക് ആസിഡ് സ്രവണം ഗണ്യമായി കുറച്ചു. ഉപസംഹാരമായി, റെഡോക്സ് നില നിലനിർത്തുന്നതിലും രോഗബാധിതമായ സസ്യങ്ങളുടെ പ്രതിരോധ പ്രതികരണം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിലും എൽ-ഓർണിത്തിൻ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. വെളുത്ത പൂപ്പൽ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനും ബീൻസ് ഉൽപാദനത്തിലും മറ്റ് വിളകളിലും അതിന്റെ ആഘാതം ലഘൂകരിക്കുന്നതിനും നൂതനവും പരിസ്ഥിതി സൗഹൃദവുമായ രീതികൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് ഈ പഠനത്തിന്റെ ഫലങ്ങൾ സഹായിച്ചേക്കാം.
സ്ക്ലിറോട്ടിനിയ സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം (ലിബ്.) ഡി ബാരി എന്ന നെക്രോട്രോഫിക് ഫംഗസ് മൂലമുണ്ടാകുന്ന വെളുത്ത പൂപ്പൽ, വിളവ് കുറയ്ക്കുന്ന ഒരു വിനാശകരമായ രോഗമാണ്, ഇത് ആഗോള ബീൻസ് (ഫാസിയോലസ് വൾഗാരിസ് എൽ.) ഉൽപാദനത്തിന് ഗുരുതരമായ ഭീഷണി ഉയർത്തുന്നു (ബോൾട്ടൺ തുടങ്ങിയവർ, 2006). മണ്ണിലൂടെ പകരുന്ന ഫംഗസ് സസ്യ രോഗകാരികളിൽ ഒന്നാണ് സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം, നിയന്ത്രിക്കാൻ ഏറ്റവും പ്രയാസമുള്ളത് 600-ലധികം സസ്യ ഇനങ്ങളുടെ വിശാലമായ ആതിഥേയ ശ്രേണിയും ആതിഥേയ കലകളെ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത രീതിയിൽ വേഗത്തിൽ നശിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവുമാണ് (ലിയാങ്, റോളിൻസ്, 2018). പ്രതികൂല സാഹചര്യങ്ങളിൽ, ഇത് അതിന്റെ ജീവിതചക്രത്തിന്റെ ഒരു നിർണായക ഘട്ടത്തിലൂടെ കടന്നുപോകുന്നു, മണ്ണിൽ 'സ്ക്ലെറോട്ടിയ' എന്നറിയപ്പെടുന്ന കറുത്ത, കടുപ്പമുള്ള, വിത്ത് പോലുള്ള ഘടനകളായോ അല്ലെങ്കിൽ ബാധിച്ച സസ്യങ്ങളുടെ മൈസീലിയത്തിലോ തണ്ടിന്റെ കാമ്പിലോ വെളുത്ത, മൃദുവായ വളർച്ചകളായോ വളരെക്കാലം നിഷ്ക്രിയമായി തുടരുന്നു (ഷ്വാർട്സ് തുടങ്ങിയവർ, 2005). എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറത്തിന് സ്ക്ലിറോട്ടിയ രൂപപ്പെടുത്താൻ കഴിയും, ഇത് രോഗബാധിതമായ കൃഷിയിടങ്ങളിൽ വളരെക്കാലം നിലനിൽക്കാനും രോഗസമയത്ത് നിലനിൽക്കാനും അനുവദിക്കുന്നു (ഷ്വാർട്സ് തുടങ്ങിയവർ, 2005). സ്ക്ലിറോട്ടിയ പോഷകങ്ങളാൽ സമ്പുഷ്ടമാണ്, മണ്ണിൽ വളരെക്കാലം നിലനിൽക്കാൻ കഴിയും, തുടർന്നുള്ള അണുബാധകൾക്കുള്ള പ്രാഥമിക ഇനോക്കുലമായി വർത്തിക്കുന്നു (ഷ്വാർട്സ് തുടങ്ങിയവർ, 2005). അനുകൂല സാഹചര്യങ്ങളിൽ, സ്ക്ലിറോട്ടിയ മുളച്ച് വായുവിലൂടെ പകരുന്ന ബീജങ്ങൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് പൂക്കൾ, തണ്ടുകൾ അല്ലെങ്കിൽ കായ്കൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെ എന്നാൽ അവയിൽ മാത്രം ഒതുങ്ങാതെ ചെടിയുടെ എല്ലാ മുകൾത്തട്ടിലെയും ഭാഗങ്ങളെ ബാധിക്കും (ഷ്വാർട്സ് തുടങ്ങിയവർ, 2005).
സ്ക്ലിറോട്ടിനിയ സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം അതിന്റെ ആതിഥേയ സസ്യങ്ങളെ ബാധിക്കുന്നതിനായി ഒരു മൾട്ടി-ടയർ തന്ത്രം ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഇതിൽ സ്ക്ലിറോട്ടിയൽ മുളയ്ക്കൽ മുതൽ രോഗലക്ഷണ വികസനം വരെയുള്ള ഏകോപിത സംഭവങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പര ഉൾപ്പെടുന്നു. തുടക്കത്തിൽ, എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം അപ്പോത്തീസിയ എന്നറിയപ്പെടുന്ന കൂൺ പോലുള്ള ഘടനകളിൽ നിന്ന് സസ്പെൻഡഡ് ബീജങ്ങളെ (അസ്കോസ്പോറുകൾ എന്ന് വിളിക്കുന്നു) ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് വായുവിലൂടെ കടന്നുപോകുകയും രോഗബാധിതമായ സസ്യ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ നോൺ-മോട്ടൈൽ സ്ക്ലെറോട്ടിയയായി വികസിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു (ബോൾട്ടൺ എറ്റ് ആൽ., 2006). തുടർന്ന് ഫംഗസ് സസ്യ കോശഭിത്തിയുടെ pH നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനും എൻസൈമാറ്റിക് ഡീഗ്രഡേഷനും ടിഷ്യു അധിനിവേശവും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിനും ഹോസ്റ്റ് സസ്യത്തിന്റെ ഓക്സിഡേറ്റീവ് പൊട്ടിത്തെറിയെ അടിച്ചമർത്തുന്നതിനും ഒരു വൈറൽസ് ഘടകമായ ഓക്സാലിക് ആസിഡ് സ്രവിക്കുന്നു (ഹെഗെഡസ് ആൻഡ് റിമ്മർ, 2005), ഈ അസിഡിഫിക്കേഷൻ പ്രക്രിയ സസ്യ കോശഭിത്തിയെ ദുർബലപ്പെടുത്തുന്നു, ഫംഗസ് സെൽഭിത്തി ഡീഗ്രേഡിംഗ് എൻസൈമുകളുടെ (CWDEs) സാധാരണവും കാര്യക്ഷമവുമായ പ്രവർത്തനത്തിന് അനുകൂലമായ അന്തരീക്ഷം നൽകുന്നു, ഇത് രോഗകാരിയെ ഭൗതിക തടസ്സത്തെ മറികടന്ന് ഹോസ്റ്റ് കലകളിലേക്ക് തുളച്ചുകയറാൻ അനുവദിക്കുന്നു (മാർസിയാനോ എറ്റ് ആൽ., 1983). ഒരിക്കൽ തുളച്ചുകയറിയാൽ, എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം പോളിഗാലക്ചുറോണേസ്, സെല്ലുലേസ് തുടങ്ങിയ നിരവധി സിഡബ്ല്യുഡിഇകളെ സ്രവിക്കുന്നു, ഇത് രോഗബാധിതമായ കലകളിൽ അതിന്റെ വ്യാപനത്തിന് സഹായിക്കുകയും ടിഷ്യു നെക്രോസിസിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്നു. നിഖേദങ്ങളുടെയും ഹൈഫൽ മാറ്റുകളുടെയും പുരോഗതി വെളുത്ത പൂപ്പലിന്റെ സ്വഭാവ ലക്ഷണങ്ങളിലേക്ക് നയിക്കുന്നു (ഹെഗെഡസ് ആൻഡ് റിമ്മർ, 2005). അതേസമയം, ആതിഥേയ സസ്യങ്ങൾ പാറ്റേൺ റെക്കഗ്നിഷൻ റിസപ്റ്ററുകൾ (PRRs) വഴി രോഗകാരി-അനുബന്ധ തന്മാത്രാ പാറ്റേണുകൾ (PAMPs) തിരിച്ചറിയുന്നു, ഇത് ആത്യന്തികമായി പ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങളെ സജീവമാക്കുന്ന നിരവധി സിഗ്നലിംഗ് സംഭവങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുന്നു.
പതിറ്റാണ്ടുകളായി രോഗ നിയന്ത്രണ ശ്രമങ്ങൾ നടത്തിയിട്ടും, മറ്റ് വാണിജ്യ വിളകളിലെന്നപോലെ, ബീനിലും മതിയായ പ്രതിരോധശേഷിയുള്ള ജേംപ്ലാസത്തിന്റെ കുറവ് നിലനിൽക്കുന്നു, കാരണം രോഗകാരിയുടെ പ്രതിരോധം, അതിജീവനം, പൊരുത്തപ്പെടുത്തൽ എന്നിവ ഇതിന് കാരണമാകുന്നു. അതിനാൽ രോഗ നിയന്ത്രണം വളരെ വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞതാണ്, കൂടാതെ സാംസ്കാരിക രീതികൾ, ജൈവ നിയന്ത്രണം, രാസ കുമിൾനാശിനികൾ എന്നിവയുടെ സംയോജനം ഉൾപ്പെടുന്ന സംയോജിതവും ബഹുമുഖവുമായ ഒരു തന്ത്രം ആവശ്യമാണ് (O'Sullivan et al., 2021). വെളുത്ത പൂപ്പലിന്റെ രാസ നിയന്ത്രണം ഏറ്റവും ഫലപ്രദമാണ്, കാരണം കുമിൾനാശിനികൾ, കൃത്യമായും ശരിയായ സമയത്തും പ്രയോഗിക്കുമ്പോൾ, രോഗത്തിന്റെ വ്യാപനം ഫലപ്രദമായി നിയന്ത്രിക്കാനും, അണുബാധയുടെ തീവ്രത കുറയ്ക്കാനും, വിളവ് നഷ്ടം കുറയ്ക്കാനും കഴിയും. എന്നിരുന്നാലും, കുമിൾനാശിനികളുടെ അമിത ഉപയോഗവും അമിത ആശ്രയത്വവും S. സ്ക്ലെറോട്ടിയോറത്തിന്റെ പ്രതിരോധശേഷിയുള്ള ഇനങ്ങൾ ഉയർന്നുവരുന്നതിന് കാരണമാവുകയും ലക്ഷ്യമില്ലാത്ത ജീവികളെ, മണ്ണിന്റെ ആരോഗ്യത്തെ, ജലത്തിന്റെ ഗുണനിലവാരത്തെ പ്രതികൂലമായി ബാധിക്കുകയും ചെയ്യും (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). അതിനാൽ, പരിസ്ഥിതി സൗഹൃദ ബദലുകൾ കണ്ടെത്തുന്നത് ഒരു മുൻ‌ഗണനയായി മാറിയിരിക്കുന്നു.
മണ്ണിലൂടെ പകരുന്ന സസ്യ രോഗകാരികൾക്കെതിരെ പോളിഅമൈനുകൾ (പിഎകൾ) (Putrescine, spermidine, spermine, cadaverine) വാഗ്ദാനമായ ബദലുകളായി വർത്തിക്കാൻ കഴിയും, അതുവഴി അപകടകരമായ രാസ കുമിൾനാശിനികളുടെ ഉപയോഗം പൂർണ്ണമായും ഭാഗികമായോ കുറയ്ക്കുന്നു (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). ഉയർന്ന സസ്യങ്ങളിൽ, കോശവിഭജനം, വ്യത്യാസം, അജിയോട്ടിക്, ബയോട്ടിക് സമ്മർദ്ദങ്ങളോടുള്ള പ്രതികരണം എന്നിവയുൾപ്പെടെ, എന്നാൽ അതിൽ മാത്രം ഒതുങ്ങാതെ, നിരവധി ശാരീരിക പ്രക്രിയകളിൽ പിഎകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു (Killiny and Nehela, 2020). അവയ്ക്ക് ആന്റിഓക്‌സിഡന്റുകളായി പ്രവർത്തിക്കാനും, റിയാക്ടീവ് ഓക്‌സിജൻ സ്പീഷീസുകളെ (ROS) തുരത്താനും, റെഡോക്‌സ് ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ് നിലനിർത്താനും (Nehela and Killini, 2023), പ്രതിരോധവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളെ പ്രേരിപ്പിക്കാനും (Romero et al., 2018), വിവിധ ഉപാപചയ പാതകളെ നിയന്ത്രിക്കാനും (Nehela and Killini, 2023), എൻഡോജെനസ് ഫൈറ്റോഹോർമോണുകളെ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാനും (Nehela and Killini, 2019), സിസ്റ്റമിക് അക്വയർഡ് റെസിസ്റ്റൻസ് (SAR) സ്ഥാപിക്കാനും, സസ്യ-രോഗകാരി ഇടപെടലുകളെ നിയന്ത്രിക്കാനും കഴിയും (Nehela and Killini, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). സസ്യ പ്രതിരോധത്തിൽ PA-കളുടെ പ്രത്യേക സംവിധാനങ്ങളും പങ്കും സസ്യ ഇനങ്ങൾ, രോഗകാരികൾ, പാരിസ്ഥിതിക സാഹചര്യങ്ങൾ എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ച് വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. സസ്യങ്ങളിൽ ഏറ്റവും സമൃദ്ധമായ PA അവശ്യ പോളിഅമിൻ L-ഓർണിതൈനിൽ നിന്ന് ജൈവസംശ്ലേഷണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു (Killini and Nehela, 2020).
