സെൽ കമ്പാർട്ടുമെന്റലൈസേഷനും ഹോമിയോസ്റ്റാസിസും നിലനിർത്തുന്നതിന് സ്രവിക്കുന്ന പാതയിലെ പ്രോട്ടീൻ തരംതിരിക്കൽ അത്യാവശ്യമാണ്. ഷെൽ-മധ്യസ്ഥതയുള്ള തരംതിരിക്കലിനു പുറമേ, സ്രവിക്കുന്ന ഗതാഗത പ്രക്രിയയിൽ കൈനെസിൻ തരംതിരിക്കലിൽ ലിപിഡുകളുടെ പങ്ക് ഇതുവരെ ഉത്തരം ലഭിച്ചിട്ടില്ലാത്ത ഒരു ദീർഘകാല അടിസ്ഥാന ചോദ്യമാണ്. വളരെ നീണ്ട സെറാമൈഡ് ലിപിഡ് ഭാഗങ്ങളുള്ള പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച ഗ്ലൈക്കോസൈൽഫോസ്ഫാറ്റിഡൈലിനോസിറ്റോൾ-ഇമ്മൊബിലൈസ് ചെയ്ത പ്രോട്ടീനുകൾ ക്ലസ്റ്ററായി പ്രത്യേക എൻഡോപ്ലാസങ്ങളായി തരംതിരിച്ചിട്ടുണ്ടെന്ന് ഇൻ വിവോയിൽ തെളിയിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ഇവിടെ 3D ഒരേസമയം മൾട്ടികളർ ഹൈ-റെസല്യൂഷൻ റിയൽ-ടൈം ഇമേജിംഗ് നടത്തുന്നു. ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ പ്രോട്ടീനുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായ നെറ്റ് എക്സിറ്റ് സൈറ്റ്. കൂടാതെ, എൻഡോപ്ലാസ്മിക് റെറ്റിക്യുലം മെംബ്രണിലെ സെറാമൈഡിന്റെ ചെയിൻ നീളം ഈ തരംതിരിക്കലിന് നിർണായകമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. ലിപിഡ് ചെയിൻ നീളത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി പ്രോട്ടീൻ കാർഗോകളെ സ്രവിക്കുന്ന പാതയിലെ സെലക്ടീവ് എക്‌സ്‌പോർട്ട് സൈറ്റുകളായി തരംതിരിക്കുന്നതിനുള്ള ആദ്യത്തെ നേരിട്ടുള്ള ഇൻ വിവോ തെളിവ് ഞങ്ങളുടെ പഠനം നൽകുന്നു.
യൂക്കറിയോട്ടിക് കോശങ്ങളിൽ, എൻഡോപ്ലാസ്മിക് റെറ്റിക്യുലത്തിൽ (ER) സമന്വയിപ്പിച്ച പ്രോട്ടീനുകൾ അവയുടെ ഉചിതമായ സെല്ലുലാർ ലക്ഷ്യസ്ഥാനത്തേക്ക് എത്തിക്കുന്നതിനായി സ്രവിക്കുന്ന പാതയിലൂടെ ഗതാഗത സമയത്ത് തരംതിരിക്കപ്പെടുന്നു (1). കോട്ട്-മെഡിയേറ്റഡ് സോർട്ടിംഗിന് പുറമേ, ചില ലിപിഡുകൾക്ക് പ്രത്യേക മെംബ്രൻ ഡൊമെയ്‌നുകളിലേക്ക് ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്‌ത് സെലക്ടീവ് എക്സിറ്റ് പോയിന്റുകളായി വർത്തിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് വളരെക്കാലമായി അനുമാനിക്കപ്പെട്ടിരുന്നു, ആ പ്രത്യേക പ്രോട്ടീനുകൾ (2-5). എന്നിരുന്നാലും, ഈ സാധ്യമായ ലിപിഡ് അധിഷ്ഠിത സംവിധാനം തെളിയിക്കുന്നതിനുള്ള നേരിട്ടുള്ള ഇൻ വിവോ തെളിവുകളുടെ അഭാവം ഇപ്പോഴും ഉണ്ട്. ഈ അടിസ്ഥാന പ്രശ്നം പരിഹരിക്കുന്നതിനായി, ഗ്ലൈക്കോസൈൽഫോസ്ഫാറ്റിഡൈലിനോസിറ്റോൾ (GPI) ആങ്കേർഡ് പ്രോട്ടീനുകൾ (GPI-APs) ER-ൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി കയറ്റുമതി ചെയ്യുന്നതെങ്ങനെയെന്ന് ഞങ്ങൾ യീസ്റ്റിൽ പഠിച്ചു. GPI-APs വിവിധതരം ലിപിഡ്-ബന്ധിത സെൽ ഉപരിതല പ്രോട്ടീനുകളാണ് (6, 7). ഗ്ലൈക്കോലിപിഡ് മൊയറ്റി (GPI ആങ്കർ) വഴി പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിന്റെ പുറം ലഘുലേഖകളിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു സ്രവിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനാണ് GPI-AP. ER ല്യൂമനിലെ യാഥാസ്ഥിതിക പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ലേഷണൽ പരിഷ്കാരങ്ങളായി അവർ GPI ആങ്കറുകളെ സ്വീകരിക്കുന്നു (8). അറ്റാച്ച്മെന്റിനുശേഷം, GPI-AP ഗോൾഗി ഉപകരണത്തിലൂടെ (5, 9) ER മുതൽ പ്ലാസ്മ മെംബ്രൺ വരെ കടന്നുപോകുന്നു. GPI ആങ്കറുകളുടെ സാന്നിധ്യം ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ സ്രവിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് (മറ്റ് പ്ലാസ്മ മെംബ്രൻ പ്രോട്ടീനുകൾ ഉൾപ്പെടെ) സ്രവിക്കുന്ന പാതയിലൂടെ GPI-AP വെവ്വേറെ കൊണ്ടുപോകാൻ കാരണമാകുന്നു (5, 9, 10). യീസ്റ്റ് കോശങ്ങളിൽ, എൻഡോപ്ലാസ്മിക് റെറ്റിക്യുലത്തിലെ മറ്റ് സ്രവിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് GPI-AP-കളെ വേർതിരിക്കുകയും പിന്നീട് കോട്ട് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സ് II (COPII) കൊണ്ട് പൊതിഞ്ഞ അദ്വിതീയ വെസിക്കിളുകളിലേക്ക് പായ്ക്ക് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു (6, 7). ER കയറ്റുമതി പ്രക്രിയയിലെ ഈ വർഗ്ഗീകരണ പ്രക്രിയയുടെ നിർണ്ണായക ഘടകങ്ങൾ വ്യക്തമല്ല, പക്ഷേ ഈ സംവിധാനത്തിന് ലിപിഡുകൾ ആവശ്യമായി വന്നേക്കാം, പ്രത്യേകിച്ച് GPI ആങ്കറിന്റെ ലിപിഡ് ഭാഗത്തിന്റെ ഘടനാപരമായ പുനർനിർമ്മാണം (5, 8). യീസ്റ്റിൽ, GPI അറ്റാച്ച് ചെയ്ത ഉടൻ തന്നെ GPI ലിപിഡ് പുനർനിർമ്മാണം ആരംഭിക്കുന്നു, കൂടാതെ പല സന്ദർഭങ്ങളിലും, ഇത് സെറാമൈഡിനെ 26-കാർബൺ ലോംഗ്-ചെയിൻ സാച്ചുറേറ്റഡ് ഫാറ്റി ആസിഡുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കാരണമാകുന്നു (C26:0) (11, 12). യീസ്റ്റ് കോശങ്ങൾ ഇതുവരെ ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്ന പ്രധാന സെറാമൈഡ് C26 സെറാമൈഡാണ്. ഇത് ER-ൽ സമന്വയിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, ഇതിന്റെ ഭൂരിഭാഗവും COPII വെസിക്കിളുകൾ വഴി ഗോൾഗി ഉപകരണത്തിലേക്ക് കയറ്റുമതി ചെയ്യുന്നു (13). GPI-AP യുടെ ER കയറ്റുമതിക്ക് പ്രത്യേകമായി തുടർച്ചയായ സെറാമൈഡ് സിന്തസിസ് ആവശ്യമാണ് (14, 15), അതോടൊപ്പം, ഗോൾഗി ഉപകരണത്തിൽ സെറാമൈഡിനെ ഇനോസിറ്റോൾ ഫോസ്ഫേറ്റ് സെറാമൈഡ് (IPC) ആയി പരിവർത്തനം ചെയ്യുന്നത് GPI ആങ്കർ സിന്തസിസിനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു (16). കൃത്രിമ സ്തരങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ബയോഫിസിക്കൽ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് വളരെ നീണ്ട അസൈൽ ചെയിൻ സെറാമൈഡുകൾ സംയോജിപ്പിച്ച് അതുല്യമായ ഭൗതിക ഗുണങ്ങളുള്ള ക്രമീകൃത ഡൊമെയ്‌നുകൾ രൂപപ്പെടുത്താൻ കഴിയുമെന്നാണ് (17, 18). ഈ ഡാറ്റ C26 സെറാമൈഡും C26 സെറാമൈഡുള്ള GPI-AP ഉം അവയുടെ ഭൗതിക ഗുണങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് താരതമ്യേന കുഴപ്പമുള്ള ER മെംബ്രൻ ലിപിഡ് പരിതസ്ഥിതിയിൽ ക്രമീകൃത മേഖലകളിലേക്കോ പ്രദേശങ്ങളിലേക്കോ ലയിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന അനുമാനത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. ഇത് പ്രധാനമായും ചെറുതും അപൂരിതവുമായ ഗ്ലിസറോലിപ്പിഡുകൾ ചേർന്നതാണ് (C16:1, C18:1) (19, 20). ഈ പ്രദേശങ്ങൾ നിർദ്ദിഷ്ട ER എക്സിറ്റ് സൈറ്റുകളിൽ (ERES) തിരഞ്ഞെടുത്ത് ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിക്കും, അവിടെ സെറാമൈഡും സെറാമൈഡ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള GPI-AP യും ഒരേ സമർപ്പിത COPII വെസിക്കിളിൽ ഗോൾഗിയിലേക്ക് സഹ-ഗതാഗതം ചെയ്യാൻ കഴിയും (5).
