കരൾ ഫൈബ്രോസിസ് ഉള്ള രോഗികളിൽ ഗട്ട്-ഡിറൈവ്ഡ് ട്രിപ്റ്റോഫാൻ മെറ്റാബോലൈറ്റ് ഇൻഡോൾ-3-പ്രൊപ്പിയോണിക് ആസിഡിന്റെ (ഐപിഎ) സെറം അളവ് കുറവാണെന്ന് ഞങ്ങൾ മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിരുന്നു. ഈ പഠനത്തിൽ, സെറം ഐപിഎ ലെവലുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട് പൊണ്ണത്തടിയുള്ള കരളിലെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമും ഡിഎൻഎ മെത്തിലോമും, ഇൻ വിട്രോയിൽ ഹെപ്പാറ്റിക് സ്റ്റെല്ലേറ്റ് കോശങ്ങളുടെ (എച്ച്എസ്‌സി) ഫിനോടൈപ്പിക് നിഷ്‌ക്രിയത്വത്തിന് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിൽ ഐപിഎയുടെ പങ്കിനെക്കുറിച്ചും ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു.
കുവോപിയോ ബാരിയാട്രിക് സർജറി സെന്ററിൽ (KOBS) ബാരിയാട്രിക് ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്ക് വിധേയരായ ടൈപ്പ് 2 ഡയബറ്റിസ് മെലിറ്റസ് (T2DM) ഇല്ലാത്ത (പ്രായം 46.8 ± 9.3 വയസ്സ്; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) പൊണ്ണത്തടിയുള്ള 116 രോഗികളെയാണ് പഠനത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയത്. ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി-മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (LC-MS) ഉപയോഗിച്ചാണ് രക്തചംക്രമണ IPA ലെവലുകൾ അളന്നത്, മൊത്തം RNA സീക്വൻസിംഗ് ഉപയോഗിച്ചാണ് കരൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം വിശകലനം നടത്തിയത്, ഇൻഫിനിയം ഹ്യൂമൻ മെത്തിലേഷൻ 450 ബീഡ്ചിപ്പ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷൻ വിശകലനം നടത്തിയത്. ഇൻ വിട്രോ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി മനുഷ്യ ഹെപ്പാറ്റിക് സ്റ്റെല്ലേറ്റ് സെല്ലുകൾ (LX-2) ഉപയോഗിച്ചു.
കരളിലെ അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക്, മൈറ്റോഫാജിക്, ദീർഘായുസ്സ് പാതകളിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ജീനുകളുടെ പ്രകടനവുമായി സെറം ഐപിഎ ലെവലുകൾ ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. കരൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിലും ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷൻ പ്രൊഫൈലുകളിലും ഏറ്റവും സമൃദ്ധവും പ്രബലവുമായ സംവേദനാത്മക ജീൻ ആയിരുന്നു എകെടി സെറിൻ/ത്രിയോണിൻ കൈനേസ് 1 (എകെടി1) ജീൻ. എൽഎക്സ്-2 കോശങ്ങളുടെ ഫൈബ്രോസിസ്, അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, അതിജീവനം എന്നിവ നിയന്ത്രിക്കാൻ അറിയപ്പെടുന്ന ജീനുകളുടെ പ്രകടനത്തെ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് ഐപിഎ ചികിത്സ അപ്പോപ്റ്റോസിസിന് കാരണമായി, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസനം കുറച്ചു, സെൽ രൂപഘടനയിലും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിലും മാറ്റം വരുത്തി.
ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഐപിഎയ്ക്ക് സാധ്യതയുള്ള ചികിത്സാ ഫലങ്ങളുണ്ടെന്നും അപ്പോപ്‌ടോസിസിനെ പ്രേരിപ്പിക്കാനും എച്ച്എസ്‌സി ഫിനോടൈപ്പിനെ ഒരു നിഷ്‌ക്രിയ അവസ്ഥയിലേക്ക് മാറ്റാനും കഴിയുമെന്നും ഈ ഡാറ്റ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. അതുവഴി എച്ച്എസ്‌സി ആക്ടിവേഷനും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിസവും തടസ്സപ്പെടുത്തി കരൾ ഫൈബ്രോസിസ് തടയാനുള്ള സാധ്യത വർദ്ധിക്കുന്നു.
പൊണ്ണത്തടിയുടെയും മെറ്റബോളിക് സിൻഡ്രോമിന്റെയും വ്യാപനം മെറ്റബോളിക്കലി അസോസിയേറ്റഡ് ഫാറ്റി ലിവർ ഡിസീസ് (MASLD) വർദ്ധിക്കുന്നതിലേക്ക് നയിച്ചിട്ടുണ്ട്; ഈ രോഗം സാധാരണ ജനസംഖ്യയുടെ 25% മുതൽ 30% വരെ ആളുകളെ ബാധിക്കുന്നു [1]. MASLD എറ്റിയോളജിയുടെ പ്രധാന പരിണതഫലം ലിവർ ഫൈബ്രോസിസ് ആണ്, ഇത് ഫൈബ്രസ് എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സിന്റെ (ECM) തുടർച്ചയായ ശേഖരണത്താൽ സവിശേഷതയുള്ള ഒരു ചലനാത്മക പ്രക്രിയയാണ് [2]. ലിവർ ഫൈബ്രോസിസിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന പ്രധാന കോശങ്ങൾ ഹെപ്പാറ്റിക് സ്റ്റെല്ലേറ്റ് സെല്ലുകളാണ് (HSCs), അവ നാല് അറിയപ്പെടുന്ന ഫിനോടൈപ്പുകൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു: ക്വിസെന്റ്, ആക്റ്റിവേറ്റഡ്, ഇൻആക്റ്റിവേറ്റഡ്, സെനസെന്റ് [3, 4]. ഉയർന്ന ഊർജ്ജ ആവശ്യകതകളുള്ള, α-സ്മൂത്ത് മസിൽ ആക്റ്റിൻ (α-SMA), ടൈപ്പ് I കൊളാജൻ (Col-I) എന്നിവയുടെ വർദ്ധിച്ച പ്രകടനത്തോടെ, HSC-കളെ സജീവമാക്കാനും ഒരു ക്വിസെന്റ് രൂപത്തിൽ നിന്ന് പ്രോലിഫെറേറ്റീവ് ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ് പോലുള്ള കോശങ്ങളിലേക്ക് മാറ്റാനും കഴിയും [5, 6]. ലിവർ ഫൈബ്രോസിസ് റിവേഴ്‌സൽ സമയത്ത്, അപ്പോപ്റ്റോസിസ് അല്ലെങ്കിൽ ഇൻആക്റ്റിവേഷൻ വഴി സജീവമാക്കിയ HSC-കൾ ഇല്ലാതാക്കുന്നു. ഈ പ്രക്രിയകളിൽ ഫൈബ്രോജെനിക് ജീനുകളുടെ ഡൗൺറെഗുലേഷൻ, പ്രോസർവൈവൽ ജീനുകളുടെ മോഡുലേഷൻ (NF-κB, PI3K/Akt സിഗ്നലിംഗ് പാതകൾ പോലുള്ളവ) [7, 8], അതുപോലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിലും പ്രവർത്തനത്തിലുമുള്ള മാറ്റങ്ങൾ [9] എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.
കുടലിൽ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്ന ട്രിപ്റ്റോഫാൻ മെറ്റാബോലൈറ്റ് ഇൻഡോൾ-3-പ്രൊപ്പിയോണിക് ആസിഡിന്റെ (IPA) സെറം അളവ്, MASLD ഉൾപ്പെടെയുള്ള മനുഷ്യ ഉപാപചയ രോഗങ്ങളിൽ കുറയുന്നതായി കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട് [10–13]. IPA ഭക്ഷണ നാരുകളുടെ ഉപഭോഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ആന്റിഓക്‌സിഡന്റിനും ആന്റി-ഇൻഫ്ലമേറ്ററി ഇഫക്റ്റുകൾക്കും പേരുകേട്ടതാണ്, കൂടാതെ ഭക്ഷണക്രമം മൂലമുണ്ടാകുന്ന നോൺ-ആൽക്കഹോളിക് സ്റ്റീറ്റോഹെപ്പറ്റൈറ്റിസ് (NASH) ഫിനോടൈപ്പ് ഇൻ വിവോയിലും ഇൻ വിട്രോയിലും [11–14] ദുർബലപ്പെടുത്തുന്നു. കുവോപിയോ ബാരിയാട്രിക് സർജറി സ്റ്റഡിയിൽ (KOBS) ലിവർ ഫൈബ്രോസിസ് ഇല്ലാത്ത പൊണ്ണത്തടിയുള്ള രോഗികളേക്കാൾ ലിവർ ഫൈബ്രോസിസ് ഉള്ള രോഗികളിൽ സീറം IPA ലെവലുകൾ കുറവാണെന്ന് തെളിയിച്ച ഞങ്ങളുടെ മുൻ പഠനത്തിൽ നിന്ന് ചില തെളിവുകൾ ലഭിക്കുന്നു. കൂടാതെ, മനുഷ്യ ഹെപ്പാറ്റിക് സ്റ്റെലേറ്റ് സെൽ (LX-2) മോഡലിൽ സെൽ അഡീഷൻ, സെൽ മൈഗ്രേഷൻ, ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെൽ ആക്ടിവേഷൻ എന്നിവയുടെ ക്ലാസിക്കൽ മാർക്കറുകളായ ജീനുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ കുറയ്ക്കാൻ IPA ചികിത്സയ്ക്ക് കഴിയുമെന്നും ഇത് ഒരു സാധ്യതയുള്ള ഹെപ്പറ്റോപ്രൊട്ടക്റ്റീവ് മെറ്റാബോലൈറ്റാണെന്നും ഞങ്ങൾ കാണിച്ചു [15]. എന്നിരുന്നാലും, HSC അപ്പോപ്‌ടോസിസും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോഎനർജറ്റിക്‌സും സജീവമാക്കുന്നതിലൂടെ IPA എങ്ങനെ കരൾ ഫൈബ്രോസിസ് റിഗ്രഷൻ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് വ്യക്തമല്ല.
ഇവിടെ, പൊണ്ണത്തടിയുള്ളതും എന്നാൽ ടൈപ്പ് 2 പ്രമേഹം (KOBS) ഇല്ലാത്തവരുമായ വ്യക്തികളുടെ കരളിൽ അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, മൈറ്റോഫാഗി, ദീർഘായുസ്സ് പാതകൾ എന്നിവയാൽ സമ്പുഷ്ടമായ ജീനുകളുടെ പ്രകടനവുമായി സെറം IPA ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു. കൂടാതെ, നിഷ്‌ക്രിയത്വ പാതയിലൂടെ സജീവമാക്കിയ ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെല്ലുകളുടെ (HSCs) ക്ലിയറൻസും ഡീഗ്രഡേഷനും IPA പ്രേരിപ്പിക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. ഈ ഫലങ്ങൾ IPA യുടെ ഒരു പുതിയ പങ്ക് വെളിപ്പെടുത്തുന്നു, ഇത് കരൾ ഫൈബ്രോസിസ് റിഗ്രഷൻ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള ചികിത്സാ ലക്ഷ്യമാക്കി മാറ്റുന്നു.