സസ്യവളർച്ചയിലും വികാസത്തിലും എൽ-ഓർണിതിൻ ഒന്നിലധികം പങ്കുവഹിക്കുന്നു. ഉദാഹരണത്തിന്, മുൻ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് നെല്ലിൽ (ഒറൈസ സാറ്റിവ), ഓർണിതിൻ നൈട്രജൻ പുനരുപയോഗം (ലിയു തുടങ്ങിയവർ, 2018), നെല്ലിന്റെ വിളവ്, ഗുണനിലവാരം, സുഗന്ധം (ലു തുടങ്ങിയവർ, 2020), ജല സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണം (യാങ് തുടങ്ങിയവർ, 2000) എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം എന്നാണ്. കൂടാതെ, പഞ്ചസാര ബീറ്റിൽ (ബീറ്റ വൾഗാരിസ്) (ഹുസൈൻ തുടങ്ങിയവർ, 2019) എൽ-ഓർണിതിന്റെ ബാഹ്യ പ്രയോഗം വരൾച്ചയെ സഹിഷ്ണുതയോടെ ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു, ഉള്ളി (അലിയം സെപ) (Çavuşoǧlu, Çavuşoǧlu, 2021), കശുവണ്ടി (അനകാർഡിയം ഓക്സിഡന്റേൽ) (da Rocha തുടങ്ങിയവർ, 2012) എന്നിവയിൽ ഉപ്പ് സമ്മർദ്ദം ലഘൂകരിച്ചു. അജീവീയ സമ്മർദ്ദ പ്രതിരോധത്തിൽ എൽ-ഓർണിതിന്റെ സാധ്യതയുള്ള പങ്ക് സംസ്കരിച്ച സസ്യങ്ങളിലെ പ്രോലൈൻ ശേഖരണത്തിൽ അതിന്റെ പങ്കാളിത്തം മൂലമാകാം. ഉദാഹരണത്തിന്, പ്രോലിൻ മെറ്റബോളിസവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകൾ, ഓർണിതിൻ ഡെൽറ്റ അമിനോട്രാൻസ്ഫെറേസ് (ഡെൽറ്റ-ഒഎടി), പ്രോലൈൻ ഡീഹൈഡ്രജനേസ് (പ്രോഡിഎച്ച്1, പ്രോഡിഎച്ച്2) ജീനുകൾ, നിക്കോട്ടിയാന ബെന്താമിയാന, അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാന എന്നിവയുടെ പ്രതിരോധത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. സ്യൂഡോമോണസ് സിറിഞ്ചേ അല്ലാത്ത സ്ട്രെയിനുകൾക്കെതിരെ (സെന്തിൽ-കുമാർ, മൈസൂർ, 2012). മറുവശത്ത്, രോഗകാരി വളർച്ചയ്ക്ക് ഫംഗൽ ഓർണിതിൻ ഡെകാർബോക്സിലേസ് (ഒഡിസി) ആവശ്യമാണ് (സിങ് തുടങ്ങിയവർ, 2020). ഹോസ്റ്റ്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ജീൻ സൈലൻസിംഗ് (എച്ച്ഐജിഎസ്) വഴി ഫ്യൂസേറിയം ഓക്സിസ്പോറം എഫ്. എസ്പി. ലൈക്കോപെർസിസിയുടെ ഒഡിസി ലക്ഷ്യമിടുന്നത് ഫ്യൂസേറിയം വിൽറ്റിനെതിരെ തക്കാളി സസ്യങ്ങളുടെ പ്രതിരോധം ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു (സിങ് തുടങ്ങിയവർ, 2020). എന്നിരുന്നാലും, ഫൈറ്റോപാഥോജനുകൾ പോലുള്ള ബയോട്ടിക് സമ്മർദ്ദങ്ങൾക്കെതിരെ ബാഹ്യ ഓർണിതിൻ പ്രയോഗത്തിന്റെ സാധ്യതയുള്ള പങ്ക് നന്നായി പഠിച്ചിട്ടില്ല. ഏറ്റവും പ്രധാനമായി, രോഗ പ്രതിരോധശേഷിയിൽ ഓർണിതൈനിന്റെ സ്വാധീനവും അനുബന്ധ ജൈവ രാസ, ശാരീരിക പ്രതിഭാസങ്ങളും വലിയതോതിൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെടാതെ തുടരുന്നു.
പയർവർഗ്ഗങ്ങളിൽ എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം അണുബാധയുടെ സങ്കീർണ്ണത മനസ്സിലാക്കുന്നത് ഫലപ്രദമായ നിയന്ത്രണ തന്ത്രങ്ങൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് പ്രധാനമാണ്. ഈ പഠനത്തിൽ, സ്ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം അണുബാധയ്‌ക്കെതിരായ പയർവർഗ്ഗ സസ്യങ്ങളുടെ പ്രതിരോധ സംവിധാനങ്ങളും പ്രതിരോധവും വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിൽ ഡയമിൻ എൽ-ഓർണിതൈനിന്റെ സാധ്യതയുള്ള പങ്ക് തിരിച്ചറിയാൻ ഞങ്ങൾ ലക്ഷ്യമിട്ടു. രോഗബാധിതമായ സസ്യങ്ങളുടെ പ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനൊപ്പം, റെഡോക്സ് നില നിലനിർത്തുന്നതിലും എൽ-ഓർണിതൈൻ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു. എൽ-ഓർണിതൈനിന്റെ സാധ്യതയുള്ള ഫലങ്ങൾ എൻസൈമാറ്റിക്, നോൺ-എൻസൈമാറ്റിക് ആന്റിഓക്‌സിഡന്റ് പ്രതിരോധ സംവിധാനങ്ങളുടെ നിയന്ത്രണവും ഫംഗസ് രോഗകാരിത്വം/വൈറലൻസ് ഘടകങ്ങളും അനുബന്ധ പ്രോട്ടീനുകളുമായുള്ള ഇടപെടലുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു. എൽ-ഓർണിതൈനിന്റെ ഈ ഇരട്ട പ്രവർത്തനം വെളുത്ത പൂപ്പലിന്റെ ആഘാതം ലഘൂകരിക്കുന്നതിനും ഈ ശക്തമായ ഫംഗസ് രോഗകാരിയോടുള്ള സാധാരണ പയർവർഗ്ഗ വിളകളുടെ പ്രതിരോധം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുമുള്ള ഒരു സുസ്ഥിര തന്ത്രത്തിനുള്ള ഒരു വാഗ്ദാനമായ സ്ഥാനാർത്ഥിയാക്കുന്നു. വെളുത്ത പൂപ്പൽ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനും പയർവർഗ്ഗ ഉൽപാദനത്തിൽ അതിന്റെ സ്വാധീനം ലഘൂകരിക്കുന്നതിനുമുള്ള നൂതനവും പരിസ്ഥിതി സൗഹൃദവുമായ രീതികൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് ഇപ്പോഴത്തെ പഠനത്തിന്റെ ഫലങ്ങൾ സഹായിച്ചേക്കാം.
ഈ പഠനത്തിൽ, വാണിജ്യാടിസ്ഥാനത്തിൽ വളരുന്ന ഒരു സാധാരണ പയർ ഇനമായ ഗിസ 3 (ഫാസിയോലസ് വൾഗാരിസ് എൽ. സിവി. ഗിസ 3) പരീക്ഷണ വസ്തുവായി ഉപയോഗിച്ചു. ഈജിപ്തിലെ ഫീൽഡ് ക്രോപ്സ് റിസർച്ച് ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് (എഫ്‌സി‌ആർ‌ഐ), അഗ്രികൾച്ചറൽ റിസർച്ച് സെന്റർ (എആർ‌സി) എന്നിവയിലെ പയർവർഗ്ഗ ഗവേഷണ വകുപ്പ് ആരോഗ്യകരമായ വിത്തുകൾ ദയയോടെ നൽകി. ഹരിതഗൃഹ സാഹചര്യങ്ങളിൽ (25 ± 2 °C, ആപേക്ഷിക ആർദ്രത 75 ± 1%, 8 മണിക്കൂർ വെളിച്ചം/16 മണിക്കൂർ ഇരുട്ട്) എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ബാധിച്ച മണ്ണ് നിറച്ച പ്ലാസ്റ്റിക് ചട്ടിയിൽ (ആന്തരിക വ്യാസം 35 സെ.മീ, ആഴം 50 സെ.മീ) അഞ്ച് വിത്തുകൾ വിതച്ചു. വിതച്ചതിന് 7-10 ദിവസങ്ങളിൽ (ഡിപിഎസ്), തൈകൾ നേർത്തതാക്കി, ഏകീകൃത വളർച്ചയും മൂന്ന് പൂർണ്ണമായി വികസിച്ച ഇലകളും ഉള്ള രണ്ട് തൈകൾ മാത്രം ഓരോ കലത്തിലും അവശേഷിപ്പിച്ചു. എല്ലാ ചട്ടിയിൽ വച്ച ചെടികളും രണ്ടാഴ്ചയിലൊരിക്കൽ നനയ്ക്കുകയും നൽകിയിരിക്കുന്ന ഇനത്തിന് ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന നിരക്കിൽ പ്രതിമാസം വളപ്രയോഗം നടത്തുകയും ചെയ്തു.
500 mg/L സാന്ദ്രതയിൽ L-ornithinediamine ((+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു) തയ്യാറാക്കാൻ, ആദ്യം 50 mg 100 mL അണുവിമുക്തമായ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിച്ചു. സ്റ്റോക്ക് ലായനി പിന്നീട് നേർപ്പിച്ച് തുടർന്നുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ഉപയോഗിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, ആറ് ശ്രേണിയിലുള്ള L-ornithine സാന്ദ്രതകൾ (12.5, 25, 50, 75, 100, 125 mg/L) ഇൻ വിട്രോയിൽ പരീക്ഷിച്ചു. കൂടാതെ, നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണമായി (മോക്ക്) അണുവിമുക്തമായ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളം ഉപയോഗിച്ചു, വാണിജ്യ കുമിൾനാശിനിയായ "Rizolex-T" 50% വെറ്റബിൾ പൊടി (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു. വാണിജ്യ കുമിൾനാശിനിയായ "റിസോലെക്സ്-ടി" അഞ്ച് സാന്ദ്രതകളിൽ (2, 4, 6, 8, 10 മില്ലിഗ്രാം/ലി) ഇൻ വിട്രോയിൽ പരീക്ഷിച്ചു.
വെളുത്ത പൂപ്പലിന്റെ ലക്ഷണങ്ങൾ കാണിക്കുന്ന സാധാരണ പയറുവർഗ്ഗങ്ങളുടെ തണ്ടുകളുടെയും കായ്കളുടെയും സാമ്പിളുകൾ (ബാധ നിരക്ക്: 10–30%) വാണിജ്യ ഫാമുകളിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ചു. മിക്ക രോഗബാധിത സസ്യ വസ്തുക്കളെയും സ്പീഷീസ്/ഇനം (സാധ്യതയുള്ള വാണിജ്യ ഇനം ഗിസ 3) അനുസരിച്ച് തിരിച്ചറിഞ്ഞെങ്കിലും, മറ്റുള്ളവ, പ്രത്യേകിച്ച് പ്രാദേശിക വിപണികളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ചവ, അജ്ഞാത ഇനങ്ങളായിരുന്നു. ശേഖരിച്ച രോഗബാധിത വസ്തുക്കൾ ആദ്യം 0.5% സോഡിയം ഹൈപ്പോക്ലോറൈറ്റ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് 3 മിനിറ്റ് ഉപരിതലത്തിൽ അണുവിമുക്തമാക്കി, തുടർന്ന് അണുവിമുക്തമാക്കിയ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ പലതവണ കഴുകി, അധിക വെള്ളം നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി അണുവിമുക്തമാക്കിയ ഫിൽട്ടർ പേപ്പർ ഉപയോഗിച്ച് തുടച്ചു. പിന്നീട് രോഗബാധിതമായ അവയവങ്ങൾ മധ്യ കലകളിൽ നിന്ന് ചെറിയ കഷണങ്ങളായി മുറിച്ച്, ഉരുളക്കിഴങ്ങ് ഡെക്‌സ്ട്രോസ് അഗർ (പിഡിഎ) മീഡിയത്തിൽ സംസ്‌കരിച്ച്, 25 ± 2 °C താപനിലയിൽ 12 മണിക്കൂർ പ്രകാശം/12 മണിക്കൂർ ഇരുണ്ട ചക്രത്തിൽ 5 ദിവസത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത് സ്ക്ലിറോട്ടിയ രൂപീകരണം ഉത്തേജിപ്പിച്ചു. മിശ്രിത അല്ലെങ്കിൽ മലിനമായ സംസ്കാരങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ഫംഗസ് ഐസൊലേറ്റുകളെ ശുദ്ധീകരിക്കുന്നതിനും മൈസീലിയൽ ടിപ്പ് രീതി ഉപയോഗിച്ചു. ശുദ്ധീകരിച്ച ഫംഗസ് ഐസൊലേറ്റിനെ ആദ്യം തിരിച്ചറിഞ്ഞത് അതിന്റെ സാംസ്കാരിക രൂപാന്തര സ്വഭാവസവിശേഷതകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ്, തുടർന്ന് സൂക്ഷ്മ സ്വഭാവസവിശേഷതകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ആണെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു. ഒടുവിൽ, കോച്ചിന്റെ പോസ്റ്റുലേറ്റുകൾ പാലിക്കുന്നതിനായി, എല്ലാ ശുദ്ധീകരിച്ച ഐസൊലേറ്റുകളും രോഗകാരിത്വത്തിനായി ഗിസ 3 എന്ന സംവേദനക്ഷമതയുള്ള സാധാരണ പയർ ഇനത്തിൽ പരീക്ഷിച്ചു.