ഈ പഠനത്തിൽ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ആയി ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോട്ടീനുകളെ ഒരേസമയം നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു കട്ടിംഗ്-എഡ്ജ് മൈക്രോസ്കോപ്പി സാങ്കേതികതയായ സൂപ്പർ-റെസല്യൂഷൻ കൺഫോക്കൽ റിയൽ-ടൈം ഇമേജിംഗ് മൈക്രോസ്കോപ്പി (SCLIM) ഉപയോഗിച്ച് ഈ ലിപിഡ് അധിഷ്ഠിത സംവിധാനം ഞങ്ങൾ നേരിട്ട് പരീക്ഷിച്ചു. ത്രിവർണ്ണ, ത്രിമാന (3D) ചിത്രങ്ങൾക്ക് ജീവകോശങ്ങളിൽ വളരെ ഉയർന്ന റെസല്യൂഷനും വേഗതയും ഉണ്ട് (21, 22).
എസ്. സെറിവിസിയയിലെ ER വിട്ടതിനുശേഷം ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ സ്രവിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് C26 സെറാമൈഡ് ഗ്രൂപ്പുള്ള സാധാരണ GPI-AP എങ്ങനെ സ്‌ക്രീൻ ചെയ്‌തുവെന്ന് കൂടുതൽ നിർവചിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ആദ്യം SCLIM സാങ്കേതികവിദ്യ പ്രയോഗിച്ചു. ER ന്റെ വർഗ്ഗീകരണം പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, ERES-ൽ പ്രവേശിക്കുന്ന പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച കാർഗോയെ നേരിട്ട് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു ജനിതക സംവിധാനം ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു (7, 23). കാർഗോ എന്ന നിലയിൽ, ഗ്രീൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ (GFP) ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്‌ത C26 സെറാമൈഡ് അധിഷ്ഠിത GPI-AP Gas1 ഉം നിയർ-ഇൻഫ്രാറെഡ് ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ (iRFP) ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്‌ത ട്രാൻസ്‌മെംബ്രെൻ സ്രവിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ Mid2 ഉം ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു, ഇവ രണ്ടും പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിനെ ലക്ഷ്യം വയ്ക്കുന്നു (24–26). sec31-1 താപനില-സെൻസിറ്റീവ് മ്യൂട്ടന്റിൽ, ഈ രണ്ട് കാർഗോകളും ഒരു ഗാലക്ടോസ്-ഇൻഡ്യൂസിബിൾ പ്രൊമോട്ടറിന്റെയും ഒരു കോൺസ്റ്റിറ്റീവ് ERES മാർക്കറിന്റെയും കീഴിൽ പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു. അങ്ങേയറ്റത്തെ താപനിലയിൽ (37°C), sec31-1 മ്യൂട്ടേഷൻ COPII മുളയ്ക്കലും ER കയറ്റുമതിയും തടയുന്നതിന് COPII കോട്ട് ഘടകമായ Sec31 ന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ ബാധിക്കുന്നതിനാൽ, ER-ൽ പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച കാർഗോ അടിഞ്ഞുകൂടുന്നു (23). കുറഞ്ഞ താപനിലയിലേക്ക് (24°C) തണുപ്പിച്ച ശേഷം, sec31-1 മ്യൂട്ടന്റ് കോശങ്ങൾ സ്രവിക്കുന്ന സ്ഥലത്ത് നിന്ന് വീണ്ടെടുക്കപ്പെട്ടു, ശേഖരിച്ച പുതിയ സിന്തറ്റിക് കാർഗോ ER-ൽ നിന്ന് കയറ്റുമതി ചെയ്യാൻ തുടങ്ങി. CLIM വിഷ്വലൈസേഷൻ കാണിക്കുന്നത്, പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച Gas1-GFP, Mid2-iRFP എന്നിവയിൽ ഭൂരിഭാഗവും 37°C-ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തതിനുശേഷം sec31-1 മ്യൂട്ടന്റ് കോശങ്ങളുടെ ER-ൽ അടിഞ്ഞുകൂടുകയും തുടർന്ന് 24°C-ൽ 5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് പുറത്തുവിടുകയും ചെയ്യുന്നു എന്നാണ് (ചിത്രം 1). Mid2-iRFP മുഴുവൻ ER മെംബ്രണിലും വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നതിനാലും, Gas1-GFP തുടർച്ചയായ ER മെംബ്രൺ പ്രദേശത്ത് കേന്ദ്രീകരിച്ച് ശേഖരിക്കപ്പെടുന്നതിനാലും, അവയുടെ വിതരണം പൂർണ്ണമായും വ്യത്യസ്തമാണ് (ചിത്രം 1, A മുതൽ C വരെയും മൂവി S1 വരെയും). കൂടാതെ, ചിത്രം 1D-യിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, Gas1-GFP ക്ലസ്റ്ററിന് Mid2-iRFP ഇല്ല. GPI-AP, ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ പ്രോട്ടീനുകൾ എന്നിവ നേരത്തെ തന്നെ വ്യത്യസ്ത ER മെംബ്രൺ മേഖലകളായി വേർതിരിക്കപ്പെട്ടിരുന്നു എന്നാണ് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്. mCherry യുടെ COPII കോട്ട് പ്രോട്ടീൻ Sec13 (ചിത്രം 1, E, F, മൂവി S1) (23) ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്ന ഒരു പ്രത്യേക ERES ന് സമീപമാണ് Gas1-GFP ക്ലസ്റ്റർ.