KOBS കൂട്ടായ്മയിൽ നടത്തിയ ഒരു മുൻ പഠനത്തിൽ, കരൾ ഫൈബ്രോസിസ് ഉള്ള രോഗികൾക്ക് ലിവർ ഫൈബ്രോസിസ് ഇല്ലാത്ത രോഗികളെ അപേക്ഷിച്ച് രക്തചംക്രമണ IPA ലെവലുകൾ കുറവാണെന്ന് കണ്ടെത്തി [15]. ടൈപ്പ് 2 പ്രമേഹത്തിന്റെ സാധ്യതയുള്ള ആശയക്കുഴപ്പമുണ്ടാക്കുന്ന പ്രഭാവം ഒഴിവാക്കാൻ, നടന്നുകൊണ്ടിരിക്കുന്ന KOBS പഠനത്തിൽ നിന്ന് ടൈപ്പ് 2 പ്രമേഹമില്ലാത്ത 116 പൊണ്ണത്തടിയുള്ള രോഗികളെ (ശരാശരി പ്രായം ± SD: 46.8 ± 9.3 വയസ്സ്; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (പട്ടിക 1) പഠന ജനസംഖ്യയായി ഞങ്ങൾ നിയമിച്ചു [16]. എല്ലാ പങ്കാളികളും രേഖാമൂലമുള്ള സമ്മതം നൽകി, ഹെൽസിങ്കിയുടെ പ്രഖ്യാപനം (54/2005, 104/2008, 27/2010) അനുസരിച്ച് നോർത്ത് സാവോ കൗണ്ടി ആശുപത്രിയിലെ എത്തിക്സ് കമ്മിറ്റി പഠന പ്രോട്ടോക്കോൾ അംഗീകരിച്ചു.
ബാരിയാട്രിക് ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്കിടെ കരൾ ബയോപ്സി സാമ്പിളുകൾ ലഭിച്ചു, മുമ്പ് വിവരിച്ച മാനദണ്ഡങ്ങൾക്കനുസൃതമായി പരിചയസമ്പന്നരായ പാത്തോളജിസ്റ്റുകൾ ഹിസ്റ്റോളജിക്കലായി വിലയിരുത്തി [17, 18]. വിലയിരുത്തൽ മാനദണ്ഡങ്ങൾ സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക S1-ൽ സംഗ്രഹിച്ചിരിക്കുന്നു, മുമ്പ് വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട് [19].
മെറ്റബോളോമിക്സ് വിശകലനത്തിനായി (n = 116) ലക്ഷ്യമില്ലാത്ത ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി-മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (LC-MS) ഉപയോഗിച്ച് ഫാസ്റ്റിംഗ് സെറം സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ഒരു UHPLC-qTOF-MS സിസ്റ്റം (1290 LC, 6540 qTOF-MS, അജിലന്റ് ടെക്നോളജീസ്, വാൾഡ്ബ്രോൺ, കാൾസ്രൂഹെ, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ചാണ് സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്തത്. ഐസോപ്രോപൈൽ ആൽക്കഹോൾ (IPA) തിരിച്ചറിയൽ നിലനിർത്തൽ സമയത്തെയും MS/MS സ്പെക്ട്രത്തെ ശുദ്ധമായ മാനദണ്ഡങ്ങളുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുന്നതിനെയും അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്. തുടർന്നുള്ള എല്ലാ വിശകലനങ്ങളിലും IPA സിഗ്നൽ തീവ്രത (പീക്ക് ഏരിയ) പരിഗണിച്ചു [20].
ഇല്ലുമിന ഹൈസെക് 2500 ഉപയോഗിച്ച് മുഴുവൻ കരൾ ആർ‌എൻ‌എ സീക്വൻസിംഗ് നടത്തി, മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ഡാറ്റ പ്രീപ്രോസസ് ചെയ്തു [19, 21, 22]. മിറ്റോമൈനർ 4.0 ഡാറ്റാബേസിൽ നിന്ന് തിരഞ്ഞെടുത്ത 1957 ജീനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫംഗ്ഷനെ/ബയോജെനിസിസിനെ ബാധിക്കുന്ന ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ ടാർഗെറ്റഡ് ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം ഞങ്ങൾ നടത്തി [23]. മുമ്പ് വിവരിച്ച അതേ രീതിശാസ്ത്രം ഉപയോഗിച്ച് ഇൻഫിനിയം ഹ്യൂമൻ മെത്തിലേഷൻ 450 ബീഡ്‌ചിപ്പ് (ഇല്ലുമിന, സാൻ ഡീഗോ, സി‌എ, യുഎസ്‌എ) ഉപയോഗിച്ച് ലിവർ ഡി‌എൻ‌എ മെത്തിലേഷൻ വിശകലനം നടത്തി [24, 25].
പ്രൊഫ. സ്റ്റെഫാനോ റോമിയോ ദയയോടെ നൽകിയ മനുഷ്യ കരൾ സ്റ്റെല്ലേറ്റ് കോശങ്ങൾ (LX-2) DMEM/F12 മീഡിയത്തിൽ (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) സംസ്കരിച്ച് പരിപാലിച്ചു. IPA യുടെ പ്രവർത്തന അളവ് തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന്, DMEM/F12 മീഡിയത്തിൽ 24 മണിക്കൂർ വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകളിലുള്ള IPA (10 μM, 100 μM, 1 mM; Sigma, 220027) ഉപയോഗിച്ച് LX-2 കോശങ്ങളെ ചികിത്സിച്ചു. കൂടാതെ, HSC-കളെ നിർജ്ജീവമാക്കാനുള്ള IPA യുടെ കഴിവ് അന്വേഷിക്കുന്നതിന്, LX-2 കോശങ്ങളെ 5 ng/ml TGF-β1 (R&D സിസ്റ്റങ്ങൾ, 240-B-002/CF) ഉം സെറം-ഫ്രീ മീഡിയത്തിൽ 1 mM IPA ഉം ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂർ സഹ-ചികിത്സിച്ചു. അനുബന്ധ വാഹന നിയന്ത്രണങ്ങൾക്കായി, TGF-β1 ചികിത്സയ്ക്കായി 0.1% BSA അടങ്ങിയ 4 nM HCL ഉം IPA ചികിത്സയ്ക്കായി 0.05% DMSO ഉം ഉപയോഗിച്ചു, രണ്ടും സംയോജിത ചികിത്സയ്ക്കായി ഒരുമിച്ച് ഉപയോഗിച്ചു.
നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് 7-AAD (ബയോളജെൻഡ്, സാൻ ഡീഗോ, CA, USA, Cat# 640922) ഉള്ള FITC അനെക്സിൻ V അപ്പോപ്റ്റോസിസ് ഡിറ്റക്ഷൻ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് അപ്പോപ്‌ടോസിസ് വിലയിരുത്തിയത്. ചുരുക്കത്തിൽ, LX-2 (1 × 105 കോശങ്ങൾ/കിണർ) 12-കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് കൾച്ചർ ചെയ്തു, തുടർന്ന് ഒന്നിലധികം ഡോസുകൾ IPA അല്ലെങ്കിൽ IPA, TGF-β1 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു. അടുത്ത ദിവസം, ഫ്ലോട്ടിംഗ്, അഡെറന്റ് കോശങ്ങൾ ശേഖരിച്ച്, ട്രിപ്സിനൈസ് ചെയ്ത്, PBS ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, അനെക്സിൻ V ബൈൻഡിംഗ് ബഫറിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു, FITC-അനെക്സിൻ V, 7-AAD എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 15 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.
ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് പ്രവർത്തനത്തിനായി ജീവനുള്ള കോശങ്ങളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയെ മൈറ്റോട്രാക്കർ™ റെഡ് സി‌എം‌എക്സ്‌റോസ് (എം‌ടി‌ആർ) (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, കാൾസ്ബാഡ്, സി‌എ) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്‌തു. എം‌ടി‌ആർ പരിശോധനകൾക്കായി, എൽ‌എക്സ്-2 കോശങ്ങളെ ഐ‌പി‌എ, ടി‌ജി‌എഫ്-β1 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് തുല്യ സാന്ദ്രതയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. 24 മണിക്കൂറിനു ശേഷം, ജീവനുള്ള കോശങ്ങളെ ട്രിപ്‌സിനൈസ് ചെയ്ത്, പി‌ബി‌എസ് ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, തുടർന്ന് മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ 20 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 37 °C ൽ സെറം-ഫ്രീ മീഡിയത്തിൽ 100 ​​μM MTR ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു [26]. ലൈവ് സെൽ മോർഫോളജി വിശകലനത്തിനായി, യഥാക്രമം ഫോർവേഡ് സ്‌കാറ്റർ (എഫ്‌എസ്‌സി), സൈഡ് സ്‌കാറ്റർ (എസ്‌എസ്‌സി) പാരാമീറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സെൽ വലുപ്പവും സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് സങ്കീർണ്ണതയും വിശകലനം ചെയ്തു.
എല്ലാ ഡാറ്റയും (30,000 ഇവന്റുകൾ) നോവോസൈറ്റ് ക്വാണ്ടിയോൺ (അജിലന്റ്) ഉപയോഗിച്ച് നേടിയെടുക്കുകയും നോവോഎക്സ്പ്രസ്® 1.4.1 അല്ലെങ്കിൽ ഫ്ലോജോ വി.10 സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് സീഹോഴ്‌സ് എക്‌സ്‌എഫ് സെൽ മിറ്റോ സ്ട്രെസ് ഘടിപ്പിച്ച സീഹോഴ്‌സ് എക്‌സ്‌ട്രാസെല്ലുലാർ ഫ്ലക്‌സ് അനലൈസർ (എജിലന്റ് ടെക്‌നോളജീസ്, സാന്താ ക്ലാര, സിഎ) ഉപയോഗിച്ച് ഓക്‌സിജൻ ഉപഭോഗ നിരക്കും (ഒസിആർ) എക്‌സ്‌ട്രാസെല്ലുലാർ അസിഡിഫിക്കേഷൻ നിരക്കും (ഇസിഎആർ) തത്സമയം അളന്നു. ചുരുക്കത്തിൽ, 2 × 104 എൽഎക്‌സ്-2 സെല്ലുകൾ/കിണർ XF96 സെൽ കൾച്ചർ പ്ലേറ്റുകളിലേക്ക് വിത്ത് വിതച്ചു. രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത ശേഷം, കോശങ്ങളെ ഐസോപ്രോപനോൾ (ഐപിഎ), ടിജിഎഫ്-β1 (സപ്ലിമെന്ററി രീതികൾ 1) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു. സീഹോഴ്‌സ് എക്‌സ്‌എഫ് സെൽ എനർജി ഫിനോടൈപ്പ് ടെസ്റ്റ് റിപ്പോർട്ട് ജനറേറ്റർ ഉൾപ്പെടുന്ന സീഹോഴ്‌സ് എക്‌സ്‌എഫ് വേവ് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡാറ്റ വിശകലനം നടത്തിയത്. ഇതിൽ നിന്ന്, ഒരു ബയോഎനർജറ്റിക് ഹെൽത്ത് ഇൻഡക്സ് (ബിഎച്ച്ഐ) കണക്കാക്കി [27].
മൊത്തം RNA cDNA-യിലേക്ക് ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്തു. നിർദ്ദിഷ്ട രീതികൾക്ക്, റഫറൻസ് [15] കാണുക. ഹ്യൂമൻ 60S റൈബോസോമൽ അസിഡിക് പ്രോട്ടീൻ P0 (RPLP0), സൈക്ലോഫിലിൻ A1 (PPIA) mRNA ലെവലുകൾ കോൺസ്റ്റിറ്റീവ് ജീൻ നിയന്ത്രണങ്ങളായി ഉപയോഗിച്ചു. ക്വാണ്ട്സ്റ്റുഡിയോ 6 പ്രോ റിയൽ-ടൈം PCR സിസ്റ്റം (തെർമോ ഫിഷർ, ലാൻഡ്‌സ്മീർ, നെതർലാൻഡ്‌സ്) TaqMan™ ഫാസ്റ്റ് അഡ്വാൻസ്ഡ് മാസ്റ്റർ മിക്സ് കിറ്റ് (അപ്ലൈഡ് ബയോസിസ്റ്റംസ്) അല്ലെങ്കിൽ സെൻസിഫാസ്റ്റ് SYBR ലോ-റോക്സ് കിറ്റ് (ബയോലിൻ, BIO 94050) എന്നിവയ്‌ക്കൊപ്പം ഉപയോഗിച്ചു, താരതമ്യ Ct മൂല്യ സൈക്ലിംഗ് പാരാമീറ്ററുകളും (ΔΔCt) ∆∆Ct രീതിയും ഉപയോഗിച്ച് ആപേക്ഷിക ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ഫോൾഡ് കണക്കാക്കി. പ്രൈമറുകളുടെ വിശദാംശങ്ങൾ സപ്ലിമെന്ററി പട്ടികകൾ S2, S3 എന്നിവയിൽ നൽകിയിരിക്കുന്നു.
മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ [28] DNeasy ബ്ലഡ് ആൻഡ് ടിഷ്യു കിറ്റ് (Qiagen) ഉപയോഗിച്ച് ന്യൂക്ലിയർ DNA (ncDNA), മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ DNA (mtDNA) എന്നിവ വേർതിരിച്ചെടുത്തു. സപ്ലിമെന്ററി രീതികൾ 2-ൽ വിശദമാക്കിയിരിക്കുന്നതുപോലെ, ഓരോ ടാർഗെറ്റ് mtDNA മേഖലയുടെയും മൂന്ന് ന്യൂക്ലിയർ DNA മേഖലകളുടെ (mtDNA/ncDNA) ജ്യാമിതീയ ശരാശരിയിലേക്കുള്ള അനുപാതം കണക്കാക്കിയാണ് mtDNA യുടെ ആപേക്ഷിക അളവ് കണക്കാക്കിയത്. mtDNA, ncDNA എന്നിവയ്ക്കുള്ള പ്രൈമറുകളുടെ വിശദാംശങ്ങൾ സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക S4-ൽ നൽകിയിരിക്കുന്നു.
ഇന്റർസെല്ലുലാർ, ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിനായി, ലൈവ് സെല്ലുകളെ Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. LX-2 സെല്ലുകൾ (1 × 104 സെല്ലുകൾ/കിണർ) ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡുകളിൽ അനുബന്ധ ഗ്ലാസ്-ബോട്ടംഡ് കൾച്ചർ പ്ലേറ്റുകളിൽ (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany) കൾച്ചർ ചെയ്തു. 24 മണിക്കൂറിനു ശേഷം, ലൈവ് LX-2 സെല്ലുകളെ 37 °C താപനിലയിൽ 20 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 100 μM MTR ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ സെൽ ന്യൂക്ലിയസുകളെ DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു [29]. 63×NA 1.3 ഒബ്ജക്റ്റീവ് ഉപയോഗിച്ച് 5% CO2 ഉപയോഗിച്ച് ഈർപ്പമുള്ള അന്തരീക്ഷത്തിൽ 37 °C താപനിലയിൽ Zeiss LSM 800 കൺഫോക്കൽ മൊഡ്യൂൾ ഘടിപ്പിച്ച Zeiss Axio Observer ഇൻവെർട്ടഡ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) ഉപയോഗിച്ച് മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു. ഓരോ സാമ്പിൾ തരത്തിനും പത്ത് Z-സീരീസ് ചിത്രങ്ങൾ ഞങ്ങൾ നേടി. ഓരോ Z-സീരീസിലും 30 വിഭാഗങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഓരോന്നിനും 9.86 μm കനം ഉണ്ട്. ഓരോ സാമ്പിളിനും, ZEN 2009 സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (കാൾ സീസ് മൈക്രോഇമേജിംഗ് GmbH, ജെന, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ച് പത്ത് വ്യത്യസ്ത വ്യൂ ഫീൽഡുകളുടെ ചിത്രങ്ങൾ നേടി, കൂടാതെ സപ്ലിമെന്ററി രീതികൾ 3-ൽ വിശദമാക്കിയിരിക്കുന്ന പാരാമീറ്ററുകൾ അനുസരിച്ച് ഇമേജ്ജെ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (v1.54d) [30, 31] ഉപയോഗിച്ച് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജി വിശകലനം നടത്തി.
കോശങ്ങൾ 0.1 M ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫറിൽ 2% ഗ്ലൂട്ടറാൾഡിഹൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് ഉറപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് 1% ഓസ്മിയം ടെട്രോക്സൈഡ് ലായനി (സിഗ്മ ആൽഡ്രിച്ച്, MO, USA) ഉപയോഗിച്ച് ഉറപ്പിച്ചു, ക്രമേണ അസെറ്റോൺ (മെർക്ക്, ഡാർംസ്റ്റാഡ്, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ച് നിർജ്ജലീകരണം ചെയ്തു, ഒടുവിൽ എപ്പോക്സി റെസിനിൽ ഉൾപ്പെടുത്തി. അൾട്രാനേർത്ത ഭാഗങ്ങൾ തയ്യാറാക്കി 1% യുറാനൈൽ അസറ്റേറ്റ് (മെർക്ക്, ഡാർംസ്റ്റാഡ്, ജർമ്മനി) 1% ലെഡ് സിട്രേറ്റ് (മെർക്ക്, ഡാർംസ്റ്റാഡ്, ജർമ്മനി) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. 80 kV ത്വരിതപ്പെടുത്തുന്ന വോൾട്ടേജിൽ ഒരു JEM 2100F EXII ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പ് (JEOL ലിമിറ്റഡ്, ടോക്കിയോ, ജപ്പാൻ) ഉപയോഗിച്ച് അൾട്രാസ്ട്രക്ചറൽ ചിത്രങ്ങൾ ലഭിച്ചു.
സീസ് ഇൻവേർട്ടഡ് ലൈറ്റ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് (സീസ് ആക്സിയോ വെർട്ട്.എ1, ആക്സിയോകാം എംആർഎം, ജെന, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ച് 50x മാഗ്നിഫിക്കേഷനിൽ ഫേസ്-കോൺട്രാസ്റ്റ് മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂർ ഐപിഎ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച എൽഎക്സ്-2 കോശങ്ങളുടെ രൂപഘടന വിശകലനം ചെയ്തു.
ക്ലിനിക്കൽ ഡാറ്റ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ മീഡിയൻ (ഇന്റർക്വാർട്ടൈൽ ശ്രേണി: IQR) ആയി പ്രകടിപ്പിച്ചു. മൂന്ന് പഠന ഗ്രൂപ്പുകൾ തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസങ്ങൾ താരതമ്യം ചെയ്യാൻ വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനം (തുടർച്ചയായ വേരിയബിളുകൾ) അല്ലെങ്കിൽ χ² ടെസ്റ്റ് (വർഗ്ഗീകരണ വേരിയബിളുകൾ) ഉപയോഗിച്ചു. ഒന്നിലധികം പരിശോധനകൾക്കായി തിരുത്താൻ തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് നിരക്ക് (FDR) ഉപയോഗിച്ചു, കൂടാതെ FDR < 0.05 ഉള്ള ജീനുകളെ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ പ്രാധാന്യമുള്ളതായി കണക്കാക്കി. സിപിജി ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷനെ ഐപിഎ സിഗ്നൽ തീവ്രതയുമായി പരസ്പരബന്ധിതമാക്കാൻ സ്പിയർമാൻ പരസ്പരബന്ധ വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചു, നാമമാത്രമായ പി മൂല്യങ്ങൾ (പി < 0.05) റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു.
വെബ് അധിഷ്ഠിത ജീൻ സെറ്റ് വിശകലന ഉപകരണം (WebGestalt) ഉപയോഗിച്ച് പാത്ത്‌വേ വിശകലനം നടത്തി, 268 ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്റ്റുകൾ (നാമമാത്രമായ p < 0.01), 119 മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്റ്റുകൾ (നാമമാത്രമായ p < 0.05), 3093 ലിവർ ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്റ്റുകളിൽ 4350 CpG-കൾ എന്നിവ രക്തചംക്രമണ സെറം IPA ലെവലുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. ഓവർലാപ്പിംഗ് ജീനുകൾ കണ്ടെത്താൻ സൗജന്യമായി ലഭ്യമായ വെന്നി DB (പതിപ്പ് 2.1.0) ടൂളും, പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാൻ StringDB (പതിപ്പ് 11.5) ഉം ഉപയോഗിച്ചു.
LX-2 പരീക്ഷണത്തിനായി, ഡി'അഗോസ്റ്റിനോ-പിയേഴ്‌സൺ ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിളുകൾ സാധാരണ നിലയ്ക്കായി പരിശോധിച്ചു. കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് ബയോളജിക്കൽ റെപ്ലിക്കേറ്റുകളിൽ നിന്നെങ്കിലും ഡാറ്റ ലഭിച്ചു, ബോൺഫെറോണി പോസ്റ്റ് ഹോക്ക് ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് വൺ-വേ ANOVA-യ്ക്ക് വിധേയമാക്കി. 0.05-ൽ താഴെയുള്ള p-മൂല്യം സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ പ്രാധാന്യമുള്ളതായി കണക്കാക്കി. ഡാറ്റ ശരാശരി ± SD ആയി അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ പരീക്ഷണങ്ങളുടെ എണ്ണം ഓരോ ചിത്രത്തിലും സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. എല്ലാ വിശകലനങ്ങളും ഗ്രാഫുകളും വിൻഡോസിനായുള്ള ഗ്രാഫ്പാഡ് പ്രിസം 8 സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ചാണ് നടത്തിയത് (ഗ്രാഫ്പാഡ് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഇൻ‌കോർപ്പറേറ്റഡ്, പതിപ്പ് 8.4.3, സാൻ ഡീഗോ, യുഎസ്എ).
ആദ്യം, സെറം ഐപിഎ ലെവലുകളും കരൾ, ശരീരം മുഴുവനും, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളും തമ്മിലുള്ള ബന്ധം ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. മൊത്തം ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് പ്രൊഫൈലിൽ, സെറം ഐപിഎ ലെവലുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഏറ്റവും ശക്തമായ ജീൻ MAPKAPK3 ആയിരുന്നു (FDR = 0.0077; മൈറ്റോജെൻ-ആക്ടിവേറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ കൈനേസ്-ആക്ടിവേറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ കൈനേസ് 3); മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് പ്രൊഫൈലിൽ, ഏറ്റവും ശക്തമായ അനുബന്ധ ജീൻ AKT1 ആയിരുന്നു (FDR = 0.7621; AKT സെറിൻ/ത്രിയോണിൻ കൈനേസ് 1) (അധിക ഫയൽ 1 ഉം അധിക ഫയൽ 2 ഉം).
തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ ആഗോള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളും (n = 268; p < 0.01) മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളും (n = 119; p < 0.05) വിശകലനം ചെയ്തു, ഒടുവിൽ അപ്പോപ്‌ടോസിസിനെ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട കാനോനിക്കൽ പാതയായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു (p = 0.0089). സെറം IPA ലെവലുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾക്ക്, അപ്പോപ്‌ടോസിസ് (FDR = 0.00001), മൈറ്റോഫാഗി (FDR = 0.00029), TNF സിഗ്നലിംഗ് പാതകൾ (FDR = 0.000006) എന്നിവയിൽ ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു (ചിത്രം 1A, പട്ടിക 2, അനുബന്ധ ചിത്രങ്ങൾ 1A-B).