കൂടാതെ, വൈറ്റ് തുടങ്ങിയവർ, 1990; ബറ്റുറോ-സിസ്‌നിവ്‌സ്‌ക തുടങ്ങിയവർ, 2017 എന്നിവർ വിവരിച്ച ഇന്റേണൽ ട്രാൻസ്‌ക്രൈബേറ്റഡ് സ്‌പെയ്‌സർ (ഐടിഎസ്) സീക്വൻസിംഗിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി ഏറ്റവും ആക്രമണാത്മകമായ എസ്. സ്‌ക്ലെറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റ് (ഐസൊലേറ്റ് #3) കൂടുതൽ സ്ഥിരീകരിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, ഐസൊലേറ്റുകളെ ഉരുളക്കിഴങ്ങ് ഡെക്‌സ്ട്രോസ് ചാറിൽ (പിഡിബി) സംസ്‌കരിച്ച് 25 ± 2 °C താപനിലയിൽ 5–7 ദിവസം ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. തുടർന്ന് ഫംഗൽ മൈസീലിയം ശേഖരിച്ച്, ചീസ്‌ക്ലോത്തിലൂടെ ഫിൽട്ടർ ചെയ്‌ത്, അണുവിമുക്തമായ വെള്ളത്തിൽ രണ്ടുതവണ കഴുകി, അണുവിമുക്തമായ ഫിൽട്ടർ പേപ്പർ ഉപയോഗിച്ച് ഉണക്കി. ക്വിക്ക്-ഡിഎൻഎ™ ഫംഗൽ/ബാക്ടീരിയൽ മിനിപ്രെപ്പ് കിറ്റ് (കുറമേ-ഇസിയോക, 1997; അതല്ലാ തുടങ്ങിയവർ, 2022, 2024) ഉപയോഗിച്ച് ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ വേർതിരിച്ചു. തുടർന്ന് ITS rDNA മേഖലയെ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമർ ജോഡി ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന വലുപ്പം: 540 bp) ഉപയോഗിച്ച് ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തു (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). ശുദ്ധീകരിച്ച PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ സീക്വൻസിങ്ങിനായി സമർപ്പിച്ചു (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). സാംഗർ സീക്വൻസിംഗ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് ITS rDNA സീക്വൻസുകൾ ദ്വിദിശയിൽ ക്രമീകരിച്ചു. തുടർന്ന് BLASTn സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് GenBank-ലെയും നാഷണൽ സെന്റർ ഫോർ ബയോടെക്നോളജി ഇൻഫർമേഷനിലെയും (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ഏറ്റവും പുതിയ ഡാറ്റയുമായി അസംബിൾ ചെയ്ത ക്വറി സീക്വൻസുകൾ താരതമ്യം ചെയ്തു. മോളിക്യുലാർ എവല്യൂഷണറി ജനിതക വിശകലന പാക്കേജിലെ (MEGA-11; പതിപ്പ് 11) ക്ലസ്റ്റൽW ഉപയോഗിച്ച് NCBI GenBank-ലെ (സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ S1) ഏറ്റവും പുതിയ ഡാറ്റയിൽ നിന്ന് വീണ്ടെടുത്ത മറ്റ് 20 S. സ്ക്ലെറോട്ടിയോറം സ്ട്രെയിനുകൾ/ഐസൊലേറ്റുകളുമായി ക്വറി സീക്വൻസ് താരതമ്യം ചെയ്തു (Kumar et al., 2024). പരമാവധി സാധ്യതാ രീതിയും പൊതുവായ സമയ-തിരിച്ചറിയാവുന്ന ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പകരക്കാരന്റെ മാതൃകയും ഉപയോഗിച്ചാണ് പരിണാമ വിശകലനം നടത്തിയത് (Nei and Kumar, 2000). ഏറ്റവും ഉയർന്ന ലോഗ്-സാധ്യതയുള്ള വൃക്ഷം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. അയൽക്കാരൻ-ചേരുന്ന (NJ) വൃക്ഷത്തിനും (Kumar et al., 2024) പരമാവധി പാർസിമണി (MP) വൃക്ഷത്തിനും ഇടയിൽ ഉയർന്ന ലോഗ്-സാധ്യതയുള്ള വൃക്ഷം തിരഞ്ഞെടുത്താണ് ഹ്യൂറിസ്റ്റിക് തിരയലിനുള്ള പ്രാരംഭ വൃക്ഷം തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത്. പൊതുവായ സമയ-തിരിച്ചറിയാവുന്ന മാതൃക (Nei and Kumar, 2000) ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കിയ ഒരു ജോഡിവൈസ് ദൂര മാട്രിക്സ് ഉപയോഗിച്ചാണ് NJ വൃക്ഷം നിർമ്മിച്ചത്.
എൽ-ഓർണിത്തിൻ, "റൈസോലെക്സ്-ടി" എന്ന ബാക്ടീരിയനാശിനി എന്നിവയുടെ ആൻറി ബാക്ടീരിയൽ പ്രവർത്തനം അഗർ ഡിഫ്യൂഷൻ രീതിയിലൂടെ ഇൻ വിട്രോയിൽ നിർണ്ണയിച്ചു. രീതി: എൽ-ഓർണിത്തിൻ (500 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ) സ്റ്റോക്ക് ലായനിയുടെ ഉചിതമായ അളവ് എടുത്ത് 10 മില്ലി പിഡിഎ ന്യൂട്രിയന്റ് മീഡിയവുമായി നന്നായി കലർത്തി യഥാക്രമം 12.5, 25, 50, 75, 100, 125 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ എന്നിവയുടെ അന്തിമ സാന്ദ്രതയുള്ള ലായനികൾ തയ്യാറാക്കുക. നിയന്ത്രണത്തിനായി "റൈസോലെക്സ്-ടി" എന്ന കുമിൾനാശിനിയുടെ അഞ്ച് സാന്ദ്രതകളും (2, 4, 6, 8, 10 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ) അണുവിമുക്തമായ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളവും ഉപയോഗിച്ചു. മീഡിയം ദൃഢീകരിച്ച ശേഷം, 4 മില്ലീമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള സ്ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം കൾച്ചറിന്റെ പുതുതായി തയ്യാറാക്കിയ മൈസീലിയൽ പ്ലഗ് പെട്രി ഡിഷിന്റെ മധ്യഭാഗത്തേക്ക് മാറ്റി 25±2°C യിൽ മൈസീലിയം മുഴുവൻ കൺട്രോൾ പെട്രി ഡിഷും മൂടുന്നതുവരെ കൾച്ചർ ചെയ്തു, അതിനുശേഷം ഫംഗസ് വളർച്ച രേഖപ്പെടുത്തി. സമവാക്യം 1 ഉപയോഗിച്ച് എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറത്തിന്റെ റേഡിയൽ വളർച്ചയുടെ ശതമാനം തടസ്സം കണക്കാക്കുക:
പരീക്ഷണം രണ്ടുതവണ ആവർത്തിച്ചു, ഓരോ നിയന്ത്രണ/പരീക്ഷണ ഗ്രൂപ്പിനും ആറ് ജൈവ പകർപ്പുകളും ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിനും അഞ്ച് ചട്ടികളും (ഒരു കലത്തിൽ രണ്ട് സസ്യങ്ങൾ). പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളുടെ കൃത്യത, വിശ്വാസ്യത, പുനരുൽപാദനക്ഷമത എന്നിവ ഉറപ്പാക്കാൻ ഓരോ ജൈവ പകർപ്പും രണ്ടുതവണ വിശകലനം ചെയ്തു (രണ്ട് സാങ്കേതിക പകർപ്പുകൾ). കൂടാതെ, പകുതി-പരമാവധി ഇൻഹിബിറ്ററി കോൺസൺട്രേഷൻ (IC50), IC99 (പ്രെന്റിസ്, 1976) എന്നിവ കണക്കാക്കാൻ പ്രോബിറ്റ് റിഗ്രഷൻ വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചു.
ഹരിതഗൃഹ സാഹചര്യങ്ങളിൽ എൽ-ഓർണിതൈനിന്റെ സാധ്യത വിലയിരുത്തുന്നതിനായി, തുടർച്ചയായി രണ്ട് പോട്ട് പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, അണുവിമുക്തമാക്കിയ കളിമൺ-മണൽ മണ്ണ് (3:1) കലങ്ങളിൽ നിറയ്ക്കുകയും പുതുതായി തയ്യാറാക്കിയ എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം കൾച്ചർ കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു. ആദ്യം, ഏറ്റവും ആക്രമണാത്മകമായ എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം (ഐസൊലേറ്റ് #3) ഒരു സ്ക്ലിറോട്ടിയം പകുതിയായി മുറിച്ച്, ഒരു പിഡിഎയിൽ മുഖം താഴ്ത്തി വയ്ക്കുകയും, മൈസീലിയൽ വളർച്ചയെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിനായി 25°C താപനിലയിൽ (24 മണിക്കൂർ) 4 ദിവസം ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തുകൊണ്ട് സംസ്കരിച്ചു. തുടർന്ന് മുൻവശത്ത് നിന്ന് നാല് 5 മില്ലീമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള അഗർ പ്ലഗുകൾ എടുത്ത് 100 ഗ്രാം ഗോതമ്പും അരി തവിടും ചേർന്ന അണുവിമുക്തമായ മിശ്രിതം കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു (1:1, v/v), എല്ലാ ഫ്ലാസ്കുകളും 12 മണിക്കൂർ വെളിച്ചം/12 മണിക്കൂർ ഇരുണ്ട ചക്രത്തിൽ 5 ദിവസത്തേക്ക് 25 ± 2 °C താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, സ്ക്ലിറോട്ടിയ രൂപീകരണം ഉത്തേജിപ്പിച്ചു. മണ്ണ് ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് എല്ലാ ഫ്ലാസ്കുകളിലെയും ഉള്ളടക്കങ്ങൾ ഏകതാനത ഉറപ്പാക്കാൻ നന്നായി കലർത്തി. പിന്നീട്, രോഗകാരികളുടെ സ്ഥിരമായ സാന്ദ്രത ഉറപ്പാക്കാൻ ഓരോ കലത്തിലും 100 ഗ്രാം കോളനൈസിംഗ് തവിട് മിശ്രിതം ചേർത്തു. കുമിൾ വളർച്ച സജീവമാക്കുന്നതിനായി കുത്തിവയ്പ്പ് നടത്തിയ കലങ്ങളിൽ വെള്ളം ഒഴിച്ചു 7 ദിവസം ഹരിതഗൃഹ സാഹചര്യങ്ങളിൽ വച്ചു.
ഗിസ 3 ഇനത്തിൽപ്പെട്ട അഞ്ച് വിത്തുകൾ ഓരോ കലത്തിലും വിതച്ചു. എൽ-ഓർണിതിൻ, കുമിൾനാശിനിയായ റിസോലെക്സ്-ടി എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സംസ്കരിച്ച ചട്ടികളിൽ, അണുവിമുക്തമാക്കിയ വിത്തുകൾ ആദ്യം രണ്ട് സംയുക്തങ്ങളുടെയും ജലീയ ലായനിയിൽ രണ്ട് മണിക്കൂർ മുക്കിവയ്ക്കുകയും, യഥാക്രമം ഏകദേശം 250 mg/L ഉം 50 mg/L ഉം അന്തിമ IC99 സാന്ദ്രതയുള്ള ഒരു ജലീയ ലായനിയിൽ വിതയ്ക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഒരു മണിക്കൂർ വായുവിൽ ഉണക്കുകയും ചെയ്തു. മറുവശത്ത്, നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണമായി വിത്തുകൾ അണുവിമുക്തമാക്കിയ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ മുക്കിവയ്ക്കുക. ആദ്യത്തെ നനയ്ക്കുന്നതിന് 10 ദിവസത്തിനുശേഷം, തൈകൾ നേർത്തതാക്കി, ഓരോ കലത്തിലും രണ്ട് വൃത്തിയുള്ള തൈകൾ മാത്രം അവശേഷിപ്പിച്ചു. കൂടാതെ, എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം അണുബാധ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഒരേ വളർച്ചാ ഘട്ടത്തിലുള്ള (10 ദിവസം) പയർ ചെടിയുടെ തണ്ടുകൾ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത സ്ഥലങ്ങളിൽ അണുവിമുക്തമാക്കിയ സ്കാൽപൽ ഉപയോഗിച്ച് മുറിച്ച് ഓരോ മുറിവിലും ഏകദേശം 0.5 ഗ്രാം കോളനൈസിംഗ് തവിട് മിശ്രിതം വച്ചു, തുടർന്ന് കുത്തിവച്ച എല്ലാ സസ്യങ്ങളിലും അണുബാധയും രോഗ വികസനവും ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിന് ഉയർന്ന ഈർപ്പം നൽകി. നിയന്ത്രണ സസ്യങ്ങളിലും ഇതേ രീതിയിൽ മുറിവുകൾ വരുത്തി, അതേ അളവിൽ (0.5 ഗ്രാം) അണുവിമുക്തമായ, കോളനൈസ് ചെയ്യാത്ത തവിട് മിശ്രിതം മുറിവിൽ ചേർത്ത് ഉയർന്ന ആർദ്രതയിൽ നിലനിർത്തി, രോഗ വികസനത്തിനുള്ള അന്തരീക്ഷം അനുകരിക്കുകയും ചികിത്സാ ഗ്രൂപ്പുകൾക്കിടയിൽ സ്ഥിരത ഉറപ്പാക്കുകയും ചെയ്തു.
ചികിത്സാ രീതി: പയർ തൈകൾക്ക് 500 മില്ലി എൽ-ഓർണിതിൻ (250 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ) ജലീയ ലായനി അല്ലെങ്കിൽ റിസോലെക്സ്-ടി (50 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ) എന്ന കുമിൾനാശിനി മണ്ണിൽ നനച്ച് നനച്ചു, തുടർന്ന് 10 ദിവസത്തെ ഇടവേളയിൽ മൂന്ന് തവണ ചികിത്സ ആവർത്തിച്ചു. പ്ലാസിബോ ചികിത്സിച്ച നിയന്ത്രണങ്ങൾ 500 മില്ലി അണുവിമുക്തമായ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളം ഉപയോഗിച്ച് നനച്ചു. എല്ലാ ചികിത്സകളും ഹരിതഗൃഹ സാഹചര്യങ്ങളിൽ (25 ± 2°C, 75 ± 1% ആപേക്ഷിക ആർദ്രത, 8 മണിക്കൂർ വെളിച്ചം/16 മണിക്കൂർ ഇരുട്ട് എന്ന ഫോട്ടോപീരിയഡ്) നടത്തി. എല്ലാ ചട്ടികളിലും രണ്ടാഴ്ചയിലൊരിക്കൽ നനയ്ക്കുകയും സമതുലിതമായ NPK വളം (20-20-20, 3.6% സൾഫറും TE മൈക്രോലെമെന്റുകളും; സെയിൻ സീഡ്സ്, ഈജിപ്ത്) 3-4 ഗ്രാം/ലിറ്റർ സാന്ദ്രതയിൽ പ്രത്യേക ഇനത്തിനായുള്ള ശുപാർശകളും നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങളും അനുസരിച്ച് ഇലകളിൽ തളിച്ചുകൊണ്ട് പ്രതിമാസം പുരട്ടുകയും ചെയ്തു. മറ്റുവിധത്തിൽ പറഞ്ഞിട്ടില്ലെങ്കിൽ, ഓക്സിഡേറ്റീവ് സ്ട്രെസ് സൂചകങ്ങളുടെ ഇൻ സിറ്റു ഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ ലോക്കലൈസേഷൻ, ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷൻ, എൻസൈമാറ്റിക്, നോൺ-എൻസൈമാറ്റിക് ആന്റിഓക്‌സിഡന്റുകൾ, ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ എന്നിവ ഉൾപ്പെടെയുള്ള കൂടുതൽ വിശകലനങ്ങൾക്കായി, ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം (hpt) 72 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ, പൂർണ്ണമായി വികസിപ്പിച്ച മുതിർന്ന ഇലകൾ (മുകളിൽ നിന്ന് രണ്ടാമത്തെയും മൂന്നാമത്തെയും ഇലകൾ) ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിൽ നിന്നും ശേഖരിച്ച്, ഏകീകൃതമാക്കി, പൂൾ ചെയ്ത് -80 °C-ൽ സൂക്ഷിച്ചു.