sec31-1 കോശങ്ങൾ ഗാലക്ടോസ്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് സ്രവങ്ങൾ, ഒരു നീണ്ട അസൈൽ ചെയിൻ (C26) സെറാമൈഡ് GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, പച്ച), ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ പ്രോട്ടീൻ Mid2-iRFP (TMP, നീല) എന്നിവ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഈ കൺസ്ട്രക്റ്റീവ് ERES ലേബലിംഗ് Sec13-mCherry (ERES, മജന്ത) 37°C-ൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, 24°C-ലേക്ക് മാറ്റി, 5 മിനിറ്റിനുശേഷം SCLIM ചിത്രീകരിച്ചു. (A മുതൽ C വരെ) ഒരു തലം (A) യുടെ ഒരു പ്രതിനിധി ലയിപ്പിച്ച അല്ലെങ്കിൽ ഒറ്റ 2D ചിത്രം, 10 z-സെക്ഷനുകളുടെ (B) 2D പ്രൊജക്ഷൻ ചിത്രം അല്ലെങ്കിൽ കാർഗോയുടെയും ERES മാർക്കറുകളുടെയും (C) ഒരു 3D സെൽ അർദ്ധഗോള ചിത്രം എന്നിവ കാണിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ 1μm (A, B) ആണ്. സ്കെയിൽ യൂണിറ്റ് 0.551μm (C) ആണ്. Gas1-GFP ഡിസ്ക്രീറ്റ് ER ​​മേഖലകളിലോ ക്ലസ്റ്ററുകളിലോ കണ്ടെത്തി, അതേസമയം Mid2-iRFP കണ്ടെത്തി ER മെംബ്രൺ (C) മുഴുവൻ വിതരണം ചെയ്തു. (D) വെളുത്ത അമ്പടയാള രേഖയിലൂടെ (ഇടത്) Gas1-GFP ക്ലസ്റ്ററിലെ Gas1-GFP, Mid2-iRFP എന്നിവയുടെ ആപേക്ഷിക ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത ഗ്രാഫ് കാണിക്കുന്നു. AU, അനിയന്ത്രിത യൂണിറ്റ്. (E, F) ഗുഡ്‌സും ERES മാർക്കും സംയോജിപ്പിക്കുന്ന 3D ഇമേജിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. നിർദ്ദിഷ്ട ERES ന് സമീപം Gas1-GFP ക്ലസ്റ്ററുകൾ കണ്ടെത്തി. സ്കെയിൽ യൂണിറ്റ് 0.551μm ആണ്. (F) വെളുത്ത സോളിഡ് അമ്പടയാളം ERES മായി ബന്ധപ്പെട്ട Gas1-GFP ക്ലസ്റ്ററിനെ അടയാളപ്പെടുത്തുന്നു. മധ്യ, വലത് പാനലുകൾ ലയിപ്പിച്ച വലുതാക്കിയ 3D ഇമേജും തിരഞ്ഞെടുത്ത Gas1-GFP ക്ലസ്റ്ററിന്റെ ഒരു ഭ്രമണ കാഴ്ചയും കാണിക്കുന്നു.
Gas1-GFP ക്ലസ്റ്ററും ഒരു പ്രത്യേക ERES ഉം തമ്മിലുള്ള അടുത്ത സ്പേഷ്യൽ ബന്ധം സൂചിപ്പിക്കുന്നത് Gas1-GFP സെലക്ടീവ് ERES-ലേക്ക് പ്രവേശിക്കാൻ കഴിയുമെന്നാണ്, ഇത് Mid2-iRFP ER വിടാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന സെലക്റ്റിവിറ്റിയിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്. ഈ സാധ്യത പരിഹരിക്കുന്നതിന്, ഒന്നോ രണ്ടോ സാധനങ്ങൾക്കുള്ള ERES അനുപാതം ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കി (ചിത്രം 2, A മുതൽ C വരെ). മിക്ക ERES-ലും (70%) ഒരു തരം കാർഗോ മാത്രമേ ഉള്ളൂ എന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. ചിത്രം 2C യുടെ താഴെയുള്ള ചിത്രം Gas1-GFP മാത്രമുള്ളതോ (ചിത്രം 1) Mid2-iRFP മാത്രമുള്ളതോ ആയ ERES-ന്റെ രണ്ട് സാധാരണ ഉദാഹരണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 2). ഇതിനു വിപരീതമായി, ഏകദേശം 20% ERES-ൽ ഒരേ പ്രദേശത്ത് ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്ന രണ്ട് കാർഗോകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ചില ERES (10%) രണ്ട് തരം കാർഗോകൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് കണ്ടെത്തി, പക്ഷേ അവ വ്യക്തമായി വ്യത്യസ്ത മേഖലകളിൽ ഒറ്റപ്പെട്ടു. അതിനാൽ, ER കയറ്റുമതി ചെയ്ത ശേഷം, GPI-AP Gas1-GFP, ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ കാർഗോ Mid2-iRFP എന്നിവ വ്യത്യസ്ത ERES-കളായി വിഭജിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് ഈ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് വിശകലനം കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 2D). ഈ തരംതിരിക്കലിന്റെ കാര്യക്ഷമത മുമ്പത്തെ ബയോകെമിക്കൽ വിശകലനം (6), രൂപാന്തര നിർണ്ണയം (7) എന്നിവയുമായി വളരെ പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. ERES-ൽ പ്രവേശിക്കുന്ന ക്വാറന്റൈൻ ചെയ്ത കാർഗോയുടെ സ്വഭാവവും നമുക്ക് നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയും (ചിത്രം 2E, മൂവി S2). ചിത്രം 2E കാണിക്കുന്നത് Gas1-GFP (പാനൽ 3) അല്ലെങ്കിൽ Mid2-iRFP (പാനൽ 4) യുടെ ഒരു ചെറിയ ഭാഗം മാത്രമേ ERES-ൽ ഒരു വശത്ത് നിന്ന് പ്രവേശിക്കുന്നുള്ളൂവെന്നും ഒരു പ്രത്യേക പ്രദേശത്ത് ഒതുങ്ങി നിൽക്കുന്നുവെന്നും ആണ്. ചിത്രം 2E-യിലെ പാനൽ 5 കാണിക്കുന്നത് Gas1-GFP ഉം Mid2-iRFP ഉം ചിലപ്പോൾ ഒരേ ERES-ൽ കാണപ്പെടുന്നുവെന്നും എന്നാൽ അവ വ്യത്യസ്ത വശങ്ങളിൽ നിന്ന് പ്രവേശിക്കുകയും വ്യത്യസ്ത COPII വെസിക്കിളുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന പ്രത്യേക പ്രദേശങ്ങളിൽ കേന്ദ്രീകരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു എന്നാണ്. C26 സെറാമൈഡ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള GPI-AP Gas1-നെ സെലക്ടീവ് ERES ആയി വേർതിരിക്കുന്നതും വർഗ്ഗീകരിക്കുന്നതും നിർദ്ദിഷ്ടമാണെന്നും ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു, കാരണം മറ്റൊരു ട്രാൻസ്‌മെംബ്രെൻ സ്രവ കാർഗോ, GFP-ടാഗ് ചെയ്‌ത പ്ലാസ്മ മെംബ്രൻ പ്രോട്ടീൻ Axl2 (27), Mid2-iRFP-യോട് സമാനമായ സ്വഭാവം കാണിക്കുന്നു. (ചിത്രം S1, മൂവി S3). പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച Axl2-GFP, Mid2-iRFP (ചിത്രം S1, A, B) പോലെയുള്ള ER മെംബ്രണിലൂടെ വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ മിക്ക ERES-ലും Mid2-iRFP-യുമായി സഹ-പ്രാദേശികവൽക്കരിക്കപ്പെടുന്നു (ചിത്രം S1, B മുതൽ D വരെ). ചിത്രം 1-ലെ പാനലുകൾ 1 ഉം 2 ഉം. രണ്ട് ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ കാർഗോകൾ ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്ന ERES-ന്റെ രണ്ട് സാധാരണ ഉദാഹരണങ്ങൾ S1C കാണിക്കുന്നു. ഈ സന്ദർഭങ്ങളിൽ, രണ്ട് സാധനങ്ങളും ഒരുമിച്ച് ERES-ലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്നു (ചിത്രം S1E, പാനൽ 3, മൂവി S3).