സെറം ഐപിഎ ലെവലുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട് മനുഷ്യ കരളിലെ ആഗോള, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ-അനുബന്ധ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെയും ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷന്റെയും ഓവർലാപ്പിംഗ് വിശകലനം. എ 268 ആഗോള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ, 119 മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ-അനുബന്ധ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ, സീറം ഐപിഎ ലെവലുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട 3092 സിപിജി സൈറ്റുകളിലേക്ക് മാപ്പ് ചെയ്ത ഡിഎൻഎ മെത്തിലേറ്റഡ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ എന്നിവയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (ആഗോള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾക്കും ഡിഎൻഎ മെത്തിലേറ്റഡ്ക്കും പി മൂല്യങ്ങൾ <0.01, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾക്ക് പി മൂല്യങ്ങൾ <0.05). പ്രധാന ഓവർലാപ്പിംഗ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ മധ്യത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (എകെടി 1, വൈകെടി 6). ബി മറ്റ് ജീനുകളുമായി ഏറ്റവും ഉയർന്ന ഇന്ററാക്ഷൻ സ്കോർ (0.900) ഉള്ള 13 ജീനുകളുടെ ഇന്ററാക്ഷൻ മാപ്പ്, സെറം ഐപിഎ ലെവലുകളുമായി ഗണ്യമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരുന്ന 56 ഓവർലാപ്പിംഗ് ജീനുകളിൽ (ബ്ലാക്ക് ലൈൻ മേഖല) നിന്നാണ് നിർമ്മിച്ചത്, സ്ട്രിംഗ്ഡിബി എന്ന ഓൺലൈൻ ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ച്. പച്ച: ജീൻ ഒന്റോളജി (ജിഒ) സെല്ലുലാർ ഘടകത്തിലേക്ക് മാപ്പ് ചെയ്ത ജീനുകൾ: മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ (ജിഒ: 0005739). ഡാറ്റയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി (ടെക്സ്റ്റ് മൈനിംഗ്, പരീക്ഷണങ്ങൾ, ഡാറ്റാബേസുകൾ, കോ-എക്സ്പ്രഷൻ എന്നിവയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി) മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുമായുള്ള ഇടപെടലുകൾക്ക് ഏറ്റവും ഉയർന്ന സ്കോർ (0.900) ഉള്ള പ്രോട്ടീൻ AKT1 ആണ്. നെറ്റ്‌വർക്ക് നോഡുകൾ പ്രോട്ടീനുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, അരികുകൾ പ്രോട്ടീനുകൾ തമ്മിലുള്ള ബന്ധങ്ങളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷൻ വഴി ഗട്ട് മൈക്രോബയോട്ട മെറ്റബോളിറ്റുകൾക്ക് എപ്പിജെനെറ്റിക് കോമ്പോസിഷൻ നിയന്ത്രിക്കാൻ കഴിയുമെന്നതിനാൽ [32], സെറം ഐപിഎ ലെവലുകൾ ലിവർ ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. സെറം ഐപിഎ ലെവലുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട രണ്ട് പ്രധാന മെത്തിലേഷൻ സൈറ്റുകൾ പ്രോലൈൻ-സെറിൻ സമ്പുഷ്ടമായ മേഖല 3 (C19orf55), ഹീറ്റ് ഷോക്ക് പ്രോട്ടീൻ ഫാമിലി ബി (ചെറിയ) അംഗം 6 (HSPB6) എന്നിവയ്ക്ക് സമീപമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (അധിക ഫയൽ 3). 4350 CpG (p < 0.01) ന്റെ ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷൻ സെറം ഐപിഎ ലെവലുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ദീർഘായുസ്സ് നിയന്ത്രണ പാതകളാൽ സമ്പുഷ്ടമായിരുന്നു (p = 0.006) (ചിത്രം 1A, പട്ടിക 2, അനുബന്ധ ചിത്രം 1C).
മനുഷ്യ കരളിലെ സെറം ഐപിഎ ലെവലുകൾ, ആഗോള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ, ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷൻ എന്നിവ തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തിന് അടിസ്ഥാനമായ ജൈവ സംവിധാനങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കാൻ, മുൻ പാത്ത്‌വേ വിശകലനത്തിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ ജീനുകളുടെ ഒരു ഓവർലാപ്പ് വിശകലനം ഞങ്ങൾ നടത്തി (ചിത്രം 1A). 56 ഓവർലാപ്പിംഗ് ജീനുകളുടെ (ചിത്രം 1A ലെ കറുത്ത വരയ്ക്കുള്ളിൽ) പാത്ത്‌വേ സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനത്തിന്റെ ഫലങ്ങൾ, വെൻ ഡയഗ്രാമിൽ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2 ഉം ചിത്രം 1A ഉം) കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, അപ്പോപ്‌ടോസിസ് പാത്ത്‌വേ (p = 0.00029) മൂന്ന് വിശകലനങ്ങൾക്ക് പൊതുവായുള്ള രണ്ട് ജീനുകളെ എടുത്തുകാണിച്ചുവെന്ന് കാണിച്ചു: AKT1, YKT6 (YKT6 v-SNARE ഹോമോലോഗ്). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, AKT1 (cg19831386), YKT6 (cg24161647) എന്നിവ സെറം IPA ലെവലുകളുമായി പോസിറ്റീവ് ആയി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (അധിക ഫയൽ 3). ജീൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ തമ്മിലുള്ള സാധ്യതയുള്ള പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ, ഇൻപുട്ടായി 56 ഓവർലാപ്പിംഗ് ജീനുകളിൽ നിന്ന് ഏറ്റവും ഉയർന്ന പൊതു മേഖല സ്കോർ (0.900) ഉള്ള 13 ജീനുകളെ ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്ത് ഒരു ഇന്ററാക്ഷൻ മാപ്പ് നിർമ്മിച്ചു. കോൺഫിഡൻസ് ലെവൽ (മാർജിനൽ കോൺഫിഡൻസ്) അനുസരിച്ച്, ഏറ്റവും ഉയർന്ന സ്കോർ (0.900) ഉള്ള AKT1 ജീൻ മുകളിലായിരുന്നു (ചിത്രം 1B).
പാത്ത്‌വേ വിശകലനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, അപ്പോപ്‌ടോസിസ് പ്രധാന പാതയാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, അതിനാൽ ഐപിഎ ചികിത്സ ഇൻ വിട്രോയിൽ എച്ച്‌എസ്‌സികളുടെ അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെ ബാധിക്കുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. വ്യത്യസ്ത ഡോസുകൾ (10 μM, 100 μM, 1 mM) LX-2 സെല്ലുകൾക്ക് വിഷരഹിതമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ മുമ്പ് തെളിയിച്ചു [15]. 10 μM, 100 μM എന്നിവയിലെ IPA ചികിത്സ പ്രായോഗികവും നെക്രോറ്റിക് കോശങ്ങളുടെ എണ്ണവും വർദ്ധിപ്പിച്ചതായി ഈ പഠനം കാണിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, 1 mM IPA സാന്ദ്രതയിൽ സെൽ എബിലിറ്റി കുറഞ്ഞു, അതേസമയം സെൽ നെക്രോസിസ് നിരക്ക് മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു (ചിത്രം 2A, B). അടുത്തതായി, LX-2 കോശങ്ങളിൽ അപ്പോപ്‌ടോസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഒപ്റ്റിമൽ സാന്ദ്രത കണ്ടെത്താൻ, 24 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ 10 μM, 100 μM, 1 mM IPA എന്നിവ ഞങ്ങൾ പരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 2A-E, അനുബന്ധ ചിത്രം 3A-B). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, IPA 10 μM ഉം 100 μM ഉം അപ്പോപ്‌ടോസിസ് നിരക്ക് (%) കുറച്ചു, എന്നിരുന്നാലും, നിയന്ത്രണവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ IPA 1 mM വൈകിയുള്ള അപ്പോപ്‌ടോസിസ് നിരക്കും അപ്പോപ്‌ടോസിസ് നിരക്കും (%) വർദ്ധിപ്പിച്ചു, അതിനാൽ കൂടുതൽ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി തിരഞ്ഞെടുത്തു (ചിത്രങ്ങൾ 2A–D).
LX-2 കോശങ്ങളുടെ അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെ IPA പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു. ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി വഴി അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് നിരക്കും സെൽ മോർഫോളജിയും അളക്കാൻ അനെക്‌സിൻ V, 7-AAD ഇരട്ട സ്റ്റെയിനിംഗ് രീതി ഉപയോഗിച്ചു. BA കോശങ്ങളെ 24 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ 10 μM, 100 μM, 1 mM IPA എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് അല്ലെങ്കിൽ സെറം-ഫ്രീ മീഡിയത്തിൽ F–H TGF-β1 (5 ng/ml), 1 mM IPA എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. A: ജീവനുള്ള കോശങ്ങൾ (Anexin V -/ 7AAD-); B: necrotic കോശങ്ങൾ (Anexin V -/ 7AAD+); C, F: നേരത്തെ (Anexin V +/ 7AAD-); D, G: വൈകി (Anexin V+/7AAD.+); E, H: അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് നിരക്കിലെ ആകെ ആദ്യകാല, വൈകി അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് കോശങ്ങളുടെ ശതമാനം (%). ഡാറ്റ ശരാശരി ± SD ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, n = 3 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങൾ. ബോൺഫെറോണി പോസ്റ്റ് ഹോക്ക് ടെസ്റ്റുമായി വൺ-വേ ANOVA ഉപയോഗിച്ച് സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് താരതമ്യങ്ങൾ നടത്തി. *പി < 0.05; ****പി < 0.0001
മുമ്പ് നമ്മൾ കാണിച്ചതുപോലെ, 5 ng/ml TGF-β1 ന് ക്ലാസിക്കൽ മാർക്കർ ജീനുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ വർദ്ധിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് HSC സജീവമാക്കാൻ കഴിയും [15]. LX-2 കോശങ്ങളെ 5 ng/ml TGF-β1 ഉം 1 mM IPA ഉം സംയോജിപ്പിച്ച് ചികിത്സിച്ചു (ചിത്രം 2E–H). TGF-β1 ചികിത്സ അപ്പോപ്‌ടോസിസ് നിരക്ക് മാറ്റിയില്ല, എന്നിരുന്നാലും, TGF-β1 ചികിത്സയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ IPA കോ-ട്രീറ്റ്‌മെന്റ് വൈകിയുള്ള അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, അപ്പോപ്‌ടോസിസ് നിരക്ക് (%) വർദ്ധിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 2E–H). TGF-β1 ഇൻഡക്ഷനിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായി LX-2 കോശങ്ങളിൽ 1 mM IPA ന് അപ്പോപ്റ്റോസിസ് പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
LX-2 കോശങ്ങളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസനത്തിൽ IPA യുടെ സ്വാധീനത്തെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങൾ കൂടുതൽ അന്വേഷിച്ചു. 1 mM IPA ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗ നിരക്ക് (OCR) പാരാമീറ്ററുകൾ കുറച്ചതായി ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു: നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ നോൺ-മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസനം, ബേസൽ, മാക്സിമൽ ശ്വസനം, പ്രോട്ടോൺ ചോർച്ച, ATP ഉത്പാദനം (ചിത്രം 3A, B), അതേസമയം ബയോഎനർജറ്റിക് ഹെൽത്ത് ഇൻഡെക്സ് (BHI) മാറിയില്ല.