ടെറാൻ തുടങ്ങിയവർ (2006) പരിഷ്കരിച്ച പെറ്റ്സോൾട്ട് ആൻഡ് ഡിക്സൺ സ്കെയിൽ (1996) അടിസ്ഥാനമാക്കി 1–9 (സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ S2) എന്ന സ്കെയിൽ ഉപയോഗിച്ച് വെള്ള പൂപ്പൽ അണുബാധയുടെ തീവ്രത ആഴ്ചതോറും 21 ദിവസത്തെ കുത്തിവയ്പ്പിന് ശേഷം (dpi) വിലയിരുത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, പയർ ചെടികളുടെ തണ്ടുകളും ശാഖകളും കുത്തിവയ്പ്പ് ഘട്ടത്തിൽ നിന്ന് ഇന്റർനോഡുകളിലും നോഡുകളിലും മുറിവുകളുടെ പുരോഗതി പിന്തുടരാൻ പരിശോധിച്ചു. കുത്തിവയ്പ്പ് പോയിന്റിൽ നിന്ന് തണ്ടിലോ ശാഖയിലോ ഏറ്റവും അകലെയുള്ള പോയിന്റിലേക്കുള്ള മുറിവിന്റെ ദൂരം അളക്കുകയും മുറിവിന്റെ സ്ഥാനം അടിസ്ഥാനമാക്കി 1–9 എന്ന സ്കോർ നിശ്ചയിക്കുകയും ചെയ്തു, ഇവിടെ (1) കുത്തിവയ്പ്പ് പോയിന്റിനടുത്ത് ദൃശ്യമായ അണുബാധയില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുകയും (2–9) നോഡുകൾ/ഇന്റർനോഡുകളിലൂടെ മുറിവിന്റെ വലുപ്പത്തിലും പുരോഗതിയിലും ക്രമേണ വർദ്ധനവ് സൂചിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു (സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ S2). ഫോർമുല 2 ഉപയോഗിച്ച് വെളുത്ത പൂപ്പൽ അണുബാധയുടെ തീവ്രത പിന്നീട് ശതമാനത്തിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്തു:
കൂടാതെ, രോഗ പുരോഗതി വക്രത്തിന് (AUDPC) കീഴിലുള്ള വിസ്തീർണ്ണം ഫോർമുല ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കി (ഷാനർ ആൻഡ് ഫിന്നി, 1977), ഇത് അടുത്തിടെ സാധാരണ പയറിന്റെ വെളുത്ത അഴുകലിന് (ചൗഹാൻ തുടങ്ങിയവർ, 2020) സമവാക്യം 3 ഉപയോഗിച്ച് പൊരുത്തപ്പെടുത്തി:
ഇവിടെ Yi = ti സമയത്തെ രോഗ തീവ്രത, Yi+1 = അടുത്ത സമയത്തെ ti+1 സമയത്തെ രോഗ തീവ്രത, ti = ആദ്യ അളവെടുപ്പിന്റെ സമയം (ദിവസങ്ങളിൽ), ti+1 = അടുത്ത അളവെടുപ്പിന്റെ സമയം (ദിവസങ്ങളിൽ), n = ആകെ സമയ പോയിന്റുകളുടെയോ നിരീക്ഷണ പോയിന്റുകളുടെയോ എണ്ണം. എല്ലാ ജൈവ പകർപ്പുകളിലും സസ്യ ഉയരം (സെ.മീ), ഓരോ ചെടിയുടെയും ശാഖകളുടെ എണ്ണം, ഓരോ ചെടിയുടെയും ഇലകളുടെ എണ്ണം എന്നിവയുൾപ്പെടെ പയർ ചെടി വളർച്ചാ പാരാമീറ്ററുകൾ ആഴ്ചതോറും 21 ദിവസത്തേക്ക് രേഖപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.
ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിലും, ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം 45-ാം ദിവസം (അവസാന ചികിത്സയ്ക്ക് 15 ദിവസം കഴിഞ്ഞ്) ഇല സാമ്പിളുകൾ (മുകളിൽ നിന്ന് രണ്ടാമത്തെയും മൂന്നാമത്തെയും പൂർണ്ണമായി വികസിച്ച ഇലകൾ) ശേഖരിച്ചു. ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിലും അഞ്ച് കലങ്ങൾ (ഒരു കലത്തിൽ രണ്ട് സസ്യങ്ങൾ) ഉണ്ടായിരുന്നു. ഇരുട്ടിൽ 4 °C താപനിലയിൽ 80% അസെറ്റോൺ ഉപയോഗിച്ച് ഫോട്ടോസിന്തറ്റിക് പിഗ്മെന്റുകൾ (ക്ലോറോഫിൽ എ, ക്ലോറോഫിൽ ബി, കരോട്ടിനോയിഡുകൾ) വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഏകദേശം 500 മില്ലിഗ്രാം പൊടിച്ച ടിഷ്യു ഉപയോഗിച്ചു. 24 മണിക്കൂറിനുശേഷം, സാമ്പിളുകൾ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്ത്, UV-160A സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ (ഷിമാഡ്‌സു കോർപ്പറേഷൻ, ജപ്പാൻ) ഉപയോഗിച്ച് കളറിമെട്രിക് ആയി ക്ലോറോഫിൽ എ, ക്ലോറോഫിൽ ബി, കരോട്ടിനോയിഡ് ഉള്ളടക്കങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കാൻ സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ശേഖരിച്ചു. മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത തരംഗദൈർഘ്യങ്ങളിൽ (A470, A646, A663 nm) ആഗിരണം അളന്ന് UV-160A സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ (ഷിമാഡ്‌സു കോർപ്പറേഷൻ, ജപ്പാൻ) രീതി അനുസരിച്ച്. ഒടുവിൽ, ലിച്ചെന്തലർ (1987) വിവരിച്ച ഇനിപ്പറയുന്ന ഫോർമുലകൾ 4–6 ഉപയോഗിച്ച് ഫോട്ടോസിന്തറ്റിക് പിഗ്മെന്റുകളുടെ ഉള്ളടക്കം കണക്കാക്കി.
ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം 72 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞപ്പോൾ (hpt), ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡിന്റെയും (H2O2) സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ആനയോണിന്റെയും (O2•−) ഇൻ സിറ്റു ഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ ലോക്കലൈസേഷനായി ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിൽ നിന്നും ഇലകൾ (മുകളിൽ നിന്ന് രണ്ടാമത്തെയും മൂന്നാമത്തെയും പൂർണ്ണമായി വികസിപ്പിച്ച ഇലകൾ) ശേഖരിച്ചു. ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിലും അഞ്ച് കലങ്ങൾ (ഒരു കലത്തിൽ രണ്ട് സസ്യങ്ങൾ) ഉൾപ്പെട്ടിരുന്നു. രീതിയുടെ കൃത്യത, വിശ്വാസ്യത, പുനരുൽപാദനക്ഷമത എന്നിവ ഉറപ്പാക്കാൻ ഓരോ ജൈവ പകർപ്പും തനിപ്പകർപ്പായി (രണ്ട് സാങ്കേതിക പകർപ്പുകൾ) വിശകലനം ചെയ്തു. റൊമേറോ-പ്യൂർട്ടാസ് തുടങ്ങിയവർ (2004), ആദം തുടങ്ങിയവർ (1989) എന്നിവർ വിവരിച്ച രീതികൾ പിന്തുടർന്ന് യഥാക്രമം 0.1% 3,3′-ഡയമിനോബെൻസിഡിൻ (DAB; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, ഡാർംസ്റ്റാഡ്, ജർമ്മനി) അല്ലെങ്കിൽ നൈട്രോബ്ലൂ ടെട്രാസോളിയം (NBT; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, ഡാർംസ്റ്റാഡ്, ജർമ്മനി) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് H2O2 ഉം O2•− ഉം നിർണ്ണയിച്ചു, ചെറിയ പരിഷ്കാരങ്ങളോടെ. H2O2 ന്റെ ഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ ലോക്കലൈസേഷനായി, ലഘുലേഖകൾ 10 mM ട്രിസ് ബഫറിൽ (pH 7.8) 0.1% DAB ഉപയോഗിച്ച് വാക്വം ഇൻഫിൽട്രേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 60 മിനിറ്റ് വെളിച്ചത്തിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ലഘുലേഖകൾ 4:1 (v/v) എത്തനോൾ: ക്ലോറോഫോം (അൽ-ഗോംഹോറിയ ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽസ് ആൻഡ് മെഡിക്കൽ സപ്ലൈസ്, കെയ്‌റോ, ഈജിപ്ത്) 0.15% (v/v) TCA യിൽ ബ്ലീച്ച് ചെയ്തു, തുടർന്ന് അവ ഇരുണ്ടുപോകുന്നതുവരെ വെളിച്ചത്തിന് വിധേയമാക്കി. അതുപോലെ, O2•− ന്റെ ഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ ലോക്കലൈസേഷനായി 0.1 w/v % HBT അടങ്ങിയ 10 mM പൊട്ടാസ്യം ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ (pH 7.8) ഉപയോഗിച്ച് വാക്വം ഇൻഫിൽട്രേറ്റ് ചെയ്തു. ലഘുലേഖകൾ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 20 മിനിറ്റ് വെളിച്ചത്തിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് മുകളിൽ പറഞ്ഞതുപോലെ ബ്ലീച്ച് ചെയ്തു, തുടർന്ന് കടും നീല/വയലറ്റ് പാടുകൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നതുവരെ പ്രകാശിപ്പിച്ചു. ഇമേജ് പ്രോസസ്സിംഗ് പാക്കേജായ ഇമേജ്ജെയുടെ ഫിജി പതിപ്പ് (http://fiji.sc; ആക്സസ് ചെയ്തത് 7 മാർച്ച് 2024) ഉപയോഗിച്ച് തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന തവിട്ട് (H2O2 സൂചകമായി) അല്ലെങ്കിൽ നീല-വയലറ്റ് (O2•− സൂചകമായി) നിറത്തിന്റെ തീവ്രത വിലയിരുത്തി.
ഡു, ബ്രാംലേജ് (1992) എന്നിവരുടെ രീതി അനുസരിച്ച് ചെറിയ മാറ്റങ്ങളോടെ മലോണ്ടിയാൾഡിഹൈഡ് (എംഡിഎ; ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷന്റെ മാർക്കറായി) നിർണ്ണയിച്ചു. ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിൽ നിന്നുമുള്ള ഇലകൾ (മുകളിൽ നിന്ന് രണ്ടാമത്തെയും മൂന്നാമത്തെയും പൂർണ്ണമായി വികസിപ്പിച്ച ഇലകൾ) 72 മണിക്കൂർ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം (എച്ച്പിടി) ശേഖരിച്ചു. ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിലും അഞ്ച് ചട്ടി (ഒരു കലത്തിൽ രണ്ട് സസ്യങ്ങൾ) ഉൾപ്പെടുന്നു. രീതിയുടെ കൃത്യത, വിശ്വാസ്യത, പുനരുൽപാദനക്ഷമത എന്നിവ ഉറപ്പാക്കാൻ ഓരോ ജൈവ പകർപ്പും തനിപ്പകർപ്പായി (രണ്ട് സാങ്കേതിക പകർപ്പുകൾ) വിശകലനം ചെയ്തു. ചുരുക്കത്തിൽ, 0.01% ബ്യൂട്ടിലേറ്റഡ് ഹൈഡ്രോക്സിടോളൂയിൻ (ബിഎച്ച്ടി; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ് ലൂയിസ്, എംഒ, യുഎസ്എ) അടങ്ങിയ 20% ട്രൈക്ലോറോഅസെറ്റിക് ആസിഡ് (ടിസിഎ; മില്ലിപോർസിഗ്മ, ബർലിംഗ്ടൺ, എംഎ, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് എംഡിഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ 0.5 ഗ്രാം ഗ്രൗണ്ട് ലീഫ് ടിഷ്യു ഉപയോഗിച്ചു. തുടർന്ന് സൂപ്പർനേറ്റന്റിലെ MDA ഉള്ളടക്കം UV-160A സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ (ഷിമാഡ്‌സു കോർപ്പറേഷൻ, ജപ്പാൻ) ഉപയോഗിച്ച് 532 ഉം 600 nm ഉം ആഗിരണം അളക്കുന്നതിലൂടെ കളറിമെട്രിക് ആയി നിർണ്ണയിക്കുകയും തുടർന്ന് nmol g−1 FW ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.
എൻസൈമാറ്റിക് അല്ലാത്തതും എൻസൈമാറ്റിക് അല്ലാത്തതുമായ ആന്റിഓക്‌സിഡന്റുകളുടെ വിലയിരുത്തലിനായി, 72 മണിക്കൂർ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം (hpt) ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിൽ നിന്നും ഇലകൾ (മുകളിൽ നിന്ന് രണ്ടാമത്തെയും മൂന്നാമത്തെയും പൂർണ്ണമായി വികസിപ്പിച്ച ഇലകൾ) ശേഖരിച്ചു. ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിലും അഞ്ച് ചട്ടികളുണ്ടായിരുന്നു (ഒരു കലത്തിൽ രണ്ട് സസ്യങ്ങൾ). ഓരോ ജൈവ സാമ്പിളും ഡ്യൂപ്ലിക്കേറ്റായി വിശകലനം ചെയ്തു (രണ്ട് സാങ്കേതിക സാമ്പിളുകൾ). രണ്ട് ഇലകൾ ദ്രാവക നൈട്രജൻ ഉപയോഗിച്ച് പൊടിച്ച് എൻസൈമാറ്റിക്, നോൺ-എൻസൈമാറ്റിക് ആന്റിഓക്‌സിഡന്റുകൾ, മൊത്തം അമിനോ ആസിഡുകൾ, പ്രോലൈൻ ഉള്ളടക്കം, ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ, ഓക്സലേറ്റ് അളവ് എന്നിവ നിർണ്ണയിക്കാൻ നേരിട്ട് ഉപയോഗിച്ചു.