ഗാലക്ടോസ് ഇൻഡ്യൂസിബിൾ സ്രവങ്ങൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന sec31-1 സെല്ലുകൾ, Gas1-GFP (GPI-AP, പച്ച), Mid2-iRFP (TMP, നീല), Sec13-mCherry (ERES, മജന്ത) എന്നീ കോൺസ്റ്റിറ്റീവ് ERES ലേബലിംഗ് എന്നിവ 37-ൽ സ്ഥാപിച്ചു. °C-ൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത ശേഷം, സ്രവ ബ്ലോക്ക് പുറത്തുവിടാൻ 24 °C-ലേക്ക് നീക്കുക, 20 മിനിറ്റിനുശേഷം SCLIM ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രം എടുക്കുക. (A മുതൽ C വരെ) കാർഗോയുടെയും ERES അടയാളപ്പെടുത്തിയ 10 z-സെക്ഷനുകളുടെയും പ്രതിനിധി 2D പ്രൊജക്ഷൻ ഇമേജുകൾ (A; സ്കെയിൽ ബാർ, 1μm) അല്ലെങ്കിൽ 3D സെൽ അർദ്ധഗോള ചിത്രങ്ങൾ (B, C; സ്കെയിൽ യൂണിറ്റ്, 0.456μm). (B)-ലെ താഴത്തെ പാനലും (C)-ലെ പാനലും ERES (മജന്ത)-ൽ [Gas1-GFP (ചാരനിറം) Mid2-iRFP (ഇളം നീല)]-ൽ ഉള്ള സാധനങ്ങൾ മാത്രം പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നതിന് പ്രോസസ്സ് ചെയ്ത ചിത്രങ്ങൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു. (C) തുറന്ന അമ്പടയാളം: ERES ഒരു കാർഗോ മാത്രമേ വഹിക്കുന്നുള്ളൂ (1 മുതൽ 4 വരെ). ചാരനിറത്തിലുള്ള അമ്പടയാളം: ERES-ൽ വേർതിരിച്ച കാർഗോ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു (5). വെളുത്ത സോളിഡ് അമ്പടയാളം: സഹ-സ്ഥാന കാർഗോ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ERES. താഴെ: തിരഞ്ഞെടുത്ത ഒറ്റ ERES-ൽ Gas1-GFP (1) അല്ലെങ്കിൽ Mid2-iRFP (2) മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ. സ്കെയിൽ ബാർ, 100 nm. (D) (C)-ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന ഫോട്ടോമൈക്രോഗ്രാഫിന്റെ അളവ്. ഒരു കാർഗോ (Gas1-GFP അല്ലെങ്കിൽ Mid2-iRFP), വേർതിരിച്ച കാർഗോ, ഓവർലാപ്പിംഗ് കാർഗോ എന്നിവ മാത്രം ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ERES-ന്റെ ശരാശരി ശതമാനം. മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, 54 സെല്ലുകളിൽ n=432. പിശക് ബാർ = SD. രണ്ട്-ടെയിൽഡ് അൺപെയേർഡ് ടി ടെസ്റ്റ്. *** P = 0.0002. (E) (C) എന്ന് അടയാളപ്പെടുത്തിയ ക്വാറന്റൈൻ ചെയ്ത കാർഗോയുടെ തിരഞ്ഞെടുത്ത ERES-ന്റെ 3D ചിത്രം. Gas1-GFP (പച്ച) (3) അല്ലെങ്കിൽ Mid2-iRFP (നീല) (4) ഒരു വശത്ത് നിന്ന് ERES (മജന്ത)യിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുകയും ERES-നുള്ളിലെ ഒരു ചെറിയ പ്രദേശത്തേക്ക് പരിമിതപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. ചിലപ്പോൾ, രണ്ട് തരം കാർഗോകളും ഒരേ വശത്ത് നിന്ന് ഒരേ ERES (5) ലേക്ക് പ്രവേശിക്കുകയും ERES-നുള്ളിലെ ഒരു ഒറ്റപ്പെട്ട പ്രദേശത്ത് ഒതുങ്ങുകയും ചെയ്യും. സ്കെയിൽ ബാർ, 100 nm.
അടുത്തതായി, ER മെംബ്രണിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന നീണ്ട അസൈൽ ചെയിൻ സെറാമൈഡ് (C26) ഗ്യാസ് 1 ന്റെ നിർദ്ദിഷ്ട ക്ലസ്റ്ററിംഗിനെയും തരംതിരിക്കലിനെയും സെലക്ടീവ് ERES ലേക്ക് നയിക്കുന്നു എന്ന ഒരു സിദ്ധാന്തം ഞങ്ങൾ പരീക്ഷിച്ചു. ഇതിനായി, ഞങ്ങൾ ഒരു പരിഷ്കരിച്ച യീസ്റ്റ് സ്ട്രെയിൻ GhLag1 ഉപയോഗിച്ചു, അതിൽ രണ്ട് എൻഡോജെനസ് സെറാമൈഡ് സിന്തസുകളായ Lag1, Lac1 എന്നിവ GhLag1 (പരുത്തിയുടെ Lag1 ഹോമോലോഗ്) ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചു, അതിന്റെ ഫലമായി വൈൽഡ് തരത്തേക്കാൾ ചെറുതായ സെൽ മെംബ്രൺ സെറാമൈഡ് സ്ട്രെയിൻ ഉള്ള ഒരു യീസ്റ്റ് സ്ട്രെയിൻ ഉണ്ടായി (ചിത്രം 3A) (28). വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് സ്ട്രെയിനുകളിൽ, മൊത്തം സെറാമൈഡിന്റെ 95% വളരെ നീളമുള്ള (C26) ചെയിൻ സെറാമൈഡാണെന്നും, GhLag1 ൽ, സെറാമൈഡിന്റെ 85% വളരെ നീളമുള്ളതാണെന്നും (C18 ഉം C16 ഉം) മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (MS) വിശകലനം കാണിച്ചു. ), സെറാമൈഡിന്റെ 2% മാത്രമേ വളരെ നീളമുള്ള (C26) ചെയിൻ സെറാമൈഡാണെന്നും. GhLag1 മെംബ്രണിൽ ഇതുവരെ കണ്ടെത്തിയ പ്രധാന സെറാമൈഡുകൾ C18 ഉം C16 സെറാമൈഡുകളുമാണെങ്കിലും, GhLag1 സ്‌ട്രെയിനിൽ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന Gas1-GFP യുടെ GPI ആങ്കറിൽ C26 സെറാമൈഡ് അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് MS വിശകലനം സ്ഥിരീകരിച്ചു, ഇത് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ലിപിഡുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്നതാണ്. ഗുണനിലവാരം ഒന്നുതന്നെയാണ് (ചിത്രം 3A) (26). അതിനാൽ, Cwh43 എന്ന സെറാമൈഡ് പുനർനിർമ്മാണ എൻസൈം C26 സെറാമൈഡിനായി വളരെ സെലക്ടീവ് ആണെന്നാണ് ഇതിനർത്ഥം, ചിത്രം 26 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, GhLag1 സ്‌ട്രെയിനിലെ ചെറിയ അളവിലുള്ള C26 സെറാമൈഡിൽ നിന്ന് GPI ആങ്കറിനെ ഇത് മുൻഗണനയോടെ സംയോജിപ്പിക്കുന്നു. S2 (29). എന്നിരുന്നാലും, GhLag1 ന്റെ കോശ സ്തരത്തിൽ അടിസ്ഥാനപരമായി C18-C16 സെറാമൈഡ് മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ, അതേസമയം Gas1-GFP യിൽ ഇപ്പോഴും C26 സെറാമൈഡ് ഉണ്ട്. ഈ വസ്തുത ER ലെ മെംബ്രൻ സെറാമൈഡിന്റെ അസൈൽ ചെയിൻ നീളത്തിന്റെ പ്രശ്നം പ്രത്യേകമായി പരിഹരിക്കുന്നതിന് ഈ സ്‌ട്രെയിനെ ഒരു അനുയോജ്യമായ ഉപകരണമാക്കി മാറ്റുന്നു. ക്ലാസിന്റെയും തരംതിരിക്കലിന്റെയും സാങ്കൽപ്പിക പങ്ക്. തുടർന്ന്, പരമ്പരാഗത ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പി വഴി, sec31-1 ന്റെ താപനില-സെൻസിറ്റീവ് മ്യൂട്ടന്റ് അല്ലീലുള്ള GhLag1 ലെ ക്ലസ്റ്ററുകളിൽ C26 Gas1-GFP അടിഞ്ഞുകൂടാനുള്ള കഴിവ് ഞങ്ങൾ ആദ്യം പഠിച്ചു, അവിടെ ER മെംബ്രൺ സെറാമൈഡിൽ നീണ്ട (C18-C16) ശൃംഖല മാത്രമേ നിലനിൽക്കുന്നുള്ളൂ (ചിത്രം 3). sec31-1 ൽ, Gas1-GFP യുടെ ഭൂരിഭാഗവും ക്ലസ്റ്ററുകളിലാണ് കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നതെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, അതേസമയം sec31-1 ലെ Gas1-GFP നീളമുള്ള (C18-C16) നീളമുള്ള സെറാമൈഡ് ER മെംബ്രൺ ഉള്ള GhLag1 പ്രധാനമായും മുഴുവൻ ER മെംബ്രണിലും ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്ത് വിതരണം ചെയ്തിട്ടില്ല. കൃത്യമായി പറഞ്ഞാൽ, C26 സെറാമൈഡ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ക്ലസ്റ്ററിംഗ് നിർദ്ദിഷ്ട