LX-2 കോശങ്ങളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസനം IPA കുറയ്ക്കുന്നു. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസന വക്രം (OCR) മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസന പാരാമീറ്ററുകളായി (നോൺ-മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസനം, ബേസൽ ശ്വസനം, പരമാവധി ശ്വസനം, പ്രോട്ടോൺ ചോർച്ച, ATP ജനറേഷൻ, SRC, BHI) അവതരിപ്പിക്കുന്നു. A, B കോശങ്ങൾ യഥാക്രമം 10 μM, 100 μM, 1 mM IPA എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. C, D കോശങ്ങൾ യഥാക്രമം TGF-β1 (5 ng/ml), 1 mM IPA എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സെറം-ഫ്രീ മീഡിയത്തിൽ 24 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. CyQuant കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് എല്ലാ അളവുകളും DNA ഉള്ളടക്കത്തിലേക്ക് നോർമലൈസ് ചെയ്തു. BHI: ബയോഎനർജറ്റിക് ഹെൽത്ത് ഇൻഡെക്സ്; SRC: ശ്വസന കരുതൽ ശേഷി; OCR: ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗ നിരക്ക്. ഡാറ്റ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ (SD), n = 5 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളായി അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. വൺ-വേ ANOVA, ബോൺഫെറോണി പോസ്റ്റ് ഹോക്ക് ടെസ്റ്റ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ താരതമ്യങ്ങൾ നടത്തി. *p < 0.05; **p < 0.01; കൂടാതെ ***p < 0.001
TGF-β1-ആക്ടിവേറ്റഡ് LX-2 കോശങ്ങളുടെ ബയോഎനർജറ്റിക് പ്രൊഫൈലിൽ IPA യുടെ സ്വാധീനത്തെക്കുറിച്ച് കൂടുതൽ സമഗ്രമായ ധാരണ നേടുന്നതിന്, OCR ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ വിശകലനം ചെയ്തു (ചിത്രം 3C,D). നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ TGF-β1 ചികിത്സയ്ക്ക് പരമാവധി ശ്വസനം, ശ്വസന കരുതൽ ശേഷി (SRC), BHI എന്നിവ കുറയ്ക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു (ചിത്രം 3C,D). കൂടാതെ, കോമ്പിനേഷൻ ചികിത്സ അടിസ്ഥാന ശ്വസനം, പ്രോട്ടോൺ ചോർച്ച, ATP ഉത്പാദനം എന്നിവ കുറച്ചു, എന്നാൽ SRC, BHI എന്നിവ TGF-β1 (ചിത്രം 3C,D) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചതിനേക്കാൾ ഗണ്യമായി കൂടുതലായിരുന്നു (ചിത്രം 3C,D).
സീഹോഴ്‌സ് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ നൽകിയ "സെല്ലുലാർ എനർജി ഫിനോടൈപ്പ് ടെസ്റ്റ്" (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 4A–D) ഞങ്ങൾ നടത്തി. സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 3B-യിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, TGF-β1 ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം OCR, ECAR മെറ്റബോളിക് പൊട്ടൻഷ്യലുകൾ കുറഞ്ഞു, എന്നിരുന്നാലും, കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ കോമ്പിനേഷനിലും IPA ചികിത്സാ ഗ്രൂപ്പുകളിലും വ്യത്യാസമൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല. കൂടാതെ, കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ കോമ്പിനേഷനും IPA ചികിത്സയ്ക്കും ശേഷം OCR-ന്റെ ബേസൽ, സ്ട്രെസ് ലെവലുകൾ കുറഞ്ഞു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 4C). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, കോമ്പിനേഷൻ തെറാപ്പിയിലും സമാനമായ ഒരു പാറ്റേൺ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, അവിടെ TGF-β1 ചികിത്സയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ECAR-ന്റെ ബേസൽ, സ്ട്രെസ് ലെവലുകളിൽ മാറ്റമൊന്നും കണ്ടില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 4C). HSC-കളിൽ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് ഫോസ്ഫോറിലേഷനിലെ കുറവും TGF-β1 ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം SCR, BHI എന്നിവ പുനഃസ്ഥാപിക്കാനുള്ള കോമ്പിനേഷൻ ചികിത്സയുടെ കഴിവും മെറ്റബോളിക് പൊട്ടൻഷ്യലിനെ (OCR, ECAR) മാറ്റിയില്ല. ഒരുമിച്ച് നോക്കുമ്പോൾ, ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് IPA, HSC-കളിലെ ബയോഎനർജറ്റിക്സിനെ കുറച്ചേക്കാം എന്നാണ്, ഇത് IPA, HSC ഫിനോടൈപ്പിനെ നിഷ്ക്രിയത്വത്തിലേക്ക് മാറ്റുന്ന ഒരു താഴ്ന്ന ഊർജ്ജസ്വലമായ പ്രൊഫൈലിനെ പ്രേരിപ്പിച്ചേക്കാം എന്നാണ് (അനുബന്ധ ചിത്രം 4D).
മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിൽ IPA യുടെ സ്വാധീനം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജി, നെറ്റ്‌വർക്ക് കണക്ഷനുകൾ, MTR സ്റ്റെയിനിംഗ് എന്നിവയുടെ ത്രിമാന ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് അന്വേഷിച്ചു (ചിത്രം 4, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5). കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, TGF-β1 ചികിത്സ ശരാശരി ഉപരിതല വിസ്തീർണ്ണം, ശാഖാ നമ്പർ, മൊത്തം ശാഖാ നീളം, ശാഖാ ജംഗ്ഷൻ നമ്പർ (ചിത്രം 4A, B) എന്നിവ കുറയ്ക്കുകയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ അനുപാതം ഗോളാകൃതിയിൽ നിന്ന് ഇന്റർമീഡിയറ്റ് രൂപത്തിലേക്ക് മാറ്റുകയും ചെയ്തുവെന്ന് ചിത്രം 4 കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 4C). കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ IPA ചികിത്സ മാത്രമാണ് ശരാശരി മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വോളിയം കുറയ്ക്കുകയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ ഗോളാകൃതിയിൽ നിന്ന് ഇന്റർമീഡിയറ്റ് രൂപത്തിലേക്ക് മാറുകയും ചെയ്തത് (ചിത്രം 4A). ഇതിനു വിപരീതമായി, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെംബ്രൺ പൊട്ടൻഷ്യൽ-ആശ്രിത MTR (ചിത്രം 4A, E) വിലയിരുത്തിയ ഗോളാകൃതി, ശരാശരി ശാഖാ നീളം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം എന്നിവ മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു, ഈ പാരാമീറ്ററുകൾ ഗ്രൂപ്പുകൾക്കിടയിൽ വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരുന്നില്ല. ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, TGF-β1, IPA ചികിത്സ എന്നിവ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ആകൃതിയും വലുപ്പവും അതുപോലെ തന്നെ ജീവനുള്ള LX-2 കോശങ്ങളിലെ നെറ്റ്‌വർക്ക് സങ്കീർണ്ണതയും മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതായി ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
LX-2 സെല്ലുകളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സിനെയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡി‌എൻ‌എ സമൃദ്ധിയെയും IPA മാറ്റുന്നു. A. സെറം-ഫ്രീ മീഡിയത്തിൽ 24 മണിക്കൂർ TGF-β1 (5 ng/ml), 1 mM IPA എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത ലൈവ് LX-2 സെല്ലുകളുടെ പ്രതിനിധി കോൺഫോക്കൽ ചിത്രങ്ങൾ, മൈറ്റോട്രാക്കർ™ റെഡ് CMXRos ഉപയോഗിച്ച് കറപിടിച്ച മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്കുകളും DAPI ഉപയോഗിച്ച് നീല നിറത്തിലുള്ള ന്യൂക്ലിയസുകളും കാണിക്കുന്നു. എല്ലാ ഡാറ്റയിലും ഒരു ഗ്രൂപ്പിന് കുറഞ്ഞത് 15 ചിത്രങ്ങളെങ്കിലും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ഓരോ സാമ്പിൾ തരത്തിനും ഞങ്ങൾ 10 Z-സ്റ്റാക്ക് ചിത്രങ്ങൾ നേടി. ഓരോ Z-ആക്സിസ് സീക്വൻസിലും 9.86 μm കനം ഉള്ള 30 സ്ലൈസുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ: 10 μm. B. ഇമേജിൽ അഡാപ്റ്റീവ് ത്രെഷോൾഡിംഗ് പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട് തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രതിനിധി വസ്തുക്കൾ (മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ മാത്രം). ഓരോ ഗ്രൂപ്പിലെയും എല്ലാ സെല്ലുകൾക്കും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മോർഫോളജിക്കൽ നെറ്റ്‌വർക്ക് കണക്ഷനുകളുടെ അളവ് വിശകലനവും താരതമ്യവും നടത്തി. C. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ആകൃതി അനുപാതങ്ങളുടെ ആവൃത്തി. 0 ന് അടുത്തുള്ള മൂല്യങ്ങൾ ഗോളാകൃതികളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, 1 ന് അടുത്തുള്ള മൂല്യങ്ങൾ ഫിലമെന്റസ് ആകൃതികളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. D മെറ്റീരിയലുകളിലും രീതികളിലും വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ഡിഎൻഎ (mtDNA) ഉള്ളടക്കം നിർണ്ണയിച്ചു. മെറ്റീരിയലുകളിലും രീതികളിലും വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി (30,000 ഇവന്റുകൾ) ഉപയോഗിച്ചാണ് E മൈറ്റോട്രാക്കർ™ റെഡ് CMXRos വിശകലനം നടത്തിയത്. ഡാറ്റ ശരാശരി ± SD, n = 3 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളായി അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. വൺ-വേ ANOVA, ബോൺഫെറോണി പോസ്റ്റ് ഹോക്ക് ടെസ്റ്റ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ താരതമ്യങ്ങൾ നടത്തി. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ LX-2 സെല്ലുകളിലെ mtDNA ഉള്ളടക്കം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നമ്പറിന്റെ സൂചകമായി വിശകലനം ചെയ്തു. കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, TGF-β1- ചികിത്സിച്ച ഗ്രൂപ്പിൽ mtDNA ഉള്ളടക്കം വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 4D). TGF-β1- ചികിത്സിച്ച ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, കോമ്പിനേഷൻ ട്രീറ്റ്‌മെന്റ് ഗ്രൂപ്പിൽ mtDNA ഉള്ളടക്കം കുറഞ്ഞു (ചിത്രം 4D), IPA mtDNA ഉള്ളടക്കവും ഒരുപക്ഷേ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നമ്പറും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസനവും കുറച്ചേക്കാം എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 3C). മാത്രമല്ല, കോമ്പിനേഷൻ ചികിത്സയിൽ MtDNA ഉള്ളടക്കം IPA കുറയ്ക്കുന്നതായി തോന്നിയെങ്കിലും MTR- മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനത്തെ ബാധിച്ചില്ല (ചിത്രം 4A–C).