കഹ്‌കോണൻ തുടങ്ങിയവർ (1999) വിവരിച്ച രീതിയുടെ ചെറിയ പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങളോടെ ഫോളിൻ-സിയോകാൽറ്റിയു റിയാജന്റ് (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ് ലൂയിസ്, എംഒ, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് ആകെ ലയിക്കുന്ന ഫിനോളിക്കുകൾ നിർണ്ണയിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, ഏകദേശം 0.1 ഗ്രാം ഹോമോജനൈസ് ചെയ്ത ഇല ടിഷ്യു 20 മില്ലി 80% മെഥനോൾ ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂർ ഇരുട്ടിൽ വേർതിരിച്ചെടുത്തു, സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷനുശേഷം സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ശേഖരിച്ചു. സാമ്പിൾ സത്തിൽ 0.1 മില്ലി 0.5 മില്ലി ഫോളിൻ-സിയോകാൽറ്റിയു റിയാജന്റുമായി (10%) കലർത്തി, 30 സെക്കൻഡ് കുലുക്കി 5 മിനിറ്റ് ഇരുട്ടിൽ വച്ചു. തുടർന്ന് 0.5 മില്ലി 20% സോഡിയം കാർബണേറ്റ് ലായനി (Na2CO3; അൽ-ഗോംഹോറിയ ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽസ് ആൻഡ് മെഡിക്കൽ സപ്ലൈസ് കമ്പനി, കെയ്‌റോ, ഈജിപ്ത്) ഓരോ ട്യൂബിലും ചേർത്ത് നന്നായി കലർത്തി മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇരുണ്ട സ്ഥലത്ത് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ഇൻകുബേഷനുശേഷം, UV-160A സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ (ഷിമാഡ്‌സു കോർപ്പറേഷൻ, ജപ്പാൻ) ഉപയോഗിച്ച് പ്രതിപ്രവർത്തന മിശ്രിതത്തിന്റെ ആഗിരണം 765 nm ആയി അളന്നു. സാമ്പിൾ സത്തിൽ ആകെ ലയിക്കുന്ന ഫിനോളുകളുടെ സാന്ദ്രത ഒരു ഗാലിക് ആസിഡ് കാലിബ്രേഷൻ കർവ് (ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, ഹാംപ്ടൺ, NH, USA) ഉപയോഗിച്ച് നിർണ്ണയിക്കുകയും ഒരു ഗ്രാമിന് പുതിയ ഭാരത്തിന് (mg GAE g-1 പുതിയ ഭാരം) തുല്യമായ ഗാലിക് ആസിഡിന്റെ മില്ലിഗ്രാം ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.
ജെറിഡേൻ തുടങ്ങിയവരുടെ (2006) രീതി അനുസരിച്ച് ചെറിയ മാറ്റങ്ങളോടെ ആകെ ലയിക്കുന്ന ഫ്ലേവനോയിഡ് ഉള്ളടക്കം നിർണ്ണയിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, മുകളിൽ പറഞ്ഞ മെഥനോൾ സത്തിൽ നിന്ന് 0.3 മില്ലി 5% അലുമിനിയം ക്ലോറൈഡ് ലായനിയിൽ (AlCl3; ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, ഹാംപ്ടൺ, NH, USA) 0.3 മില്ലി കലർത്തി, ശക്തമായി ഇളക്കി, തുടർന്ന് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 5 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് 0.3 മില്ലി 10% പൊട്ടാസ്യം അസറ്റേറ്റ് ലായനി (അൽ-ഗോംഹോറിയ ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽസ് ആൻഡ് മെഡിക്കൽ സപ്ലൈസ്, കെയ്‌റോ, ഈജിപ്ത്) ചേർത്ത് നന്നായി കലർത്തി മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇരുട്ടിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ഇൻകുബേഷനുശേഷം, UV-160A സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ (ഷിമാഡ്‌സു കോർപ്പറേഷൻ, ജപ്പാൻ) ഉപയോഗിച്ച് പ്രതിപ്രവർത്തന മിശ്രിതത്തിന്റെ ആഗിരണം 430 nm ൽ അളന്നു. സാമ്പിൾ സത്തിൽ ആകെ ലയിക്കുന്ന ഫ്ലേവനോയിഡുകളുടെ സാന്ദ്രത ഒരു റൂട്ടിൻ കാലിബ്രേഷൻ കർവ് (TCI അമേരിക്ക, പോർട്ട്‌ലാൻഡ്, OR, USA) ഉപയോഗിച്ച് നിർണ്ണയിക്കുകയും തുടർന്ന് പുതിയ ഭാരത്തിന്റെ ഗ്രാമിന് മില്ലിഗ്രാം റുട്ടിൻ തുല്യമായി പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു (mg RE g-1 പുതിയ ഭാരം).
യോകോയാമയും ഹിരാമത്സുവും (2003) നിർദ്ദേശിച്ചതും സൺ തുടങ്ങിയവർ (2006) പരിഷ്കരിച്ചതുമായ രീതിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, പരിഷ്കരിച്ച നിൻഹൈഡ്രിൻ റിയാജന്റ് (തെർമോ സയന്റിഫിക് കെമിക്കൽസ്, വാൾത്താം, എംഎ, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ചാണ് ബീൻ ഇലകളുടെ ആകെ സ്വതന്ത്ര അമിനോ ആസിഡിന്റെ അളവ് നിർണ്ണയിച്ചത്. ചുരുക്കത്തിൽ, 0.1 ഗ്രാം ഗ്രൗണ്ട് ടിഷ്യു pH 5.4 ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്തു, കൂടാതെ 200 μL സൂപ്പർനേറ്റന്റിനെ 200 μL നിൻഹൈഡ്രിൻ (2%), 200 μL പിരിഡിൻ (10%; സ്പെക്ട്രം കെമിക്കൽ, ന്യൂ ബ്രൺസ്‌വിക്ക്, എൻ‌ജെ, യുഎസ്എ) എന്നിവയുമായി പ്രതിപ്രവർത്തിപ്പിച്ചു, തിളച്ച വെള്ളത്തിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് തണുപ്പിച്ച് UV-160A സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ (ഷിമാഡ്‌സു കോർപ്പറേഷൻ, ജപ്പാൻ) ഉപയോഗിച്ച് 580 nm-ൽ അളന്നു. മറുവശത്ത്, ബേറ്റ്സ് രീതി ഉപയോഗിച്ചാണ് പ്രോലിൻ നിർണ്ണയിച്ചത് (ബേറ്റ്സ് തുടങ്ങിയവർ, 1973). 3% സൾഫോസാലിസിലിക് ആസിഡ് (തെർമോ സയന്റിഫിക് കെമിക്കൽസ്, വാൾത്താം, എംഎ, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് പ്രോലൈൻ വേർതിരിച്ചെടുത്തു, സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷന് ശേഷം, 0.5 മില്ലി സൂപ്പർനേറ്റന്റ് 1 മില്ലി ഗ്ലേഷ്യൽ അസറ്റിക് ആസിഡുമായി (ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, ഹാംപ്ടൺ, എൻഎച്ച്, യുഎസ്എ) കലർത്തി, 90°C-ൽ 45 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത്, മുകളിൽ പറഞ്ഞ അതേ സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് 520 nm-ൽ തണുപ്പിച്ച് അളന്നു. ഇല സത്തിൽ ആകെ ഫ്രീ അമിനോ ആസിഡുകളും പ്രോലൈനും യഥാക്രമം ഗ്ലൈസിൻ, പ്രോലൈൻ കാലിബ്രേഷൻ കർവുകൾ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ് ലൂയിസ്, എംഒ, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് നിർണ്ണയിക്കുകയും പുതിയ ഭാരമായി mg/g ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.
ആന്റിഓക്‌സിഡന്റ് എൻസൈമുകളുടെ എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനം നിർണ്ണയിക്കാൻ, 1 mM EDTA-Na2 (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ് ലൂയിസ്, MO, USA), 7.5% പോളി വിനൈൽപൈറോളിഡോൺ (PVP; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ് ലൂയിസ്, MO, USA) എന്നിവ അടങ്ങിയ 50 mM ട്രിസ് ബഫറിന്റെ (pH 7.8) 3 മില്ലി ഉപയോഗിച്ച് ഏകദേശം 500 മില്ലിഗ്രാം ഹോമോജനൈസ്ഡ് ടിഷ്യു വേർതിരിച്ചെടുത്തു, 10,000 × g ൽ 20 മിനിറ്റ് റഫ്രിജറേഷനിൽ (4 °C) സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു, സൂപ്പർനാറ്റന്റ് (ക്രൂഡ് എൻസൈം സത്ത്) ശേഖരിച്ചു (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). തുടർന്ന് കാറ്റലേസ് (CAT) 2 മില്ലി 0.1 M സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫറും (pH 6.5; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ് ലൂയിസ്, MO, USA) 100 μl 269 mM H2O2 ലായനിയും ഉപയോഗിച്ച് പ്രതിപ്രവർത്തിച്ച് അതിന്റെ എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനം നിർണ്ണയിക്കാൻ Aebi (1984) ന്റെ രീതി അനുസരിച്ച് ചെറിയ പരിഷ്കാരങ്ങളോടെ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ഉപയോഗിച്ചു. Harrach et al. (2009) ന്റെ രീതി ഉപയോഗിച്ച് Guaiacol-ആശ്രിത പെറോക്സിഡേസ് (POX) എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനം നിർണ്ണയിച്ചു. (2008) ചെറിയ മാറ്റങ്ങളോടെ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) പോളിഫെനോൾ ഓക്സിഡേസിന്റെ (PPO) എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനം 2.2 മില്ലി 100 mM സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ (pH 6.0), 100 μl ഗ്വായാക്കോൾ (TCI കെമിക്കൽസ്, പോർട്ട്‌ലാൻഡ്, OR, USA), 100 μl 12 mM H2O2 എന്നിവയുമായുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന് ശേഷം നിർണ്ണയിച്ചു. (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ൽ നിന്ന് ഈ രീതി ചെറുതായി പരിഷ്കരിച്ചു. 0.1 M ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫറിൽ (pH 6.0) പുതുതായി തയ്യാറാക്കിയ 3 മില്ലി കാറ്റെക്കോൾ ലായനി (തെർമോ സയന്റിഫിക് കെമിക്കൽസ്, വാൾത്താം, MA, USA) (0.01 M) ഉപയോഗിച്ചുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന് ശേഷമാണ് പരിശോധന നടത്തിയത്. 240 nm (A240) ൽ H2O2 ന്റെ വിഘടനം നിരീക്ഷിച്ചാണ് CAT പ്രവർത്തനം അളന്നത്, 436 nm (A436) ൽ ആഗിരണം വർദ്ധനവ് നിരീക്ഷിച്ചാണ് POX പ്രവർത്തനം അളന്നത്, UV-160A സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ 30 സെക്കൻഡിലും 495 nm (A495) ൽ ആഗിരണം ഏറ്റക്കുറച്ചിലുകൾ 3 മിനിറ്റ് രേഖപ്പെടുത്തി PPO പ്രവർത്തനം അളന്നു (ഷിമാഡ്‌സു, ജപ്പാൻ).
അവസാന ചികിത്സയ്ക്ക് 72 മണിക്കൂറിനു ശേഷം ബീൻ ഇലകളിൽ (മുകളിൽ നിന്ന് പൂർണ്ണമായും വികസിപ്പിച്ച രണ്ടാമത്തെയും മൂന്നാമത്തെയും ഇലകൾ) പെറോക്സിസോമൽ കാറ്റലേസ് (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഡിസ്മുട്ടേസ് (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), ഗ്ലൂട്ടത്തയോൺ റിഡക്റ്റേസ് (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) എന്നിവയുൾപ്പെടെ മൂന്ന് ആന്റിഓക്‌സിഡന്റുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ലെവലുകൾ കണ്ടെത്താൻ റിയൽ-ടൈം RT-PCR ഉപയോഗിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് സിംപ്ലി പി ടോട്ടൽ ആർ‌എൻ‌എ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ കിറ്റ് (ക്യാറ്റ്. നമ്പർ. BSC52S1; ബയോഫ്ലക്സ്, ബയോറി ടെക്നോളജി, ചൈന) ഉപയോഗിച്ച് ആർ‌എൻ‌എ വേർതിരിച്ചു. തുടർന്ന്, നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് TOP സ്ക്രിപ്റ്റ്™ cDNA സിന്തസിസ് കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സിഡിഎൻഎ സമന്വയിപ്പിച്ചു. മുകളിലുള്ള മൂന്ന് ജീനുകളുടെ പ്രൈമർ സീക്വൻസുകൾ സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ S3 ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു. ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനായി PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) ഉപയോഗിച്ചു, ആപേക്ഷിക ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ 2-ΔΔCT രീതി ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കി (Livak and Schmittgen, 2001). ബയോട്ടിക് സമ്മർദ്ദത്തിൽ (സാധാരണ പയർവർഗ്ഗങ്ങളും ആന്ത്രാക്നോസ് ഫംഗസും കൊളെറ്റോട്രിക്കം ലിൻഡെമുത്തിയാനവും തമ്മിലുള്ള പൊരുത്തമില്ലാത്ത ഇടപെടൽ) ആക്ടിൻ സ്ഥിരതയും അജിയോട്ടിക് സമ്മർദ്ദവും (വരൾച്ച, ലവണാംശം, കുറഞ്ഞ താപനില) പ്രകടമാക്കി (Borges et al., 2012).
പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ BLAST ഉപകരണം (BLASTp 2.15.0+) ഉപയോഗിച്ച് S. സ്ക്ലെറോട്ടിയോറമിലെ ഓക്സലോഅസെറ്റേറ്റ് അസറ്റൈൽഹൈഡ്രോലേസ് (OAH) പ്രോട്ടീനുകളുടെ ജീനോം-വൈഡ് സിലിക്കോ വിശകലനം ഞങ്ങൾ തുടക്കത്തിൽ നടത്തി (Altschul et al., 1997, 2005). ചുരുക്കത്തിൽ, S. സ്ക്ലെറോട്ടിയോറമിലെ (ടാക്‌സൈഡ്: 5180) ഹോമോലോഗസ് പ്രോട്ടീൻ മാപ്പ് ചെയ്യുന്നതിനായി അന്വേഷണ ശ്രേണികളായി ഞങ്ങൾ Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; ടാക്‌സൈഡ്: 1191702; GenBank ആക്‌സഷൻ നമ്പർ XP_040799428.1; 342 അമിനോ ആസിഡുകൾ) ൽ നിന്നുള്ള OAH ഉം പെൻസിലിയം ലഗേനയും (PlOAH; ടാക്‌സൈഡ്: 94218; GenBank ആക്‌സഷൻ നമ്പർ XP_056833920.1; 316 അമിനോ ആസിഡുകൾ) ഉപയോഗിച്ചു. നാഷണൽ സെന്റർ ഫോർ ബയോടെക്നോളജി ഇൻഫർമേഷൻ (NCBI) വെബ്സൈറ്റായ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ ലെ ജെൻബാങ്കിൽ ഏറ്റവും പുതിയതായി ലഭ്യമായ എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ജീനോം ഡാറ്റ ഉപയോഗിച്ചാണ് BLASTp നടത്തിയത്.
കൂടാതെ, S. sclerotiorum (SsOAH) ൽ നിന്നുള്ള പ്രവചിക്കപ്പെട്ട OAH ജീനിനെയും A. fijiensis CBS 313.89 ൽ നിന്നുള്ള AfOAH ന്റെ പരിണാമ വിശകലനത്തെയും ഫൈലോജെനെറ്റിക് ട്രീയെയും P. lagena യിൽ നിന്നുള്ള PlOAH ഉം MEGA11 (Tamura et al., 2021) ലെ പരമാവധി സാധ്യതാ രീതിയും JTT മാട്രിക്സ് അധിഷ്ഠിത മോഡലും (Jones et al., 1992) ഉപയോഗിച്ച് അനുമാനിച്ചു. S. sclerotiorum ൽ നിന്നുള്ള എല്ലാ പ്രവചിക്കപ്പെട്ട OAH ജീനുകളുടെയും (SsOAH) പ്രോട്ടീൻ സീക്വൻസുകളുടെ മൾട്ടിപ്പിൾ അലൈൻമെന്റ് വിശകലനവും കൺസ്ട്രെയിൻറ്റ്-ബേസ്ഡ് അലൈൻമെന്റ് ടൂൾ (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) ഉപയോഗിച്ചുള്ള അന്വേഷണ ശ്രേണിയുമായി ഫൈലോജെനെറ്റിക് ട്രീ സംയോജിപ്പിച്ചു (Papadopoulos and Agarwala, 2007). കൂടാതെ, S. sclerotiorum-ൽ നിന്നുള്ള SsOAH-ന്റെ ഏറ്റവും മികച്ച പൊരുത്തപ്പെടുന്ന അമിനോ ആസിഡ് ശ്രേണികൾ ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ഉപയോഗിച്ച് ക്വറി സീക്വൻസുകളുമായി (AfOAH, PlOAH) (Larkin et al., 2007) വിന്യസിച്ചു, കൂടാതെ ESPript ടൂൾ (പതിപ്പ് 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ഉപയോഗിച്ച് വിന്യാസത്തിലെ സംരക്ഷിത പ്രദേശങ്ങൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.
കൂടാതെ, S. sclerotiorum SsOAH ന്റെ പ്രവചിക്കപ്പെട്ട ഫങ്ഷണൽ പ്രതിനിധി ഡൊമെയ്‌നുകളും സംരക്ഷിത സൈറ്റുകളും ഇന്റർപ്രോ ടൂൾ (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) ഉപയോഗിച്ച് വ്യത്യസ്ത കുടുംബങ്ങളായി സംവേദനാത്മകമായി തരംതിരിച്ചു (Blum et al., 2021). ഒടുവിൽ, പ്രവചിക്കപ്പെട്ട S. sclerotiorum SsOAH ന്റെ ത്രിമാന (3D) ഘടന മോഡലിംഗ് പ്രോട്ടീൻ ഹോമോളജി/അനലോഗി റെക്കഗ്നിഷൻ എഞ്ചിൻ (Phyre2 സെർവർ പതിപ്പ് 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി (Kelley et al., 2015) SWISS-MODEL സെർവർ (https://swissmodel.expasy.org/) ഉപയോഗിച്ച് സാധൂകരിച്ചു (Biasini et al., 2014). പ്രവചിക്കപ്പെട്ട ത്രിമാന ഘടനകൾ (PDB ഫോർമാറ്റ്) UCSF-Chimera പാക്കേജ് (പതിപ്പ് 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) ഉപയോഗിച്ച് സംവേദനാത്മകമായി ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു (Pettersen et al., 2004).
സ്ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്ക്ലെറോട്ടിയോറത്തിന്റെ മൈസീലിയയിൽ ഓക്സലോഅസെറ്റേറ്റ് അസറ്റൈൽഹൈഡ്രോലേസിന്റെ (SsOAH; GenBank ആക്‌സഷൻ നമ്പർ: XM_001590428.1) ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ ലെവൽ നിർണ്ണയിക്കാൻ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് റിയൽ-ടൈം ഫ്ലൂറസെൻസ് PCR ഉപയോഗിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, S. സ്ക്ലെറോട്ടിയോറം PDB അടങ്ങിയ ഒരു ഫ്ലാസ്കിലേക്ക് കുത്തിവയ്ക്കുകയും ഒരു ഷേക്കിംഗ് ഇൻകുബേറ്ററിൽ (മോഡൽ: I2400, ന്യൂ ബ്രൺസ്‌വിക്ക് സയന്റിഫിക് കമ്പനി, എഡിസൺ, NJ, USA) 25 ± 2 °C താപനിലയിൽ 150 rpm-ൽ 24 മണിക്കൂറും മൈസീലിയൽ വളർച്ചയെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിനായി സ്ഥിരമായ ഇരുട്ടിലും (24 മണിക്കൂറും) സ്ഥാപിക്കുകയും ചെയ്തു. അതിനുശേഷം, കോശങ്ങളെ അന്തിമ IC50 സാന്ദ്രതയിൽ (യഥാക്രമം ഏകദേശം 40 ഉം 3.2 mg/L ഉം) L-ornithine ഉം Rizolex-T ഉം ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു, തുടർന്ന് അതേ സാഹചര്യങ്ങളിൽ മറ്റൊരു 24 മണിക്കൂർ കൾച്ചർ ചെയ്തു. ഇൻകുബേഷനുശേഷം, കൾച്ചറുകൾ 2500 rpm-ൽ 5 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനത്തിനായി സൂപ്പർനേറ്റന്റ് (ഫംഗൽ മൈസീലിയം) ശേഖരിക്കുകയും ചെയ്തു. അതുപോലെ, അണുബാധയ്ക്ക് ശേഷം 0, 24, 48, 72, 96, 120 മണിക്കൂർ എന്നിവയിൽ ഫംഗൽ മൈസീലിയം ശേഖരിച്ചു. ബാധിച്ച ടിഷ്യൂകളുടെ ഉപരിതലത്തിൽ വെളുത്ത പൂപ്പലും കോട്ടൺ മൈസീലിയവും രൂപപ്പെട്ട രോഗബാധിത സസ്യങ്ങളിൽ നിന്ന്. ഫംഗൽ മൈസീലിയത്തിൽ നിന്ന് RNA വേർതിരിച്ചെടുത്തു, തുടർന്ന് മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ cDNA സമന്വയിപ്പിച്ചു. SsOAH-നുള്ള പ്രൈമർ സീക്വൻസുകൾ സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ S3-ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു. SsActin (GenBank ആക്‌സഷൻ നമ്പർ: XM_001589919.1) ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനായി ഉപയോഗിച്ചു, കൂടാതെ 2-ΔΔCT രീതി ഉപയോഗിച്ച് ആപേക്ഷിക ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ കണക്കാക്കി (ലിവാക്കും ഷ്മിറ്റ്ജെനും, 2001).
സൂ, ഷാങ് (2000) എന്നിവരുടെ രീതി അനുസരിച്ച്, ചെറിയ മാറ്റങ്ങളോടെ, ഉരുളക്കിഴങ്ങ് ഡെക്‌സ്ട്രോസ് ചാറിലും (PDB) ഫംഗസ് രോഗകാരിയായ സ്‌ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്‌ക്ലെറോട്ടിയോറം അടങ്ങിയ സസ്യ സാമ്പിളുകളിലും ഓക്‌സാലിക് ആസിഡ് നിർണ്ണയിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, എസ്. സ്‌ക്ലെറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റുകൾ PDB അടങ്ങിയ ഫ്ലാസ്കുകളിലേക്ക് കുത്തിവയ്ക്കുകയും പിന്നീട് ഒരു ഷേക്കിംഗ് ഇൻകുബേറ്ററിൽ (മോഡൽ I2400, ന്യൂ ബ്രൺസ്‌വിക്ക് സയന്റിഫിക് കമ്പനി, എഡിസൺ, NJ, USA) 150 rpm-ൽ 25 ± 2 °C-ൽ 3-5 ദിവസം സ്ഥിരമായ ഇരുട്ടിൽ (24 മണിക്കൂർ) കൾച്ചർ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ഇൻകുബേഷനുശേഷം, ഫംഗസ് കൾച്ചർ ആദ്യം വാട്ട്മാൻ #1 ഫിൽറ്റർ പേപ്പർ വഴി ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും പിന്നീട് അവശിഷ്ടമായ മൈസീലിയം നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി 2500 rpm-ൽ 5 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ഓക്‌സലേറ്റിന്റെ കൂടുതൽ അളവ് നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനായി സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ശേഖരിച്ച് 4°C-ൽ സൂക്ഷിച്ചു. സസ്യ സാമ്പിളുകൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിനായി, ഏകദേശം 0.1 ഗ്രാം സസ്യകലകളുടെ ശകലങ്ങൾ മൂന്ന് തവണ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളം (ഓരോ തവണയും 2 മില്ലി) ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്തു. തുടർന്ന് സാമ്പിളുകൾ 2500 rpm-ൽ 5 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു, സൂപ്പർനേറ്റന്റ് വാട്ട്മാൻ നമ്പർ 1 ഫിൽറ്റർ പേപ്പർ വഴി ഡ്രൈ ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത് കൂടുതൽ വിശകലനത്തിനായി ശേഖരിച്ചു.
ഓക്സാലിക് ആസിഡിന്റെ അളവ് വിശകലനത്തിനായി, പ്രതിപ്രവർത്തന മിശ്രിതം ഒരു ഗ്ലാസ് സ്റ്റോപ്പർഡ് ട്യൂബിൽ ഇനിപ്പറയുന്ന ക്രമത്തിൽ തയ്യാറാക്കി: 0.2 മില്ലി സാമ്പിൾ (അല്ലെങ്കിൽ പിഡിബി കൾച്ചർ ഫിൽട്രേറ്റ് അല്ലെങ്കിൽ ഓക്സാലിക് ആസിഡ് സ്റ്റാൻഡേർഡ് ലായനി), 0.11 മില്ലി ബ്രോമോഫെനോൾ ബ്ലൂ (ബിപിബി, 1 എംഎം; ഫിഷർ കെമിക്കൽ, പിറ്റ്സ്ബർഗ്, പിഎ, യുഎസ്എ), 0.198 മില്ലി 1 എം സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡ് (എച്ച്2എസ്ഒ4; അൽ-ഗോംഹോറിയ ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽസ് ആൻഡ് മെഡിക്കൽ സപ്ലൈസ്, കെയ്റോ, ഈജിപ്ത്) 0.176 മില്ലി 100 എംഎം പൊട്ടാസ്യം ഡൈക്രോമേറ്റ് (കെ2സിആർ2ഒ7; ടിസിഐ കെമിക്കൽസ്, പോർട്ട്ലാൻഡ്, ഒആർ, യുഎസ്എ), തുടർന്ന് ലായനി 4.8 മില്ലിയിലേക്ക് വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിച്ച്, ശക്തമായി കലർത്തി ഉടൻ തന്നെ 60 °C വാട്ടർ ബാത്തിൽ വച്ചു. 10 മിനിറ്റിനു ശേഷം, 0.5 മില്ലി സോഡിയം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ് ലായനി (NaOH; 0.75 എം) ചേർത്ത് പ്രതികരണം നിർത്തി. പ്രതിപ്രവർത്തന മിശ്രിതത്തിന്റെ ആഗിരണം (A600) 600 nm ൽ ഒരു UV-160 സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ (ഷിമാഡ്‌സു കോർപ്പറേഷൻ, ജപ്പാൻ) ഉപയോഗിച്ച് അളന്നു. കൾച്ചർ ഫിൽട്രേറ്റുകളുടെയും സസ്യ സാമ്പിളുകളുടെയും അളവ് യഥാക്രമം നിയന്ത്രണങ്ങളായി PDB, വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളം എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചു. PDB മീഡിയത്തിന്റെ ഒരു മില്ലിലിറ്ററിന് (μg.mL−1) മൈക്രോഗ്രാം ഓക്സാലിക് ആസിഡായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കൾച്ചർ ഫിൽട്രേറ്റുകളിലെ ഓക്സാലിക് ആസിഡിന്റെ സാന്ദ്രതയും, പുതിയ ഭാരമുള്ള ഒരു ഗ്രാമിന് (μg.g−1 FW) മൈക്രോഗ്രാം ഓക്സാലിക് ആസിഡായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഇല സത്തിൽ, ഒരു ഓക്സാലിക് ആസിഡ് കാലിബ്രേഷൻ കർവ് (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക് കെമിക്കൽസ്, വാൾത്താം, MA, USA) ഉപയോഗിച്ച് നിർണ്ണയിച്ചു.