ERES മായി അടുത്ത ബന്ധമുള്ളതിനാൽ (ചിത്രം 1), ഈ പ്രക്രിയയിൽ ER കയറ്റുമതി പ്രോട്ടീൻ സംവിധാനത്തിന്റെ പ്രവർത്തനവും ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അടുത്തതായി അന്വേഷിച്ചു. GPI-AP ER കയറ്റുമതിക്കായി ഒരു പ്രത്യേക COPII സിസ്റ്റം ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഇത് GPI ആങ്കറിന്റെ ഗ്ലൈക്കൻ ഭാഗത്തിന്റെ Ted1 ന്റെ ഘടനാപരമായ പുനർനിർമ്മാണത്താൽ സജീവമായി നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു (30, 31). പിന്നീട് ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ കാർഗോ റിസപ്റ്റർ p24 കോംപ്ലക്സ് റീകോമ്പിനന്റ് GPI-ഗ്ലൈക്കനെ തിരിച്ചറിയുന്നു, ഇത് പ്രധാന COPII കാർഗോ ബൈൻഡിംഗ് സബ്യൂണിറ്റ് Sec24 ന്റെ ഒരു പ്രത്യേക ഐസോഫോമായ Lst1 നെ തിരഞ്ഞെടുത്ത് റിക്രൂട്ട് ചെയ്യുന്നു, ഇത് ഒരു GPI-AP-സമ്പന്നമായ COPII വെസിക്കിളുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നു (31-33). അതിനാൽ, ഈ ഒറ്റ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഇല്ലാതാക്കൽ (p24 സങ്കീർണ്ണ ഘടകം Emp24, GPI-ഗ്ലൈക്കൻ പുനർനിർമ്മാണ എൻസൈം Ted1, നിർദ്ദിഷ്ട COPII സബ്യൂണിറ്റ് Lst1) sec31-1 മ്യൂട്ടന്റ് സ്ട്രെയിനുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് ഒരു ഇരട്ട മ്യൂട്ടന്റ് ഞങ്ങൾ നിർമ്മിച്ചു, അവ പഠിച്ചു. Gas1-ക്ലസ്റ്റർ GFP രൂപപ്പെടുത്താൻ കഴിയുമോ (ചിത്രം 3). sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ എന്നിവയിൽ, Gas1-GFP പ്രധാനമായും അൺക്ലസ്റ്റർ ചെയ്യപ്പെടുകയും ER മെംബ്രണിലുടനീളം വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, മുമ്പ് sec31-1 GhLag1 ൽ കണ്ടതുപോലെ, sec31-1lst1Δ ൽ, Gas1-GFP sec31-1 പോലെ. ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ER മെംബ്രണിലെ C26 സെറാമൈഡിന്റെ സാന്നിധ്യത്തിന് പുറമേ, Gas1-GFP യുടെ ക്ലസ്റ്ററിംഗിനും p24 കോംപ്ലക്സുമായി ബന്ധിപ്പിക്കേണ്ടതുണ്ട്, കൂടാതെ നിർദ്ദിഷ്ട Lst1 റിക്രൂട്ട്മെന്റ് ആവശ്യമില്ല. തുടർന്ന്, ER മെംബ്രണിലെ സെറാമൈഡിന്റെ ചെയിൻ നീളം Gas1-GFP യെ p24 ലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് നിയന്ത്രിക്കാനുള്ള സാധ്യത ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, മെംബ്രണിലെ C18-C16 സെറാമൈഡിന്റെ സാന്നിധ്യം p24 കോംപ്ലക്സ് പുനർനിർമ്മിച്ച GPI-ഗ്ലൈക്കാനുകളെയോ GPI-AP യുമായി ബന്ധിപ്പിച്ച് GPI-AP കയറ്റുമതി ചെയ്യുന്നതിനെയോ ബാധിക്കുന്നില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. COPII സബ്‌ടൈപ്പ് Lst1 റിക്രൂട്ട് ചെയ്യുക (ചിത്രം S4C). അതിനാൽ, C26 സെറാമൈഡ്-ആശ്രിത ക്ലസ്റ്ററിംഗിന് വ്യത്യസ്ത ER കയറ്റുമതി പ്രോട്ടീൻ സംവിധാനങ്ങളുമായുള്ള പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ ആവശ്യമില്ല, പക്ഷേ ലിപിഡ് നീളത്താൽ നയിക്കപ്പെടുന്ന ഒരു ബദൽ സോർട്ടിംഗ് മെക്കാനിസത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. തുടർന്ന്, ER മെംബ്രണിലെ സെറാമൈഡ് അസൈൽ ചെയിൻ നീളം Gas1-GFP യുടെ സെലക്ടീവ് ERES ആയി ഫലപ്രദമായി വർഗ്ഗീകരിക്കുന്നതിന് പ്രധാനമാണോ എന്ന് ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു. ഷോർട്ട്-ചെയിൻ സെറാമൈഡ് ഉള്ള GhLag1 സ്ട്രെയിനിലെ Gas1, ER വിട്ട് പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്നതിനാൽ (ചിത്രം S5), സെറാമൈഡ് അസൈൽ ചെയിനിന്റെ നീളം അനുസരിച്ചാണ് സോർട്ടിംഗ് നടത്തുന്നതെങ്കിൽ, GhLag1 സ്ട്രെയിനിലെ Gas1 റീഡയറക്ട് ചെയ്യാനും ക്രോസ് ചെയ്യാനും കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ വിശ്വസിക്കുന്നു. ഒരേ മെംബ്രൺ ഉള്ള ERES സാധനങ്ങൾ.
(എ) GhLag1 ന്റെ കോശ സ്തരത്തിൽ പ്രധാനമായും ചെറിയ C18-C16 സെറാമൈഡുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, അതേസമയം Gas1-GFP യുടെ GPI ആങ്കറിൽ ഇപ്പോഴും വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് സെല്ലുകളുടെ അതേ C26 IPC ഉണ്ട്. മുകളിൽ: വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് (Wt) ന്റെയും GhLag1p സ്ട്രെയിനുകളുടെയും കോശ സ്തരത്തിലെ സെറാമൈഡിന്റെ അസൈൽ ചെയിൻ നീള വിശകലനം മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (MS) വഴി. ഡാറ്റ മൊത്തം സെറാമൈഡിന്റെ ശതമാനത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളുടെ ശരാശരി. പിശക് ബാർ = SD. ടു-ടെയിൽഡ് അൺപെയേർഡ് ടി ടെസ്റ്റ്. **** പി ＜0.0001. താഴെയുള്ള പാനൽ: വൈൽഡ്-ടൈപ്പിലും GhLag1p സ്ട്രെയിനുകളിലും പ്രകടിപ്പിച്ച Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ആങ്കറിൽ നിലവിലുള്ള IPC യുടെ അസൈൽ ചെയിൻ നീളത്തിന്റെ MS വിശകലനം. ഡാറ്റ മൊത്തം IPC സിഗ്നലിന്റെ ശതമാനത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. അഞ്ച് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളുടെ ശരാശരി. പിശക് ബാർ = SD. ടു-ടെയിൽഡ് അൺപെയേർഡ് ടി ടെസ്റ്റ്. ns, പ്രധാനമല്ല. P = 0.9134. (B) ഗാലക്ടോസ്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് Gas1-GFP പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ, sec31-1lst1Δ സെല്ലുകളുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ 37°C-ൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും 24°C-ന് ശേഷം പതിവ് ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പി നടത്തുന്നതിന് കൈമാറുകയും ചെയ്തു. വെളുത്ത അമ്പടയാളം: ER Gas1-GFP ക്ലസ്റ്റർ. തുറന്ന അമ്പടയാളം: ക്ലസ്റ്റേർഡ് Gas1-GFP മുഴുവൻ ER മെംബ്രണിലും വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു, ഇത് ER സ്വഭാവമുള്ള ന്യൂക്ലിയർ റിംഗ് സ്റ്റെയിനിംഗ് കാണിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 5μm. (C) (B)-ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന ഫോട്ടോമൈക്രോഗ്രാഫിന്റെ അളവ്. പങ്ക്റ്റേറ്റ് Gas1-GFP ഘടനയുള്ള കോശങ്ങളുടെ ശരാശരി ശതമാനം. മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, n≥300 സെല്ലുകൾ. പിശക് ബാർ = SD. ടു-ടെയിൽഡ് അൺപെയേർഡ് ടി ടെസ്റ്റ്. **** P ＜0.0001.