LX-2 കോശങ്ങളിലെ ഫൈബ്രോസിസ്, അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, അതിജീവനം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ് എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളുടെ mRNA ലെവലുകളുമായി IPA യുടെ ബന്ധം ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു (ചിത്രം 5A–D). കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, TGF-β1- ചികിത്സിച്ച ഗ്രൂപ്പ് കൊളാജൻ ടൈപ്പ് I α2 ചെയിൻ (COL1A2), α- സ്മൂത്ത് മസിൽ ആക്റ്റിൻ (αSMA), മാട്രിക്സ് മെറ്റലോപ്രോട്ടീനേസ് 2 (MMP2), മെറ്റലോപ്രോട്ടീനേസ് 1 ന്റെ ടിഷ്യു ഇൻഹിബിറ്റർ (TIMP1), ഡൈനാമിൻ 1-പോലുള്ള ജീൻ (DRP1) തുടങ്ങിയ ജീനുകളുടെ വർദ്ധിച്ച പ്രകടനത്തെ കാണിച്ചു, ഇത് വർദ്ധിച്ച ഫൈബ്രോസിസ്, ആക്റ്റിവേഷൻ എന്നിവയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. കൂടാതെ, കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, TGF-β1 ചികിത്സ ന്യൂക്ലിയർ പ്രെഗ്നെയ്ൻ X റിസപ്റ്റർ (PXR), കാസ്‌പേസ് 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-സെൽ α യുടെ ഇൻഹിബിറ്റർ, ന്യൂക്ലിയർ ഫാക്ടർ κ ജീൻ ലൈറ്റ് പെപ്റ്റൈഡ് (NFκB1A) യുടെ എൻഹാൻസറും ന്യൂക്ലിയർ ഫാക്ടർ κB കൈനേസ് സബ്യൂണിറ്റ് β (IKBKB) യുടെ ഇൻഹിബിറ്ററും (ചിത്രം 5A–D) എന്നിവയുടെ mRNA ലെവലുകൾ കുറച്ചു. TGF-β1 ചികിത്സയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, TGF-β1, IPA എന്നിവയുമായുള്ള സംയുക്ത ചികിത്സ COL1A2, MMP2 എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ കുറച്ചു, എന്നാൽ PXR, TIMP1, B-സെൽ ലിംഫോമ-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, IKBKB എന്നിവയുടെ mRNA ലെവലുകൾ വർദ്ധിപ്പിച്ചു. IPA ചികിത്സ MMP2, Bcl-2-അസോസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ X (BAX), AKT1, ഒപ്റ്റിക് അട്രോഫി പ്രോട്ടീൻ 1 (OPA1), മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീൻ 2 (MFN2) എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ ഗണ്യമായി കുറച്ചു, അതേസമയം CASP8, NFκB1A, NFκB1B, IKBKB എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ വർദ്ധിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, കാസ്പേസ്-3 (CASP3), അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് പെപ്‌റ്റിഡേസ് ആക്റ്റിവേറ്റിംഗ് ഫാക്ടർ 1 (APAF1), മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീൻ 1 (MFN1), ഫിഷൻ പ്രോട്ടീൻ 1 (FIS1) എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷനിൽ വ്യത്യാസമൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല. മൊത്തത്തിൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ഐപിഎ ചികിത്സ ഫൈബ്രോസിസ്, അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, അതിജീവനം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ് എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളുടെ പ്രകടനത്തെ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുമെന്നാണ്. ഐപിഎ ചികിത്സ എൽഎക്സ്-2 കോശങ്ങളിലെ ഫൈബ്രോസിസ് കുറയ്ക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു; അതേസമയം, ഫിനോടൈപ്പിനെ നിഷ്‌ക്രിയത്വത്തിലേക്ക് മാറ്റുന്നതിലൂടെ അത് അതിജീവനത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു.
LX-2 കോശങ്ങളിലെ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ്, അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക്, വയബിലിറ്റി, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ് ജീനുകൾ എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ IPA മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നു. സെറം-ഫ്രീ മീഡിയത്തിൽ 24 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് TGF-β1, IPA എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് LX-2 സെല്ലുകളെ പ്രേരിപ്പിച്ചതിന് ശേഷം എൻഡോജെനസ് കൺട്രോളുമായി (RPLP0 അല്ലെങ്കിൽ PPIA) താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഹിസ്റ്റോഗ്രാമുകൾ mRNA എക്സ്പ്രഷൻ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു. A ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, B യെ അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് സെല്ലുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, C അതിജീവിച്ച കോശങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, D യെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഡൈനാമിക്സ് ജീൻ എക്സ്പ്രഷനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഡാറ്റ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ (SD) ആയി അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, n = 3 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങൾ. വൺ-വേ ANOVA, ബോൺഫെറോണി പോസ്റ്റ് ഹോക്ക് ടെസ്റ്റ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ താരതമ്യങ്ങൾ നടത്തി. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
തുടർന്ന്, സെൽ വലുപ്പത്തിലെയും (FSC-H) സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് സങ്കീർണ്ണതയിലെയും (SSC-H) മാറ്റങ്ങൾ ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി ഉപയോഗിച്ച് വിലയിരുത്തി (ചിത്രം 6A,B), IPA ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷമുള്ള സെൽ മോർഫോളജിയിലെ മാറ്റങ്ങൾ ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി (TEM), ഫേസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് മൈക്രോസ്കോപ്പി എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വിലയിരുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 6A-B). പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, TGF-β1 ചികിത്സിച്ച ഗ്രൂപ്പിലെ സെല്ലുകൾ നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ വലുപ്പത്തിൽ വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 6A,B), റഫ് എൻഡോപ്ലാസ്മിക് റെറ്റിക്യുലത്തിന്റെയും (ER*) ഫാഗോലിസോസോമുകളുടെയും (P) ക്ലാസിക് വികാസം കാണിക്കുന്നു, ഇത് ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെൽ (HSC) സജീവമാക്കലിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 6A). എന്നിരുന്നാലും, TGF-β1 ചികിത്സിച്ച ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, TGF-β1, IPA കോമ്പിനേഷൻ ചികിത്സാ ഗ്രൂപ്പിൽ സെൽ വലുപ്പം, സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് സങ്കീർണ്ണത (ചിത്രം 6A,B), ER* ഉള്ളടക്കം എന്നിവ കുറഞ്ഞു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 6A). കൂടാതെ, നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ IPA ചികിത്സ കോശ വലുപ്പം, സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് സങ്കീർണ്ണത (ചിത്രം 6A,B), P, ER* ഉള്ളടക്കം (അനുബന്ധ ചിത്രം 6A) എന്നിവ കുറച്ചു. കൂടാതെ, നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ 24 മണിക്കൂർ IPA ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് കോശങ്ങളുടെ ഉള്ളടക്കം വർദ്ധിച്ചു (വെളുത്ത അമ്പടയാളങ്ങൾ, അനുബന്ധ ചിത്രം 6B). മൊത്തത്തിൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് 1 mM IPA ന് HSC അപ്പോപ്‌ടോസിസിനെ ഉത്തേജിപ്പിക്കാനും TGF-β1 പ്രേരിപ്പിച്ച സെൽ മോർഫോളജിക്കൽ പാരാമീറ്ററുകളിലെ മാറ്റങ്ങൾ വിപരീതമാക്കാനും അതുവഴി HSC നിഷ്‌ക്രിയത്വവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാവുന്ന സെൽ വലുപ്പവും സങ്കീർണ്ണതയും നിയന്ത്രിക്കാനും കഴിയും എന്നാണ്.
LX-2 കോശങ്ങളിലെ കോശ വലുപ്പവും സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് സങ്കീർണ്ണതയും IPA മാറ്റുന്നു. ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി വിശകലനത്തിന്റെ പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങൾ. വിശകലനം LX-2 സെല്ലുകൾക്ക് പ്രത്യേകമായ ഒരു ഗേറ്റിംഗ് തന്ത്രം ഉപയോഗിച്ചു: കോശ ജനസംഖ്യ നിർവചിക്കാൻ SSC-A/FSC-A, ഇരട്ടകളെ തിരിച്ചറിയാൻ FSC-H/FSC-A, കോശ വലുപ്പത്തിനും സങ്കീർണ്ണത വിശകലനത്തിനും SSC-H/FSC-H. സെറം-ഫ്രീ മീഡിയത്തിൽ 24 മണിക്കൂർ നേരം TGF-β1 (5 ng/ml), 1 mM IPA എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങളെ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. കോശ വലുപ്പത്തിനും സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് സങ്കീർണ്ണത വിശകലനത്തിനുമായി LX-2 സെല്ലുകളെ താഴത്തെ ഇടത് ക്വാഡ്രന്റ് (SSC-H-/FSC-H-), മുകളിലെ ഇടത് ക്വാഡ്രന്റ് (SSC-H+/FSC-H-), താഴത്തെ വലത് ക്വാഡ്രന്റ് (SSC-H-/FSC-H+), മുകളിലെ വലത് ക്വാഡ്രന്റ് (SSC-H+/FSC-H+) എന്നിങ്ങനെ വിതരണം ചെയ്തു. B. FSC-H (ഫോർവേഡ് സ്‌കാറ്റർ, സെൽ വലുപ്പം), SSC-H (സൈഡ് സ്‌കാറ്റർ, സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് സങ്കീർണ്ണത) (30,000 ഇവന്റുകൾ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി ഉപയോഗിച്ച് സെൽ മോർഫോളജി വിശകലനം ചെയ്തു. ഡാറ്റ ശരാശരി ± SD, n = 3 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളായി അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. വൺ-വേ ANOVA, ബോൺഫെറോണി പോസ്റ്റ് ഹോക്ക് ടെസ്റ്റ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ താരതമ്യങ്ങൾ നടത്തി. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ഉം ****p < 0.0001 ഉം
IPA പോലുള്ള ഗട്ട് മെറ്റബോളിറ്റുകൾ ഗവേഷണത്തിന്റെ ഒരു ചൂടുള്ള വിഷയമായി മാറിയിരിക്കുന്നു, ഇത് ഗട്ട് മൈക്രോബയോട്ടയിൽ പുതിയ ലക്ഷ്യങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയേക്കാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. അതിനാൽ മനുഷ്യരിൽ കരൾ ഫൈബ്രോസിസുമായി നമ്മൾ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു മെറ്റബോളൈറ്റായ IPA, മൃഗങ്ങളുടെ മാതൃകകളിൽ ഒരു സാധ്യതയുള്ള ആന്റി-ഫൈബ്രോട്ടിക് സംയുക്തമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് [13, 14]. ടൈപ്പ് 2 പ്രമേഹം (T2D) ഇല്ലാത്ത പൊണ്ണത്തടിയുള്ള വ്യക്തികളിൽ സീറം IPA യും ഗ്ലോബൽ ലിവർ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സും ഡിഎൻഎ മെത്തിലേഷനും തമ്മിലുള്ള ബന്ധം ഞങ്ങൾ ആദ്യമായി ഇവിടെ പ്രകടമാക്കുന്നു, ഇത് അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, മൈറ്റോഫാഗി, ദീർഘായുസ്സ് എന്നിവ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു, അതുപോലെ തന്നെ കരൾ ഹോമിയോസ്റ്റാസിസിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ഒരു സാധ്യമായ കാൻഡിഡേറ്റ് ജീൻ AKT1 ഉം എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിന്റെ മറ്റൊരു പുതുമ, LX-2 കോശങ്ങളിലെ അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, സെൽ മോർഫോളജി, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോഎനർജറ്റിക്സ്, ഡൈനാമിക്സ് എന്നിവയുമായുള്ള IPA ചികിത്സയുടെ ഇടപെടൽ ഞങ്ങൾ പ്രദർശിപ്പിച്ചു എന്നതാണ്, ഇത് HSC ഫിനോടൈപ്പിനെ നിഷ്‌ക്രിയത്വത്തിലേക്ക് മാറ്റുന്ന താഴ്ന്ന ഊർജ്ജ സ്പെക്ട്രത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് IPA യെ കരൾ ഫൈബ്രോസിസ് മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള സാധ്യതയുള്ള സ്ഥാനാർത്ഥിയാക്കുന്നു.
രക്തചംക്രമണ സെറം IPA യുമായി ബന്ധപ്പെട്ട കരൾ ജീനുകളിൽ സമ്പുഷ്ടമായ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട കാനോനിക്കൽ പാതകളാണ് അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, മൈറ്റോഫാഗി, ദീർഘായുസ്സ് എന്നിവയെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ (MQC) സിസ്റ്റത്തിന്റെ തടസ്സം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനരഹിതത, മൈറ്റോഫാഗി, അപ്പോപ്‌ടോസിസ് എന്നിവയിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം, അതുവഴി MASLD ഉണ്ടാകുന്നത് പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു [33, 34]. അതിനാൽ, കരളിലെ അപ്പോപ്‌ടോസിസ്, മൈറ്റോഫാഗി, ദീർഘായുസ്സ് എന്നിവയിലൂടെ സെൽ ഡൈനാമിക്സും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ സമഗ്രതയും നിലനിർത്തുന്നതിൽ IPA ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കാമെന്ന് നമുക്ക് അനുമാനിക്കാം. മൂന്ന് പരിശോധനകളിലും രണ്ട് ജീനുകൾ പൊതുവായിരുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ കാണിച്ചു: YKT6, AKT1. കോശ സ്തര സംയോജന പ്രക്രിയയിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ഒരു SNARE പ്രോട്ടീനാണ് YKT6 എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. ഓട്ടോഫാഗോസോമിൽ STX17, SNAP29 എന്നിവയുമായി ഒരു ഇനീഷ്യേഷൻ കോംപ്ലക്സ് രൂപീകരിച്ചുകൊണ്ട് ഇത് ഓട്ടോഫാഗിയിലും മൈറ്റോഫാഗിയിലും ഒരു പങ്ക് വഹിക്കുന്നു, അതുവഴി ഓട്ടോഫാഗോസോമുകളുടെയും ലൈസോസോമുകളുടെയും സംയോജനം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു [35]. കൂടാതെ, YKT6 ഫംഗ്‌ഷന്റെ നഷ്ടം മൈറ്റോഫാഗിയുടെ വൈകല്യത്തിന് കാരണമാകുന്നു [36], അതേസമയം YKT6 ന്റെ നിയന്ത്രണം ഹെപ്പറ്റോസെല്ലുലാർ കാർസിനോമയുടെ (HCC) പുരോഗതിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് കോശങ്ങളുടെ അതിജീവനം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു [37]. മറുവശത്ത്, AKT1 ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട സംവേദനാത്മക ജീൻ ആണ്, കൂടാതെ PI3K/AKT സിഗ്നലിംഗ് പാത, കോശ ചക്രം, കോശ മൈഗ്രേഷൻ, വ്യാപനം, ഫോക്കൽ അഡീഷൻ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം, കൊളാജൻ സ്രവണം [38–40] എന്നിവയുൾപ്പെടെ കരൾ രോഗങ്ങളിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. സജീവമാക്കിയ PI3K/AKT സിഗ്നലിംഗ് പാതയ്ക്ക് എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സിന്റെ (ECM) ഉത്പാദനത്തിന് ഉത്തരവാദികളായ കോശങ്ങളായ ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെല്ലുകളെ (HSCs) സജീവമാക്കാൻ കഴിയും, കൂടാതെ അതിന്റെ ക്രമക്കേട് കരൾ ഫൈബ്രോസിസ് ഉണ്ടാകുന്നതിനും പുരോഗമിക്കുന്നതിനും കാരണമായേക്കാം [40]. കൂടാതെ, p53-ആശ്രിത സെൽ അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെ തടയുന്ന പ്രധാന സെൽ അതിജീവന ഘടകങ്ങളിലൊന്നാണ് AKT, കൂടാതെ AKT സജീവമാക്കൽ കരൾ സെൽ അപ്പോപ്റ്റോസിസിന്റെ തടസ്സവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം [41, 42]. ലഭിച്ച ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, അപ്പോപ്റ്റോസിസിൽ പ്രവേശിക്കുന്നതിനോ അതിജീവനത്തിനോ ഇടയിലുള്ള ഹെപ്പറ്റോസൈറ്റുകളുടെ തീരുമാനത്തെ സ്വാധീനിച്ചുകൊണ്ട് കരൾ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട അപ്പോപ്റ്റോസിസിൽ ഐപിഎ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കാമെന്നാണ്. കരൾ ഹോമിയോസ്റ്റാസിസിന് നിർണായകമായ എകെടി,/അല്ലെങ്കിൽ വൈകെടി6 കാൻഡിഡേറ്റ് ജീനുകൾ ഈ ഫലങ്ങൾ നിയന്ത്രിക്കുന്നുണ്ടാകാം.
TGF-β1 ചികിത്സയെ ആശ്രയിക്കാതെ LX-2 കോശങ്ങളിൽ 1 mM IPA അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെ പ്രേരിപ്പിക്കുകയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസനം കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്തുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു. ഫൈബ്രോസിസ് റെസല്യൂഷനും ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെൽ (HSC) ആക്റ്റിവേഷനും അപ്പോപ്റ്റോസിസ് ഒരു പ്രധാന പാതയാണെന്നത് ശ്രദ്ധേയമാണ്, കൂടാതെ കരൾ ഫൈബ്രോസിസിന്റെ റിവേഴ്‌സിബിൾ ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രതികരണത്തിലെ ഒരു പ്രധാന സംഭവവുമാണ് [4, 43]. മാത്രമല്ല, കോമ്പിനേഷൻ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം LX-2 കോശങ്ങളിൽ BHI പുനഃസ്ഥാപിക്കുന്നത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോഎനർജറ്റിക്‌സിന്റെ നിയന്ത്രണത്തിൽ IPA യുടെ സാധ്യതയുള്ള പങ്കിനെക്കുറിച്ചുള്ള പുതിയ ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകി. വിശ്രമത്തിലും നിഷ്‌ക്രിയവുമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ, ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് കോശങ്ങൾ സാധാരണയായി ATP ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ ഉപയോഗിക്കുകയും കുറഞ്ഞ ഉപാപചയ പ്രവർത്തനങ്ങൾ നടത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. മറുവശത്ത്, ഗ്ലൈക്കോലൈറ്റിക് അവസ്ഥയിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്നതിന്റെ ഊർജ്ജ ആവശ്യങ്ങൾ നിറവേറ്റുന്നതിനായി HSC ആക്റ്റിവേഷൻ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസനവും ബയോസിന്തസിസും വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു [44]. IPA ഉപാപചയ സാധ്യതയെയും ECAR നെയും ബാധിച്ചില്ല എന്ന വസ്തുത സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ഗ്ലൈക്കോലൈറ്റിക് പാതയ്ക്ക് മുൻഗണന കുറവാണ് എന്നാണ്. അതുപോലെ, മറ്റൊരു പഠനം കാണിക്കുന്നത് 1 mM IPA കാർഡിയോമയോസൈറ്റുകൾ, ഹ്യൂമൻ ഹെപ്പറ്റോസൈറ്റ് സെൽ ലൈൻ (Huh7), ഹ്യൂമൻ പൊക്കിൾ വെയിൻ എൻഡോതെലിയൽ സെല്ലുകൾ (HUVEC) എന്നിവയിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസന ശൃംഖലയുടെ പ്രവർത്തനം മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമെന്നാണ്; എന്നിരുന്നാലും, കാർഡിയോമയോസൈറ്റുകളിലെ ഗ്ലൈക്കോളിസിസിൽ IPA യുടെ ഒരു ഫലവും കണ്ടെത്തിയില്ല, ഇത് മറ്റ് കോശ തരങ്ങളുടെ ബയോഎനർജറ്റിക്സിനെ IPA ബാധിച്ചേക്കാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു [45]. അതിനാൽ, mtDNA യുടെ അളവ് മാറ്റാതെ തന്നെ ഫൈബ്രോജെനിക് ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ, സെൽ മോർഫോളജി, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബയോഎനർജറ്റിക്സ് എന്നിവയെ ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കാൻ ഇതിന് കഴിയുമെന്നതിനാൽ, 1 mM IPA ഒരു നേരിയ കെമിക്കൽ അൺകപ്ലറായി പ്രവർത്തിച്ചേക്കാമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു [46]. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ അൺകപ്ലറുകൾക്ക് കൾച്ചർ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഫൈബ്രോസിസിനെയും HSC ആക്റ്റിവേഷനെയും തടയാനും [47] അൺകപ്ലിംഗ് പ്രോട്ടീനുകൾ (UCP) അല്ലെങ്കിൽ അഡിനൈൻ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ട്രാൻസ്‌ലോക്കേസ് (ANT) പോലുള്ള ചില പ്രോട്ടീനുകൾ നിയന്ത്രിക്കുന്നതോ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതോ ആയ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ATP ഉത്പാദനം കുറയ്ക്കാനും കഴിയും. സെൽ തരം അനുസരിച്ച്, ഈ പ്രതിഭാസത്തിന് കോശങ്ങളെ അപ്പോപ്‌ടോസിസിൽ നിന്ന് സംരക്ഷിക്കാനും/അല്ലെങ്കിൽ അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാനും കഴിയും [46]. എന്നിരുന്നാലും, ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെൽ നിഷ്ക്രിയത്വത്തിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ അൺകപ്ലർ എന്ന നിലയിൽ ഐപിഎയുടെ പങ്ക് വ്യക്തമാക്കുന്നതിന് കൂടുതൽ പഠനങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്.