പഠനത്തിലുടനീളം, എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളും പൂർണ്ണമായും ക്രമരഹിതമായ രൂപകൽപ്പനയിലാണ് (CRD) രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കുന്നത്, ഓരോ ചികിത്സയ്ക്കും ആറ് ജൈവ പകർപ്പുകളും ഒരു ജൈവ പകർപ്പിന് അഞ്ച് കലങ്ങളും (ഒരു കലത്തിൽ രണ്ട് സസ്യങ്ങൾ) എന്നിങ്ങനെ. ജൈവ പകർപ്പുകൾ തനിപ്പകർപ്പായി വിശകലനം ചെയ്തു (രണ്ട് സാങ്കേതിക പകർപ്പുകൾ). ഒരേ പരീക്ഷണത്തിന്റെ പുനരുൽപാദനക്ഷമത പരിശോധിക്കാൻ സാങ്കേതിക പകർപ്പുകൾ ഉപയോഗിച്ചു, പക്ഷേ വ്യാജ പകർപ്പുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനത്തിൽ അവ ഉപയോഗിച്ചില്ല. വേരിയൻസ് വിശകലനം (ANOVA) ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു, തുടർന്ന് ടുക്കി-ക്രാമർ സത്യസന്ധമായി കാര്യമായ വ്യത്യാസം (HSD) പരിശോധന (p ≤ 0.05). ഇൻ വിട്രോ പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക്, പ്രോബിറ്റ് മോഡൽ ഉപയോഗിച്ച് IC50, IC99 മൂല്യങ്ങൾ കണക്കാക്കുകയും 95% കോൺഫിഡൻസ് ഇടവേളകൾ കണക്കാക്കുകയും ചെയ്തു.
ഈജിപ്തിലെ എൽ ഗാബിയ ഗവർണറേറ്റിലെ വ്യത്യസ്ത സോയാബീൻ പാടങ്ങളിൽ നിന്ന് ആകെ നാല് ഐസൊലേറ്റുകൾ ശേഖരിച്ചു. PDA മീഡിയത്തിൽ, എല്ലാ ഐസൊലേറ്റുകളും ക്രീം നിറത്തിലുള്ള മൈസീലിയം ഉത്പാദിപ്പിക്കുകയും അത് പെട്ടെന്ന് കോട്ടൺ പോലെ വെള്ളയായി മാറുകയും (ചിത്രം 1A) തുടർന്ന് സ്ക്ലെറോട്ടിയം ഘട്ടത്തിൽ ബീജ് അല്ലെങ്കിൽ തവിട്ട് നിറമാവുകയും ചെയ്തു. സ്ക്ലെറോട്ടിയ സാധാരണയായി ഇടതൂർന്നതും, കറുത്തതും, ഗോളാകൃതിയിലുള്ളതോ അല്ലെങ്കിൽ ക്രമരഹിതമായ ആകൃതിയിലുള്ളതുമാണ്, 5.2 മുതൽ 7.7 മില്ലീമീറ്റർ വരെ നീളവും 3.4 മുതൽ 5.3 മില്ലീമീറ്റർ വരെ വ്യാസവുമുള്ളതാണ് (ചിത്രം 1B). 25 ± 2 °C (ചിത്രം 1A) താപനിലയിൽ 10-12 ദിവസത്തെ ഇൻകുബേഷനുശേഷം നാല് ഐസൊലേറ്റുകൾ കൾച്ചർ മീഡിയത്തിന്റെ അരികിൽ ഒരു അരികിലുള്ള സ്ക്ലെറോട്ടിയ വികസിപ്പിച്ചെങ്കിലും, ഓരോ പ്ലേറ്റിലും സ്ക്ലെറോട്ടിയയുടെ എണ്ണം അവയിൽ ഗണ്യമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരുന്നു (P < 0.001), ഓരോ പ്ലേറ്റിലും ഏറ്റവും കൂടുതൽ സ്ക്ലെറോട്ടിയ (32.33 ± 1.53 സ്ക്ലെറോട്ടിയ; ചിത്രം 1C). അതുപോലെ, ഐസൊലേറ്റ് #3 മറ്റ് ഐസൊലേറ്റുകളെ അപേക്ഷിച്ച് PDB-യിൽ കൂടുതൽ ഓക്സാലിക് ആസിഡ് ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ചു (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; ചിത്രം 1D). ഐസൊലേറ്റ് #3 ഫൈറ്റോപാഥോജെനിക് ഫംഗസ് സ്ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്ക്ലെറോട്ടിയോറത്തിന്റെ സാധാരണ രൂപാന്തരപരവും സൂക്ഷ്മവുമായ സവിശേഷതകൾ കാണിച്ചു. ഉദാഹരണത്തിന്, PDA-യിൽ, ഐസൊലേറ്റ് #3 ന്റെ കോളനികൾ വേഗത്തിൽ വളർന്നു, ക്രീം പോലെ വെളുത്തതായിരുന്നു (ചിത്രം 1A), റിവേഴ്സ് ബീജ് അല്ലെങ്കിൽ ഇളം സാൽമൺ മഞ്ഞ-തവിട്ട് നിറമായിരുന്നു, കൂടാതെ 9 സെന്റീമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള ഒരു പ്ലേറ്റിന്റെ ഉപരിതലം പൂർണ്ണമായും മൂടാൻ 25 ± 2°C താപനിലയിൽ 6-7 ദിവസം എടുത്തു. മുകളിലുള്ള രൂപാന്തരപരവും സൂക്ഷ്മവുമായ സ്വഭാവസവിശേഷതകളുടെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ, ഐസൊലേറ്റ് #3 സ്ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്ക്ലെറോട്ടിയോറം ആയി തിരിച്ചറിഞ്ഞു.
ചിത്രം 1. സാധാരണ പയർവർഗ്ഗ വിളകളിൽ നിന്നുള്ള എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റുകളുടെ സ്വഭാവവും രോഗകാരിത്വവും. (എ) പി‌ഡി‌എ മീഡിയത്തിൽ നാല് എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റുകളുടെ മൈസീലിയൽ വളർച്ച, (ബി) നാല് എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റുകളുടെ സ്ക്ലിറോട്ടിയ, (സി) സ്ക്ലിറോട്ടിയയുടെ എണ്ണം (ഓരോ പ്ലേറ്റിലും), (ഡി) പി‌ഡി‌ബി മീഡിയത്തിൽ ഓക്സാലിക് ആസിഡ് സ്രവണം (μg.mL−1), (ഇ) ഹരിതഗൃഹ സാഹചര്യങ്ങളിൽ സാധ്യതയുള്ള വാണിജ്യ പയർവർഗ്ഗ ഇനമായ ഗിസ 3 ലെ നാല് എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റുകളുടെ രോഗ തീവ്രത (%). മൂല്യങ്ങൾ അഞ്ച് ജൈവ പകർപ്പുകളുടെ ശരാശരി ± SD പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (n = 5). വ്യത്യസ്ത അക്ഷരങ്ങൾ ചികിത്സകൾ തമ്മിലുള്ള സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് പ്രാധാന്യമുള്ള വ്യത്യാസങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (p < 0.05). (F–H) ഐസൊലേറ്റ് #3 (dpi) ഉപയോഗിച്ച് കുത്തിവയ്പ്പ് നടത്തിയ 10 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം, യഥാക്രമം, മുകളിലെ തണ്ടുകളിലും സിലിക്കുകളിലും സാധാരണ വെളുത്ത പൂപ്പൽ ലക്ഷണങ്ങൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ടു. (I) എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റ് #3 ന്റെ ഇന്റേണൽ ട്രാൻസ്ക്രൈബഡ് സ്പേസർ (ഐടിഎസ്) മേഖലയുടെ പരിണാമ വിശകലനം പരമാവധി സാധ്യതാ രീതി ഉപയോഗിച്ച് നടത്തുകയും നാഷണൽ സെന്റർ ഫോർ ബയോടെക്നോളജി ഇൻഫർമേഷൻ (എൻസിബിഐ) ഡാറ്റാബേസിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച 20 റഫറൻസ് ഐസൊലേറ്റുകൾ/സ്ട്രെയിനുകളുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). ക്ലസ്റ്ററിംഗ് ലൈനുകൾക്ക് മുകളിലുള്ള സംഖ്യകൾ മേഖല കവറേജിനെ (%) സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ക്ലസ്റ്ററിംഗ് ലൈനുകൾക്ക് താഴെയുള്ള സംഖ്യകൾ ശാഖാ നീളത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
കൂടാതെ, രോഗകാരിത്വം സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിനായി, ലഭിച്ച നാല് എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റുകൾ ഗ്രീൻഹൗസ് സാഹചര്യങ്ങളിൽ, സാധ്യതയുള്ള വാണിജ്യ ബീൻസ് ഇനമായ ഗിസ 3-നെ കുത്തിവയ്ക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു, ഇത് കോച്ചിന്റെ പോസ്റ്റുലേറ്റുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 1E). ലഭിച്ച എല്ലാ ഫംഗസ് ഐസൊലേറ്റുകളും രോഗകാരികളായിരുന്നു, പച്ച ബീനിനെ (സിവി. ഗിസ 3) ബാധിച്ചേക്കാം, ഇത് എല്ലാ മുകളിലെ നിലത്തെ ഭാഗങ്ങളിലും (ചിത്രം 1F), പ്രത്യേകിച്ച് തണ്ടുകളിലും (ചിത്രം 1G) പോഡുകളിലും (ചിത്രം 1H) സാധാരണ വെളുത്ത പൂപ്പൽ ലക്ഷണങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുമെങ്കിലും, കുത്തിവയ്പ്പിന് 10 ദിവസത്തിനുശേഷം (dpi), രണ്ട് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ഐസൊലേറ്റ് 3 ഏറ്റവും ആക്രമണാത്മകമായിരുന്നു. ബീൻസ് ചെടികളിൽ ഐസൊലേറ്റ് 3 ന് ഏറ്റവും ഉയർന്ന രോഗ തീവ്രത (%) ഉണ്ടായിരുന്നു (രോഗബാധയ്ക്ക് ശേഷം 7, 14, 21 ദിവസങ്ങളിൽ യഥാക്രമം 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, 76.7 ± 3.1; ചിത്രം 1F).
ഏറ്റവും ആക്രമണാത്മകമായ എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റ് #3 ന്റെ തിരിച്ചറിയൽ ആന്തരിക ട്രാൻസ്ക്രൈബുചെയ്ത സ്പേസർ (ഐടിഎസ്) സീക്വൻസിംഗ് (ചിത്രം 1I) അടിസ്ഥാനമാക്കി കൂടുതൽ സ്ഥിരീകരിച്ചു. ഐസൊലേറ്റ് #3 നും 20 റഫറൻസ് ഐസൊലേറ്റുകൾ/സ്ട്രെയിനുകൾക്കും ഇടയിലുള്ള ഫൈലോജെനെറ്റിക് വിശകലനത്തിൽ അവയ്ക്കിടയിൽ ഉയർന്ന സാമ്യം (>99%) കാണിച്ചു. ഉണങ്ങിയ പയർ വിത്തുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത അമേരിക്കൻ എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റ് എൽപിഎം36 (ജെൻബാങ്ക് ആക്സഷൻ നമ്പർ MK896659.1; 540 ബിപി), വയലറ്റ് (മത്തിയോള ഇൻകാന) തണ്ട് ചെംചീയലിന് കാരണമാകുന്ന ചൈനീസ് എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റ് YKY211 (ജെൻബാങ്ക് ആക്സഷൻ നമ്പർ OR206374.1; 548 ബിപി) എന്നിവയുമായി എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റ് #3 (533 ബിപി) ന് ഉയർന്ന സാമ്യമുണ്ടെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, ഇവയെല്ലാം ഡെൻഡ്രോഗ്രാമിന്റെ മുകളിൽ വെവ്വേറെ തരംതിരിച്ചിരിക്കുന്നു (ചിത്രം 1I). പുതിയ ശ്രേണി NCBI ഡാറ്റാബേസിൽ നിക്ഷേപിക്കുകയും "Sclerotinia sclerotiorum - isolate YN-25" (GenBank accession number PV202792) എന്ന് നാമകരണം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ഐസൊലേറ്റ് 3 ആണ് ഏറ്റവും ആക്രമണാത്മക ഐസൊലേറ്റ് എന്ന് കാണാൻ കഴിയും; അതിനാൽ, തുടർന്നുള്ള എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളിലും ഈ ഐസൊലേറ്റ് പഠനത്തിനായി തിരഞ്ഞെടുത്തു.
എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഐസൊലേറ്റ് 3 നെതിരെ വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകളിൽ (12.5, 25, 50, 75, 100, 125 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ) ഡയമിൻ എൽ-ഓർണിതൈനിന്റെ (സിഗ്മ-ആൾഡ്രിച്ച്, ഡാർംസ്റ്റാഡ്, ജർമ്മനി) ആൻറി ബാക്ടീരിയൽ പ്രവർത്തനം ഇൻ വിട്രോയിൽ പരിശോധിച്ചു. എൽ-ഓർണിതൈൻ ഒരു ആൻറി ബാക്ടീരിയൽ പ്രഭാവം ചെലുത്തുകയും ഡോസ്-ആശ്രിത രീതിയിൽ എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ഹൈഫയുടെ റേഡിയൽ വളർച്ചയെ ക്രമേണ തടയുകയും ചെയ്തു എന്നത് ശ്രദ്ധേയമാണ് (ചിത്രം 2A, B). പരിശോധിച്ച ഏറ്റവും ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ (125 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ), എൽ-ഓർണിതൈൻ ഏറ്റവും ഉയർന്ന മൈസീലിയൽ വളർച്ചാ തടസ്സ നിരക്ക് (99.62 ± 0.27%; ചിത്രം 2B) പ്രകടമാക്കി, ഇത് പരീക്ഷിച്ച ഏറ്റവും ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ (10 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ) വാണിജ്യ കുമിൾനാശിനിയായ റിസോളക്സ്-ടിക്ക് (ഇൻഹിബിഷൻ നിരക്ക് 99.45 ± 0.39%; ചിത്രം 2C) തുല്യമായിരുന്നു, ഇത് സമാനമായ ഫലപ്രാപ്തിയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ചിത്രം 2. സ്ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്ക്ലെറോട്ടിയോറത്തിനെതിരെ എൽ-ഓർണിത്തിൻ്റെ ഇൻ വിട്രോ ആൻറി ബാക്ടീരിയൽ പ്രവർത്തനം. (എ) എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറത്തിനെതിരെ എൽ-ഓർണിത്തിൻ്റെ വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകളുടെ ആൻറി ബാക്ടീരിയൽ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ വാണിജ്യ കുമിൾനാശിനിയായ റിസോലെക്സ്-ടി (10 മില്ലിഗ്രാം/എൽ) യുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുക. (ബി, സി) വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകളിൽ എൽ-ഓർണിത്തിൻ (12.5, 25, 50, 75, 100, 125 മില്ലിഗ്രാം/എൽ) അല്ലെങ്കിൽ റിസോലെക്സ്-ടി (2, 4, 6, 8, 10 മില്ലിഗ്രാം/എൽ) ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം മൈസീലിയൽ വളർച്ചയുടെ ഇൻഹിബിഷൻ നിരക്ക് (%). മൂല്യങ്ങൾ അഞ്ച് ജൈവ പകർപ്പുകളുടെ ശരാശരി ± SD പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (n = 5). വ്യത്യസ്ത അക്ഷരങ്ങൾ ചികിത്സകൾ തമ്മിലുള്ള സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് വ്യത്യാസങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (p < 0.05). (D, E) യഥാക്രമം എൽ-ഓർണിത്തിൻ, വാണിജ്യ കുമിൾനാശിനി റിസോലെക്സ്-ടി എന്നിവയുടെ പ്രോബിറ്റ് മോഡൽ റിഗ്രഷൻ വിശകലനം. പ്രോബിറ്റ് മോഡൽ റിഗ്രഷൻ ലൈൻ ഒരു കടും നീല വരയായും, കോൺഫിഡൻസ് ഇന്റർവെൽ (95%) ഒരു ഡാഷ്ഡ് റെഡ് ലൈൻ ആയും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
കൂടാതെ, പ്രോബിറ്റ് റിഗ്രഷൻ വിശകലനം നടത്തി, അനുബന്ധ പ്ലോട്ടുകൾ പട്ടിക 1 ലും ചിത്രങ്ങൾ 2D,E യിലും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ചുരുക്കത്തിൽ, എൽ-ഓർണിതൈനിന്റെ സ്വീകാര്യമായ ചരിവ് മൂല്യവും (y = 2.92x − 4.67) അനുബന്ധ പ്രധാന സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകളും (കോക്സ് & സ്നെൽ R2 = 0.3709, നാഗൽകെർക്ക് R2 = 0.4998, p < 0.0001; ചിത്രം 2D) വാണിജ്യ കുമിൾനാശിനിയായ റിസോളെക്സ്-ടി (y = 1.96x − 0.99, കോക്സ് & സ്നെൽ R2 = 0.1242, നാഗൽകെർക്ക് R2 = 0.1708, p < 0.0001) (പട്ടിക 1) മായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറത്തിനെതിരെ മെച്ചപ്പെട്ട ആന്റിഫംഗൽ പ്രവർത്തനം സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
പട്ടിക 1. എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറത്തിനെതിരെ എൽ-ഓർണിതിൻ, വാണിജ്യ കുമിൾനാശിനിയായ "റിസോലെക്സ്-ടി" എന്നിവയുടെ പകുതി-പരമാവധി ഇൻഹിബിറ്ററി സാന്ദ്രത (IC50), IC99 (mg/l) എന്നിവയുടെ മൂല്യങ്ങൾ.
മൊത്തത്തിൽ, ചികിത്സിക്കാത്ത എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ബാധിച്ച സസ്യങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച്, ചികിത്സിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ച സാധാരണ പയർ ചെടികളിൽ വെളുത്ത പൂപ്പലിന്റെ വളർച്ചയും കാഠിന്യവും എൽ-ഓർണിതിൻ (250 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ) ഗണ്യമായി കുറച്ചു (നിയന്ത്രണം; ചിത്രം 3A). ചുരുക്കത്തിൽ, ചികിത്സിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചിട്ടില്ലാത്ത അണുബാധയുള്ള നിയന്ത്രണ സസ്യങ്ങളുടെ രോഗ തീവ്രത ക്രമേണ വർദ്ധിച്ചുവെങ്കിലും (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, 92.33 ± 3.06%), എൽ-ഓർണിതിൻ പരീക്ഷണത്തിലുടനീളം രോഗ തീവ്രത (%) ഗണ്യമായി കുറച്ചു (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, 26.36 ± 3.07) ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം യഥാക്രമം 7, 14, 21 ദിവസങ്ങളിൽ (dpt) (ചിത്രം 3A). അതുപോലെ, എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ബാധിച്ച പയർ ചെടികളെ 250 mg/L L-ഓർണിതിൻ ഉപയോഗിച്ച് പരിചരിച്ചപ്പോൾ, ചികിത്സിച്ചിട്ടില്ലാത്ത നിയന്ത്രണത്തിൽ രോഗ പുരോഗതി വക്രത്തിന് (AUDPC) കീഴിലുള്ള വിസ്തീർണ്ണം 1274.33 ± 33.13 ൽ നിന്ന് 281.03 ± 7.95 ആയി കുറഞ്ഞു, ഇത് പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണ 50 mg/L റിസോലെക്സ്-ടി കുമിൾനാശിനിയേക്കാൾ അല്പം കുറവായിരുന്നു (183.61 ± 7.71; ചിത്രം 3B). രണ്ടാമത്തെ പരീക്ഷണത്തിലും ഇതേ പ്രവണത നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.
ചിത്രം 3. ഹരിതഗൃഹ സാഹചര്യങ്ങളിൽ സ്ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്ക്ലെറോട്ടിയോറം മൂലമുണ്ടാകുന്ന സാധാരണ പയറിന്റെ വെളുത്ത ചെംചീയൽ വികസനത്തിൽ എൽ-ഓർണിതൈൻ ബാഹ്യമായി പ്രയോഗിക്കുന്നതിന്റെ ഫലം. (എ) 250 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ എൽ-ഓർണിതൈൻ ഉപയോഗിച്ചതിന് ശേഷം സാധാരണ പയറിന്റെ വെളുത്ത പൂപ്പലിന്റെ രോഗ പുരോഗതി വക്രം. (ബി) എൽ-ഓർണിതൈൻ ഉപയോഗിച്ചതിന് ശേഷം സാധാരണ പയറിന്റെ വെളുത്ത പൂപ്പലിന്റെ രോഗ പുരോഗതി വക്രത്തിന് (AUDPC) കീഴിലുള്ള വിസ്തീർണ്ണം. മൂല്യങ്ങൾ അഞ്ച് ജൈവ പകർപ്പുകളുടെ ശരാശരി ± SD പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (n = 5). വ്യത്യസ്ത അക്ഷരങ്ങൾ ചികിത്സകൾ തമ്മിലുള്ള സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് പ്രാധാന്യമുള്ള വ്യത്യാസങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (p < 0.05).
250 mg/L L-ഓർണിഥൈൻ പുറത്തു പ്രയോഗിക്കുന്നത് 42 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം ചെടിയുടെ ഉയരം (ചിത്രം 4A), ഓരോ ചെടിയുടെയും ശാഖകളുടെ എണ്ണം (ചിത്രം 4B), ഓരോ ചെടിയുടെയും ഇലകളുടെ എണ്ണം (ചിത്രം 4C) ക്രമേണ വർദ്ധിപ്പിച്ചു. വാണിജ്യ കുമിൾനാശിനിയായ റിസോലെക്സ്-ടി (50 mg/L) പഠിച്ച എല്ലാ പോഷക പാരാമീറ്ററുകളിലും ഏറ്റവും വലിയ സ്വാധീനം ചെലുത്തിയപ്പോൾ, ചികിത്സയില്ലാത്ത നിയന്ത്രണങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച് 250 mg/L L-ഓർണിഥൈൻ പുറത്തു പ്രയോഗിക്കുന്നത് രണ്ടാമത്തെ വലിയ ഫലമാണ് (ചിത്രം 4A–C). മറുവശത്ത്, എൽ-ഓർണിഥൈൻ ചികിത്സ ഫോട്ടോസിന്തറ്റിക് പിഗ്മെന്റുകളായ ക്ലോറോഫിൽ എ (ചിത്രം 4D), ക്ലോറോഫിൽ ബി (ചിത്രം 4E) എന്നിവയുടെ ഉള്ളടക്കത്തിൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തിയില്ല, പക്ഷേ നെഗറ്റീവ് കൺട്രോൾ (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) ഉം പോസിറ്റീവ് കൺട്രോൾ (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; ചിത്രം 4F) ഉം താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ മൊത്തം കരോട്ടിനോയിഡ് ഉള്ളടക്കം (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) ചെറുതായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു. മൊത്തത്തിൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് എൽ-ഓർണിഥൈൻ സംസ്കരിച്ച പയർവർഗ്ഗങ്ങൾക്ക് ഫൈറ്റോടോക്സിക് അല്ലെന്നും അവയുടെ വളർച്ചയെ ഉത്തേജിപ്പിക്കാൻ പോലും കഴിയുമെന്നുമാണ്.
ചിത്രം 4. ഹരിതഗൃഹ സാഹചര്യങ്ങളിൽ സ്ക്ലെറോട്ടിനിയ സ്ക്ലെറോട്ടിയോറം ബാധിച്ച ബീൻ ഇലകളുടെ വളർച്ചാ സവിശേഷതകളിലും ഫോട്ടോസിന്തറ്റിക് പിഗ്മെന്റുകളിലും എൽ-ഓർണിതൈൻ പ്രയോഗത്തിന്റെ ബാഹ്യ സ്വാധീനം. (എ) ചെടിയുടെ ഉയരം (സെ.മീ), (ബി) ഒരു ചെടിയിലെ ശാഖകളുടെ എണ്ണം, (സി) ഒരു ചെടിയിലെ ഇലകളുടെ എണ്ണം, (ഡി) ക്ലോറോഫിൽ എ ഉള്ളടക്കം (mg g-1 fr wt), (ഇ) ക്ലോറോഫിൽ ബി ഉള്ളടക്കം (mg g-1 fr wt), (എഫ്) ആകെ കരോട്ടിനോയിഡ് ഉള്ളടക്കം (mg g-1 fr wt). അഞ്ച് ജൈവ പകർപ്പുകളുടെ ശരാശരി ± SD ആണ് മൂല്യങ്ങൾ (n = 5). വ്യത്യസ്ത അക്ഷരങ്ങൾ ചികിത്സകൾ തമ്മിലുള്ള സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് പ്രാധാന്യമുള്ള വ്യത്യാസങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (p < 0.05).
റിയാക്ടീവ് ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസുകളുടെയും (ROS; ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് [H2O2] ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു) ഫ്രീ റാഡിക്കലുകളുടെയും (സൂപ്പറോക്സൈഡ് ആനയോണുകളായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു [O2•−]) സ്ഥലത്തുവച്ചുള്ള ഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ ലോക്കലൈസേഷനിൽ, L-ഓർണിതിൻ (250 mg/L) ന്റെ ബാഹ്യ പ്രയോഗം H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; ചിത്രം. 5A) ന്റെയും O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; ചിത്രം. 5B) യുടെയും ശേഖരണം ഗണ്യമായി കുറച്ചതായി കണ്ടെത്തി. ചികിത്സിക്കാത്ത രോഗബാധിതമായ രണ്ട് സസ്യങ്ങളുടെയും (യഥാക്രമം 173.31 ± 12.06 ഉം 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) വാണിജ്യ കുമിൾനാശിനിയായ റിസോലെക്സ്-ടി (170.12 ± 9.50 ഉം 157.00 ± 7.81 ഉം) ശേഖരണവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ. 72 മണിക്കൂറിൽ യഥാക്രമം nmol.g−1 fr wt) ഉയർന്ന അളവിൽ H2O2 ഉം O2•− ഉം hpt യിൽ അടിഞ്ഞുകൂടി (ചിത്രം 5A, B). അതുപോലെ, TCA അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള മലോണ്ടിയാൾഡിഹൈഡ് (MDA) പരിശോധനയിൽ S. സ്ക്ലെറോട്ടിയോറം ബാധിച്ച ബീൻ സസ്യങ്ങൾ അവയുടെ ഇലകളിൽ ഉയർന്ന അളവിൽ MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) അടിഞ്ഞുകൂടിയതായി കാണിച്ചു (ചിത്രം 5C). എന്നിരുന്നാലും, L-ഓർണിതൈൻ ബാഹ്യമായി പ്രയോഗിച്ചത് ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷനെ ഗണ്യമായി കുറച്ചു, ഇത് ചികിത്സിച്ച സസ്യങ്ങളിലെ MDA ഉള്ളടക്കത്തിലെ കുറവ് (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ചിത്രം 5. ഹരിതഗൃഹ സാഹചര്യങ്ങളിൽ അണുബാധയ്ക്ക് ശേഷം 72 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ എസ്. സ്ക്ലിറോട്ടിയോറം ബാധിച്ച ബീൻ ഇലകളിൽ ഓക്സിഡേറ്റീവ് സ്ട്രെസ്, നോൺ-എൻസൈമാറ്റിക് ആന്റിഓക്‌സിഡന്റ് പ്രതിരോധ സംവിധാനങ്ങൾ എന്നിവയുടെ പ്രധാന മാർക്കറുകളിൽ ബാഹ്യ എൽ-ഓർണിതിൻ പ്രയോഗത്തിന്റെ പ്രഭാവം. (എ) ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt, (ബി) സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ആനയോൺ (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt, (സി) മാലോണ്ടിയാൾഡിഹൈഡ് (എംഡിഎ; nmol g−1 FW) 72 hpt, (ഡി) ആകെ ലയിക്കുന്ന ഫിനോളുകൾ (mg GAE g−1 FW) 72 hpt, (ഇ) ആകെ ലയിക്കുന്ന ഫ്ലേവനോയ്ഡുകൾ (mg RE g−1 FW), (F) ആകെ ഫ്രീ അമിനോ ആസിഡുകൾ (mg g−1 FW) 72 hpt, (ജി) പ്രോലൈൻ ഉള്ളടക്കം (mg g−1 FW) 72 hpt. മൂല്യങ്ങൾ 5 ജൈവ പകർപ്പുകളുടെ (n = 5) ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ (ശരാശരി ± SD) പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. വ്യത്യസ്ത അക്ഷരങ്ങൾ ചികിത്സകൾ തമ്മിലുള്ള സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് പ്രാധാന്യമുള്ള വ്യത്യാസങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (p < 0.05).