ഈ പ്രശ്നം നേരിട്ട് പരിഹരിക്കുന്നതിനായി, sec31-1 താപനില-സെൻസിറ്റീവ് മ്യൂട്ടന്റ് അല്ലീൽ (ചിത്രം 4, മൂവി S4) ഉപയോഗിച്ച് GhLag1-ൽ Gas1-GFP, Mid2-iRFP എന്നിവയുടെ SCLIM ദൃശ്യവൽക്കരണം ഞങ്ങൾ നടത്തി. ER 37°C-ൽ നിലനിർത്തുകയും തുടർന്ന് 24°C-ൽ പുറത്തുവിടുകയും ചെയ്ത ശേഷം, പരമ്പരാഗത മൈക്രോസ്കോപ്പുകൾ നിരീക്ഷിച്ചതുപോലെ, പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച Gas1-GFP-യുടെ ഭൂരിഭാഗവും ER മെംബ്രണിലുടനീളം ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്ത് വിതരണം ചെയ്തില്ല (ചിത്രം 4, A, B). കൂടാതെ, ERES-ന്റെ ഒരു വലിയ ശതമാനം (67%) അതിൽ സഹ-സ്ഥാപിതമായ രണ്ട് തരം കാർഗോകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 4D). ചിത്രം 4C-യുടെ 1 ഉം 2 ഉം പാനലുകൾ ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്ന Gas1-GFP, Mid2-GFP എന്നിവയുള്ള ERES-ന്റെ രണ്ട് സാധാരണ ഉദാഹരണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. കൂടാതെ, രണ്ട് സാധനങ്ങളും ഒരേ ERES-ലേക്ക് റിക്രൂട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടു (ചിത്രം 4E, പാനൽ 3, മൂവി S4). അതിനാൽ, ER മെംബ്രണിലെ സെറാമൈഡ് അസൈൽ ചെയിനിന്റെ നീളം ER പ്രോട്ടീൻ സംയോജനത്തിന്റെയും വർഗ്ഗീകരണത്തിന്റെയും ഒരു പ്രധാന നിർണ്ണായകമാണെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഗാലക്ടോസ്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് സ്രവങ്ങൾ, Gas1-GFP (GPI-AP, പച്ച) ഉം Mid2-iRFP (TMP, നീല) ഉം കോൺസ്റ്റിറ്റീവ് ERES-ലേബൽ ചെയ്ത Sec13-mCherry (ERES, മജന്ത) ഉം പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന Sec31-1 GhLag1 സെല്ലുകൾ 37°C-ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. 30 മിനിറ്റ് തുടരുക, സ്രവങ്ങൾ പുറത്തുവിടാൻ 24°C-ലേക്ക് താഴ്ത്തുക, 20 മിനിറ്റിനുശേഷം SCLIM ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രം എടുക്കുക. (A മുതൽ C വരെ) കാർഗോയും ERES ഉം അടയാളപ്പെടുത്തിയ 10 z-സെക്ഷനുകളുടെ പ്രതിനിധി 2D പ്രൊജക്ഷൻ ഇമേജുകൾ (A; സ്കെയിൽ ബാർ, 1μm) അല്ലെങ്കിൽ 3D സെൽ ഹെമിസ്ഫിയർ ഇമേജുകൾ (B, C; സ്കെയിൽ യൂണിറ്റ്, 0.45μm). (B)-ലെ താഴത്തെ പാനലും (C)-ലെ പാനലും ERES (മജന്ത)-ൽ [Gas1-GFP (ചാരനിറം) ഉം Mid2-iRFP (ഇളം നീല) ഉം] ഉള്ള സാധനങ്ങൾ മാത്രം പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നതിന് പ്രോസസ്സ് ചെയ്ത ചിത്രങ്ങൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു. (C) വെളുത്ത നിറച്ച അമ്പടയാളം: ERES, സാധനങ്ങൾ ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്നു. തുറന്ന അമ്പടയാളം: ERES-ൽ ഒരു ഇനം മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ. താഴത്തെ പാനൽ: തിരഞ്ഞെടുത്ത ERES-ൽ (C)-ൽ അടയാളപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്ന ഓവർലാപ്പിംഗ് സാധനങ്ങൾ (1 ഉം 2 ഉം) ഉണ്ട്. സ്കെയിൽ ബാർ, 100 nm. (D) (C)-ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന ഫോട്ടോമൈക്രോഗ്രാഫിന്റെ അളവ്. sec31-1, sec31-1 GhLag1 യൂണിറ്റുകളിൽ, ഒരു കാർഗോ (Gas1-GFP അല്ലെങ്കിൽ Mid2-iRFP) മാത്രമേ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുള്ളൂ, കൂടാതെ ഒറ്റപ്പെട്ട കാർഗോയ്ക്കും ഓവർലാപ്പിംഗ് കാർഗോയ്ക്കുമുള്ള ERES-ന്റെ ശരാശരി ശതമാനം. മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, 54 സെല്ലുകളിൽ n ​​= 432 (sec31-1) ഉം 47 സെല്ലുകളിൽ n ​​= 430 (sec31-1 GhLag1). പിശക് ബാർ = SD. രണ്ട്-ടെയിൽഡ് അൺപെയേർഡ് ടി ടെസ്റ്റ്. *** P = 0.0002 (sec31-1) ഉം ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C) ൽ അടയാളപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്ന ഓവർലാപ്പിംഗ് കാർഗോ (3) ഉള്ള തിരഞ്ഞെടുത്ത ERES ന്റെ 3D ചിത്രം. Gas1-GFP (പച്ച) ഉം Mid2-iRFP (നീല) ഉം ഒരേ വശത്ത് നിന്ന് ERES (മജന്ത) നെ സമീപിച്ച് അതേ ERES നിയന്ത്രിത പ്രദേശത്ത് തന്നെ തുടരുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 100 nm.
ലിപിഡ് അധിഷ്ഠിത പ്രോട്ടീൻ കാർഗോകളെ സ്രവിക്കുന്ന പാതയിൽ സെലക്ടീവ് എക്‌സ്‌പോർട്ട് സൈറ്റുകളായി തരംതിരിച്ചിരിക്കുന്നു എന്നതിന് നേരിട്ടുള്ള ഇൻ വിവോ തെളിവുകൾ ഈ പഠനം നൽകുന്നു, കൂടാതെ വർഗ്ഗീകരണ സെലക്റ്റിവിറ്റിക്ക് അസൈൽ ചെയിൻ നീളത്തിന്റെ പ്രാധാന്യം വെളിപ്പെടുത്തുന്നു. SCLIM എന്ന ശക്തവും അത്യാധുനികവുമായ മൈക്രോസ്കോപ്പി സാങ്കേതികത ഉപയോഗിച്ച്, യീസ്റ്റിൽ പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച Gas1-GFP (വളരെ നീളമുള്ള അസൈൽ ചെയിൻ (C26) സെറാമൈഡ് ലിപിഡ് ഭാഗമുള്ള ഒരു പ്രധാന പ്ലാസ്മ മെംബ്രൺ GPI-AP) ഞങ്ങൾ പ്രദർശിപ്പിച്ചു. ഡിസ്‌ക്രീറ്റ് ER-കളിൽ ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന പ്രദേശങ്ങൾ നിർദ്ദിഷ്ട ERES-മായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, അതേസമയം ട്രാൻസ്‌മെംബ്രെയ്ൻ സ്രവിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകൾ ER മെംബ്രണിലുടനീളം വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 1). കൂടാതെ, ഈ രണ്ട് തരം സാധനങ്ങളും വ്യത്യസ്ത ERES-ലേക്ക് തിരഞ്ഞെടുത്ത് പ്രവേശിക്കുന്നു (ചിത്രം 2). മെംബ്രണിലെ സെല്ലുലാർ സെറാമൈഡിന്റെ അസൈൽ ചെയിൻ നീളം C26 ൽ നിന്ന് C18-C16 ആയി കുറയുന്നു, Gas1-GFP ക്ലസ്റ്റർ ഡിസ്‌ക്രീറ്റ് ER ​​മേഖലയിലേക്ക് തടസ്സപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ Gas1-GFP അതേ ERES വഴി ട്രാൻസ്‌മെംബ്രെയ്ൻ പ്രോട്ടീനുമായി ER വിടാൻ വഴിതിരിച്ചുവിടുന്നു (ചിത്രം 3 ഉം ചിത്രം 3 ഉം). 4).