തുടർന്ന്, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ശ്വസനത്തിലെ മാറ്റങ്ങൾ ജീവനുള്ള LX-2 കോശങ്ങളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ രൂപഘടനയിൽ പ്രതിഫലിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, TGF-β1 ചികിത്സ ഗോളാകൃതിയിൽ നിന്ന് ഇന്റർമീഡിയറ്റിലേക്കുള്ള മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ അനുപാതത്തെ മാറ്റുന്നു, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ബ്രാഞ്ചിംഗ് കുറയുകയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫിഷനിലെ ഒരു പ്രധാന ഘടകമായ DRP1 ന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ വർദ്ധിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു [48]. കൂടാതെ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ മൊത്തത്തിലുള്ള നെറ്റ്‌വർക്ക് സങ്കീർണ്ണതയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഫ്യൂഷനിൽ നിന്ന് ഫിഷനിലേക്കുള്ള മാറ്റം ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെൽ (HSC) ആക്റ്റിവേഷന് നിർണായകമാണ്, അതേസമയം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫിഷൻ തടയുന്നത് HSC അപ്പോപ്റ്റോസിസിലേക്ക് നയിക്കുന്നു [49]. അതിനാൽ, ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് TGF-β1 ചികിത്സ ശാഖകൾ കുറയുന്നതിലൂടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ നെറ്റ്‌വർക്ക് സങ്കീർണ്ണതയിൽ കുറവുണ്ടാകാൻ കാരണമാകുമെന്നാണ്, ഇത് സജീവമാക്കിയ ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെല്ലുകളുമായി (HSC-കൾ) ബന്ധപ്പെട്ട മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫിഷനിൽ കൂടുതൽ സാധാരണമാണ്. കൂടാതെ, IPA മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ അനുപാതത്തെ ഗോളാകൃതിയിൽ നിന്ന് ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ആകൃതിയിലേക്ക് മാറ്റുമെന്നും അതുവഴി OPA1, MFN2 എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ കുറയ്ക്കുമെന്നും ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ കാണിച്ചു. OPA1 ന്റെ നിയന്ത്രണം കുറയ്ക്കുന്നത് മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെംബ്രൺ പൊട്ടൻഷ്യലിൽ കുറവുണ്ടാക്കുമെന്നും സെൽ അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെ ട്രിഗർ ചെയ്യുമെന്നും പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് [50]. മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ഫ്യൂഷനും അപ്പോപ്‌ടോസിസിനും മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നതായി MFN2 അറിയപ്പെടുന്നു [51]. TGF-β1 ഉം/അല്ലെങ്കിൽ IPA ഉം വഴി LX-2 കോശങ്ങളുടെ ഇൻഡക്ഷൻ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ആകൃതിയും വലുപ്പവും, അതുപോലെ തന്നെ ആക്ടിവേഷൻ അവസ്ഥയും നെറ്റ്‌വർക്ക് സങ്കീർണ്ണതയും മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതായി ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് TGFβ-1, IPA എന്നിവയുടെ സംയോജിത ചികിത്സയ്ക്ക് അപ്പോപ്‌ടോസിസ്-ഒഴിവാക്കുന്ന കോശങ്ങളിലെ ഫൈബ്രോസിസ്, അപ്പോപ്റ്റോസിസ്, അതിജീവനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകൾ എന്നിവയുടെ mRNA എക്സ്പ്രഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ mtDNA, സെൽ മോർഫോളജിക്കൽ പാരാമീറ്ററുകൾ എന്നിവ കുറയ്ക്കാൻ കഴിയുമെന്നാണ്. വാസ്തവത്തിൽ, IPA, AKT1, COL1A2, MMP2 പോലുള്ള പ്രധാനപ്പെട്ട ഫൈബ്രോസിസ് ജീനുകളുടെ mRNA എക്സ്പ്രഷൻ ലെവൽ കുറച്ചു, പക്ഷേ അപ്പോപ്‌ടോസിസുമായി ബന്ധപ്പെട്ട CASP8 ന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവൽ വർദ്ധിപ്പിച്ചു. IPA ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം, BAX എക്സ്പ്രഷൻ കുറയുകയും TIMP1 കുടുംബ ഉപയൂണിറ്റുകളായ BCL-2, NF-κB എന്നിവയുടെ mRNA എക്സ്പ്രഷൻ വർദ്ധിക്കുകയും ചെയ്തുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു, ഇത് അപ്പോപ്‌ടോസിസിനെ ഒഴിവാക്കുന്ന ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെല്ലുകളിൽ (HSC-കൾ) അതിജീവന സിഗ്നലുകളെ IPA ഉത്തേജിപ്പിക്കുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. സജീവമാക്കിയ ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെല്ലുകളിൽ ഈ തന്മാത്രകൾ അതിജീവനത്തിന് അനുകൂലമായ സിഗ്നലുകളായി പ്രവർത്തിച്ചേക്കാം, ഇത് ആന്റി-അപ്പോപ്റ്റോട്ടിക് പ്രോട്ടീനുകളുടെ (Bcl-2 പോലുള്ളവ) വർദ്ധിച്ച എക്സ്പ്രഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം, പ്രോ-അപ്പോപ്റ്റോട്ടിക് BAX ന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ കുറയുകയും TIMP യും NF-κB യും തമ്മിലുള്ള സങ്കീർണ്ണമായ ഇന്റർപ്ലേയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം [5, 7]. PXR വഴിയാണ് IPA അതിന്റെ ഫലങ്ങൾ ചെലുത്തുന്നത്, കൂടാതെ TGF-β1, IPA എന്നിവയുമായുള്ള കോമ്പിനേഷൻ ചികിത്സ PXR mRNA എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, ഇത് HSC ആക്ടിവേഷൻ അടിച്ചമർത്തലിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. സജീവമാക്കിയ PXR സിഗ്നലിംഗ് ഇൻ വിവോയിലും ഇൻ വിട്രോയിലും HSC ആക്ടിവേഷനെ തടയുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്നു [52, 53]. അപ്പോപ്‌ടോസിസ് പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെയും, ഫൈബ്രോസിസ്, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിസം കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെയും, അതിജീവന സിഗ്നലുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെയും IPA സജീവമാക്കിയ HSC-കളുടെ ക്ലിയറൻസിൽ പങ്കെടുത്തേക്കാമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇവ സജീവമാക്കിയ HSC ഫിനോടൈപ്പിനെ നിർജ്ജീവമാക്കിയ ഒന്നാക്കി മാറ്റുന്ന സാധാരണ പ്രക്രിയകളാണ്. അപ്പോപ്‌ടോസിസ്സിലെ IPA യുടെ സാധ്യതയുള്ള സംവിധാനത്തിനും പങ്കിനും മറ്റൊരു സാധ്യമായ വിശദീകരണം, ഇത് പ്രധാനമായും മൈറ്റോഫാഗി (ആന്തരിക പാത) വഴിയും, NF-κB സർവൈവൽ സിഗ്നലിംഗ് പാതയുമായി നേരിട്ട് ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ബാഹ്യ TNF സിഗ്നലിംഗ് പാതയിലൂടെയും (പട്ടിക 1) പ്രവർത്തനരഹിതമായ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയെ സ്‌കാവെഞ്ച് ചെയ്യുന്നു എന്നതാണ് (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, IPA-യുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സമ്പുഷ്ടമായ ജീനുകൾക്ക് അപ്പോപ്‌ടൈറ്റിക് പാതയിൽ പ്രോ-അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക്, പ്രോ-അതിജീവന സിഗ്നലുകളെ പ്രേരിപ്പിക്കാൻ കഴിയും [54], ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് IPA ഈ ജീനുകളുമായി ഇടപഴകുന്നതിലൂടെ അപ്പോപ്‌ടൈറ്റിക് പാതയെയോ അതിജീവനത്തെയോ പ്രേരിപ്പിച്ചേക്കാം എന്നാണ്. എന്നിരുന്നാലും, എച്ച്എസ്‌സി സജീവമാക്കൽ സമയത്ത് ഐപിഎ എങ്ങനെയാണ് അപ്പോപ്‌ടോസിസിനെയോ അതിജീവനത്തെയോ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നത്, അതിന്റെ മെക്കാനിസ്റ്റിക് പാതകൾ വ്യക്തമല്ല.
ഭക്ഷണത്തിലെ ട്രിപ്റ്റോഫാനിൽ നിന്ന് ഗട്ട് മൈക്രോബയോട്ട വഴി രൂപം കൊള്ളുന്ന ഒരു സൂക്ഷ്മജീവ മെറ്റബോളിറ്റാണ് ഐപിഎ. കുടൽ പരിതസ്ഥിതിയിൽ ഇതിന് ആന്റി-ഇൻഫ്ലമേറ്ററി, ആന്റിഓക്‌സിഡന്റ്, എപ്പിജെനെറ്റിക് റെഗുലേറ്ററി ഗുണങ്ങളുണ്ടെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്.[55] കുടൽ തടസ്സ പ്രവർത്തനത്തെ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാനും ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് സ്ട്രെസ് കുറയ്ക്കാനും ഐപിഎയ്ക്ക് കഴിയുമെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, ഇത് അതിന്റെ പ്രാദേശിക ഫിസിയോളജിക്കൽ ഇഫക്റ്റുകൾക്ക് കാരണമായേക്കാം.[56] വാസ്തവത്തിൽ, ഐപിഎ രക്തചംക്രമണം വഴി അവയവങ്ങളെ ലക്ഷ്യമാക്കി കൊണ്ടുപോകപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ ട്രിപ്റ്റോഫാൻ, സെറോടോണിൻ, ഇൻഡോൾ ഡെറിവേറ്റീവുകൾ എന്നിവയുമായി ഐപിഎ സമാനമായ ഒരു പ്രധാന മെറ്റബോളൈറ്റ് ഘടന പങ്കിടുന്നതിനാൽ, മത്സരാധിഷ്ഠിത മെറ്റബോളിക് വിധികൾക്ക് കാരണമാകുന്ന ഉപാപചയ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഐപിഎ നടത്തുന്നു.[52] എൻസൈമുകളിലോ റിസപ്റ്ററുകളിലോ ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന സൈറ്റുകൾക്കായി ട്രിപ്റ്റോഫാൻ-ഉത്ഭവിച്ച മെറ്റബോളൈറ്റുകളുമായി ഐപിഎ മത്സരിച്ചേക്കാം, ഇത് സാധാരണ മെറ്റബോളിക് പാതകളെ തടസ്സപ്പെടുത്താൻ സാധ്യതയുണ്ട്. അതിന്റെ ചികിത്സാ വിൻഡോ നന്നായി മനസ്സിലാക്കുന്നതിന് അതിന്റെ ഫാർമക്കോകൈനറ്റിക്‌സിനെയും ഫാർമകോഡൈനാമിക്സിനെയും കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ പഠനങ്ങളുടെ ആവശ്യകത ഇത് എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.[57] ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെല്ലുകളിലും (എച്ച്എസ്‌സി) ഇത് സംഭവിക്കുമോ എന്ന് കണ്ടറിയണം.
ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിന് ചില പരിമിതികളുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ സമ്മതിക്കുന്നു. IPA യുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ബന്ധങ്ങൾ പ്രത്യേകമായി പരിശോധിക്കുന്നതിന്, ടൈപ്പ് 2 ഡയബറ്റിസ് മെലിറ്റസ് (T2DM) ഉള്ള രോഗികളെ ഞങ്ങൾ ഒഴിവാക്കി. ടൈപ്പ് 2 ഡയബറ്റിസ് മെലിറ്റസും വിപുലമായ കരൾ രോഗവുമുള്ള രോഗികൾക്ക് ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകളുടെ വിശാലമായ പ്രയോഗക്ഷമത ഇത് പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ സമ്മതിക്കുന്നു. മനുഷ്യ സെറമിലെ IPA യുടെ ഫിസിയോളജിക്കൽ സാന്ദ്രത 1–10 μM ആണെങ്കിലും [11, 20], ഏറ്റവും ഉയർന്ന വിഷരഹിത സാന്ദ്രതയും [15] അപ്പോപ്റ്റോസിസിന്റെ ഉയർന്ന നിരക്കും അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് 1 mM IPA യുടെ സാന്ദ്രത തിരഞ്ഞെടുത്തത്, നെക്രോറ്റിക് സെൽ ജനസംഖ്യയുടെ ശതമാനത്തിൽ വ്യത്യാസമില്ല. ഈ പഠനത്തിൽ IPA യുടെ സൂപ്പർഫിസിയോളജിക്കൽ ലെവലുകൾ ഉപയോഗിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, IPA യുടെ ഫലപ്രദമായ ഡോസ് സംബന്ധിച്ച് നിലവിൽ ഒരു സമവായവുമില്ല [52]. ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ പ്രാധാന്യമർഹിക്കുന്നതാണെങ്കിലും, IPA യുടെ വിശാലമായ മെറ്റബോളിക് വിധി ഗവേഷണത്തിന്റെ ഒരു സജീവ മേഖലയായി തുടരുന്നു. മാത്രമല്ല, സെറം IPA ലെവലുകളും കരൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ DNA മെത്തിലേഷനും തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെല്ലുകളിൽ (HSCs) നിന്ന് മാത്രമല്ല, കരൾ ടിഷ്യൂകളിൽ നിന്നും ലഭിച്ചു. ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം വിശകലനത്തിൽ നിന്നുള്ള മുൻ കണ്ടെത്തലുകളുടെ അടിസ്ഥാനത്തിലാണ് ഞങ്ങൾ മനുഷ്യ LX-2 സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിക്കാൻ തീരുമാനിച്ചത്. IPA ഹെമറ്റോപോയിറ്റിക് സ്റ്റെം സെൽ (HSC) ആക്ടിവേഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു [15] എന്നും, കരൾ ഫൈബ്രോസിസിന്റെ പുരോഗതിയിൽ ഉൾപ്പെടുന്ന പ്രധാന കോശങ്ങളാണ് HSCകൾ എന്നും കണ്ടെത്തി. കരളിൽ ഒന്നിലധികം കോശ തരങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, അതിനാൽ കാസ്പേസ് ആക്ടിവേഷൻ, ഡിഎൻഎ ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ എന്നിവയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച ഹെപ്പറ്റോസൈറ്റ്-എച്ച്എസ്സി-ഇമ്മ്യൂൺ സെൽ കോ-കൾച്ചർ സിസ്റ്റം പോലുള്ള മറ്റ് സെൽ മോഡലുകളും പ്രോട്ടീൻ ലെവൽ ഉൾപ്പെടെയുള്ള പ്രവർത്തന സംവിധാനവും ഐപിഎയുടെ പങ്കും മറ്റ് കരൾ കോശ തരങ്ങളുമായുള്ള അതിന്റെ ഇടപെടലും പഠിക്കാൻ പരിഗണിക്കണം.