ER-ൽ നിന്ന് പുറത്തുകടക്കാൻ GPI-AP ഒരു പ്രത്യേക പ്രോട്ടീൻ സംവിധാനം ഉപയോഗിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, C26 സെറാമൈഡ്-ആശ്രിത വേർതിരിവ് ERES സ്പെഷ്യലൈസേഷനിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാവുന്ന ഡിഫറൻഷ്യൽ പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളെ ആശ്രയിക്കുന്നില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രങ്ങൾ S4, S5). പകരം, ലിപിഡ് അധിഷ്ഠിത പ്രോട്ടീൻ ക്ലസ്റ്ററിംഗും മറ്റ് കാർഗോകളുടെ തുടർന്നുള്ള ഒഴിവാക്കലും വഴി നയിക്കപ്പെടുന്ന ഒരു ബദൽ വർഗ്ഗീകരണ സംവിധാനത്തെ ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. ഒരു പ്രത്യേക ERES-മായി ബന്ധപ്പെട്ട Gas1-GFP മേഖലയിലോ ക്ലസ്റ്ററിലോ ട്രാൻസ്‌മെംബ്രെൻ സ്രവിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ Mid2-iRFP ഇല്ലെന്ന് ഞങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് C26 സെറാമൈഡ്-ആശ്രിത GPI-AP ക്ലസ്റ്റർ പ്രസക്തമായ ERES-ലേക്ക് പ്രവേശിക്കാൻ സഹായിക്കുമെന്നും അതേ സമയം, ട്രാൻസ്‌മെംബ്രെനെ ഒഴിവാക്കുമെന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നു. സ്രവങ്ങൾ ഈ പ്രത്യേക ERES-ലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്നു (ചിത്രങ്ങൾ 1 ഉം 2 ഉം). ഇതിനു വിപരീതമായി, ER മെംബ്രണിലെ C18-C16 സെറാമൈഡുകളുടെ സാന്നിധ്യം GPI-AP-യെ പ്രദേശങ്ങളോ ക്ലസ്റ്ററുകളോ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് കാരണമാകുന്നില്ല, അതിനാൽ അവ ട്രാൻസ്‌മെംബ്രെൻ സ്രവിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളെ അതേ ERES-ലേക്ക് ഒഴിവാക്കുകയോ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുകയോ ചെയ്യുന്നില്ല (ചിത്രങ്ങൾ 3 ഉം 4 ഉം). . അതിനാൽ, നിർദ്ദിഷ്ട ERES-മായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ ക്ലസ്റ്ററിംഗ് സുഗമമാക്കുന്നതിലൂടെ C26 സെറാമൈഡ് വേർതിരിക്കലും വർഗ്ഗീകരണവും നയിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.
ഒരു പ്രത്യേക ER ഏരിയയിലേക്ക് C26 സെറാമൈഡിനെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ഈ ക്ലസ്റ്ററിംഗ് എങ്ങനെ നേടാം? മെംബ്രൻ സെറാമൈഡ് പാർശ്വസ്ഥമായി വേർപെടുത്തുന്ന പ്രവണത, ചെറുതും അപൂരിതവുമായ ഗ്ലിസറോലിപ്പിഡുകൾ അടങ്ങിയ ER മെംബ്രണിന്റെ കൂടുതൽ ക്രമരഹിതമായ ലിപിഡ് പരിതസ്ഥിതിയിൽ GPI-AP, C26 സെറാമൈഡ് എന്നിവ ചെറുതും തൽക്ഷണം ക്രമീകരിച്ചതുമായ ലിപിഡുകൾ രൂപപ്പെടുത്താൻ കാരണമായേക്കാം. ഗുണനിലവാര ക്ലസ്റ്ററുകൾ (17, 18). p24 കോംപ്ലക്സുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചതിനുശേഷം ഈ ചെറിയ താൽക്കാലിക ക്ലസ്റ്ററുകളെ കൂടുതൽ വലുതും കൂടുതൽ സ്ഥിരതയുള്ളതുമായ ക്ലസ്റ്ററുകളായി സംയോജിപ്പിക്കാൻ കഴിയും (34). ഇതിന് അനുസൃതമായി, വലിയ ദൃശ്യ ക്ലസ്റ്ററുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് C26 Gas1-GFP p24 കോംപ്ലക്സുമായി സംവദിക്കേണ്ടതുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിച്ചു (ചിത്രം 3). p24 കോംപ്ലക്സ് യീസ്റ്റിലെ നാല് വ്യത്യസ്ത p24 ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ പ്രോട്ടീനുകൾ ചേർന്ന ഒരു ഹെറ്ററോസൈഗസ് ഒലിഗോമറാണ് (35), ഇത് മൾട്ടിവാലന്റ് ബൈൻഡിംഗ് നൽകുന്നു, ഇത് ചെറിയ GPI-AP ക്ലസ്റ്ററുകളുടെ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം, അതുവഴി വലിയ സ്റ്റേബിൾ ക്ലസ്റ്റർ സൃഷ്ടിക്കുന്നു (34). സസ്തനികളുടെ ധ്രുവീകരിക്കപ്പെട്ട എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളിലെ ഗോൾഗി ഗതാഗത സമയത്ത് കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, GPI-AP-കളുടെ പ്രോട്ടീൻ എക്ടോഡൊമൈനുകൾ തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനവും അവയുടെ സംയോജനത്തിന് കാരണമായേക്കാം (36). എന്നിരുന്നാലും, ER മെംബ്രണിൽ C18-C16 സെറാമൈഡ് ഉണ്ടാകുമ്പോൾ, p24 കോംപ്ലക്സ് Gas1-GFP-യുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുമ്പോൾ, വലിയ പ്രത്യേക ക്ലസ്റ്ററുകൾ രൂപപ്പെടില്ല. അടിസ്ഥാന സംവിധാനം ലോംഗ് അസൈൽ ചെയിൻ സെറാമൈഡിന്റെ പ്രത്യേക ഭൗതിക, രാസ ഗുണങ്ങളെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കും. കൃത്രിമ മെംബ്രണുകളുടെ ബയോഫിസിക്കൽ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് ലോംഗ് (C24) ഉം ഷോർട്ട് (C18-C16) അസൈൽ ചെയിൻ സെറാമൈഡുകളും ഫേസ് വേർതിരിവിന് കാരണമാകുമെങ്കിലും, ലോംഗ് അസൈൽ ചെയിൻ സെറാമൈഡുകൾക്ക് (C24) മാത്രമേ ഉയർന്ന വക്രതയും ഫിലിം ബെൻഡിംഗും പ്രോത്സാഹിപ്പിച്ച് ഫിലിമിനെ പുനർനിർമ്മിക്കാൻ കഴിയൂ എന്നാണ്. പരസ്പര റഫറൻസിലൂടെ (17, 37, 38). Emp24 ന്റെ മനുഷ്യ ഹോമോലോഗായ TMED2 ന്റെ ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ ഹെലിക്സ്, സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ലോബ്യൂളുകളിൽ C18 സെറാമൈഡ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള സ്ഫിംഗോമൈലിനുമായി തിരഞ്ഞെടുത്ത് ഇടപഴകുന്നുവെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് (39). മോളിക്യുലാർ ഡൈനാമിക്സ് (MD) സിമുലേഷനുകൾ ഉപയോഗിച്ച്, C18 ഉം C26 സെറാമൈഡുകളും Emp24 ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ ഹെലിക്സിന്റെ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ലോബ്യൂളുകൾക്ക് ചുറ്റും അടിഞ്ഞുകൂടുന്നുവെന്നും അവയ്ക്ക് സമാനമായ മുൻഗണനകളുണ്ടെന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം S6). Emp24 ന്റെ ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ ഹെലിക്സ് മെംബ്രണിലെ ലിപിഡുകളുടെ അസമമായ വിതരണത്തിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാമെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. ഇത് സസ്തനി കോശങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒരു സമീപകാല ഫലമാണ്. സമാനമായ MD സിമുലേഷനുകളും ഈഥർ ലിപിഡുകളുടെ സാന്നിധ്യം കാണിക്കുന്നു (40). അതിനാൽ, ER26 ന്റെ രണ്ട് ലോബ്യൂളുകളിലെ C26 സെറാമൈഡ് പ്രാദേശികമായി സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു. ലുമിനൽ ലോബ്യൂളുകളിലെ GPI-AP നേരിട്ട് മൾട്ടിവാലന്റ് p24 മായി ബന്ധിപ്പിക്കപ്പെടുകയും സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ലോബ്യൂളുകളിൽ p24 ന് ചുറ്റും C26 സെറാമൈഡിന്റെ ശേഖരണം നടക്കുകയും ചെയ്യുമ്പോൾ, അത് അനുബന്ധ പ്രോട്ടീൻ സംയോജനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുകയും വിരലുകളിലൂടെ മെംബ്രൺ വക്രത സൃഷ്ടിക്കപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു (41), ഇത് GPI-AP ERES ന് സമീപമുള്ള വ്യതിരിക്ത മേഖലകളായി വേർപെടുത്താൻ കാരണമാകുന്നു, ഇത് ER മെംബ്രണിന്റെ ഉയർന്ന വളഞ്ഞ പ്രദേശങ്ങളെയും അനുകൂലിക്കുന്നു (42). മുൻ റിപ്പോർട്ടുകൾ നിർദ്ദിഷ്ട സംവിധാനത്തെ പിന്തുണച്ചു (43, 44). പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിലെ ഒലിഗോലെക്റ്റിനുകൾ, രോഗകാരികൾ അല്ലെങ്കിൽ സെറാമൈഡ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഗ്ലൈക്കോസ്ഫിംഗോലിപ്പിഡുകൾ (GSL) എന്നിവയിലേക്കുള്ള ആന്റിബോഡികളുടെ മൾട്ടിവാലന്റ് ബൈൻഡിംഗ് വലിയ GSL സംയോജനത്തിന് കാരണമാകുന്നു, ഘട്ടം വേർതിരിക്കൽ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും മെംബ്രൺ രൂപഭേദം, ആന്തരികവൽക്കരണം എന്നിവയ്ക്ക് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്നു (44). ഇവാബുച്ചി മുതലായവ (43) നീളമുള്ള (C24) എന്നാൽ ചെറുതല്ലാത്ത (C16) അസൈൽ ശൃംഖലകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ, GSL ലാക്ടോസിൽസെറാമൈഡുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന മൾട്ടിവാലന്റ് ലിഗാൻഡ് വലിയ ക്ലസ്റ്ററുകളുടെ രൂപീകരണത്തിനും മെംബ്രൻ ഇൻവാജിനേഷനും കാരണമായി, ലഘുലേഖകളിലെ സൈറ്റോപ്ലാസം ലിൻ-മധ്യസ്ഥതയുള്ള സിഗ്നൽ ട്രാൻസ്ഡക്ഷൻ കപ്പിൾഡ് ന്യൂട്രോഫിലുകളിലെ അസൈൽ ശൃംഖലകളാൽ ഇന്റർഡിജിറ്റേറ്റ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു എന്ന് കണ്ടെത്തി.
സസ്തനികളിലെ ധ്രുവീകരിക്കപ്പെട്ട എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളിൽ, അഗ്ര പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിന്റെ തലത്തിലേക്കുള്ള ആന്റി-ഗോൾഗി നെറ്റ്‌വർക്കിന്റെ (TGN) സാന്ദ്രത GPI-AP യുടെ വേർതിരിക്കലും തരംതിരിക്കലും നിയന്ത്രിക്കുന്നു (10, 45). ഈ സംയോജനം GPI-AP ഒലിഗോമെറൈസേഷൻ വഴി നയിക്കപ്പെടുന്നു (36), പക്ഷേ ഇത് യീസ്റ്റിൽ നാം കാണുന്ന സെറാമൈഡ് ശൃംഖലയുടെ നീളത്തെയും ആശ്രയിച്ചിരിക്കും. സസ്തനികളിലെ GPI-AP ന് ഈഥർ ലിപിഡ് അധിഷ്ഠിത ആങ്കർ ഉണ്ടെങ്കിലും, അതിന്റെ രാസഘടന വളരെ നീളമുള്ള അസൈൽ ചെയിൻ സെറാമൈഡിൽ നിന്ന് വളരെ വ്യത്യസ്തമാണെങ്കിലും, രണ്ട് ലിപിഡുകൾക്കും പരിണാമപരമായി സമാനമായ ഭൗതികവും രാസപരവുമായ ഗുണങ്ങളും പ്രവർത്തനങ്ങളും ഉണ്ടെന്ന് അടുത്തിടെ നടത്തിയ ഒരു പഠനം കണ്ടെത്തി (40). അതിനാൽ, സസ്തനികളിലെ ഈഥർ ലിപിഡ് ഭാഗം യീസ്റ്റിലെ C26 സെറാമൈഡിന് സമാനമായിരിക്കാം, കൂടാതെ GPI-AP സംയോജനവും തരംതിരിക്കലും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് മെംബ്രണിലെ ലോംഗ്-ചെയിൻ സെറാമൈഡുമായി ബന്ധപ്പെടുക എന്നതാണ് ഇതിന്റെ പങ്ക്. ഈ സാധ്യത ഇപ്പോഴും നേരിട്ട് പരീക്ഷിക്കേണ്ടതുണ്ടെങ്കിലും, ഗോൾഗി ശരീരത്തിലേക്കുള്ള നീണ്ട അസൈൽ ചെയിൻ സെറാമൈഡിന്റെ ഗതാഗതം സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ട്രാൻസ്ഫർ പ്രോട്ടീനുകളാൽ നടത്തപ്പെടുന്നില്ല, മറിച്ച് യീസ്റ്റ് പോലുള്ള GPI ആങ്കറുകളുടെ സമന്വയത്തെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു എന്ന് മുൻ കണ്ടെത്തലുകൾ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. അതിനാൽ, പരിണാമപരമായ യാഥാസ്ഥിതിക സംവിധാനത്തിന് ഒരേ ട്രാൻസ്പോർട്ട് വെസിക്കിളിൽ വളരെ നീണ്ട അസൈൽ ചെയിൻ സെറാമൈഡും GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ഉം തിരഞ്ഞെടുത്ത് സഹ-ഗതാഗതം നടത്താൻ കഴിയുമെന്ന് തോന്നുന്നു.
യീസ്റ്റിലും സസ്തനികളിലെ ധ്രുവീകരിക്കപ്പെട്ട എപ്പിത്തീലിയൽ സെൽ സിസ്റ്റങ്ങളിലും, GPI-AP സംയോജനവും മറ്റ് പ്ലാസ്മ മെംബ്രൻ പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്നുള്ള വേർപിരിയലും എല്ലാം കോശ ഉപരിതലത്തിൽ എത്തുന്നതിനു മുമ്പാണ് സംഭവിക്കുന്നത്. സസ്തനികളിലെ ധ്രുവീകരിക്കപ്പെട്ട എപ്പിത്തീലിയൽ കോശങ്ങളുടെ TGN-ൽ, GPI-AP-കളെ അഗ്ര പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിലേക്ക് തിരഞ്ഞെടുത്ത വർഗ്ഗീകരണത്തിന് GPI-AP ക്ലസ്റ്ററിംഗ് ആവശ്യമാണെന്ന് പാലാഡിനോ തുടങ്ങിയവർ (48) കണ്ടെത്തി, മാത്രമല്ല GPI-AP-കളുടെ ക്ലസ്റ്ററിംഗ് ഓർഗനൈസേഷനെയും അതിന്റെ ജൈവിക പ്രവർത്തനത്തെയും നിയന്ത്രിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. സെൽ ഉപരിതലം. യീസ്റ്റിൽ, ER-ലെ C26 സെറാമൈഡ്-ആശ്രിത GPI-AP ക്ലസ്റ്ററിന് പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിലെ GPI-AP-യുടെ ക്ലസ്റ്റർ ഓർഗനൈസേഷനും പ്രവർത്തനപരമായ പ്രവർത്തനവും നിയന്ത്രിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ പഠനം കാണിച്ചു (24, 49). ഈ മാതൃകയ്ക്ക് അനുസൃതമായി, GhLag1 കോശങ്ങൾക്ക് GPI ഇൻഹിബിറ്ററുകളോടോ കോശഭിത്തി സമഗ്രതയെ ബാധിക്കുന്ന മരുന്നുകളോടോ അലർജിയുണ്ട് (28), കൂടാതെ യീസ്റ്റ് കോശങ്ങളുടെ ഇണചേരലിൽ പ്രൊജക്റ്റ് ചെയ്ത ടിപ്പ് സെറാമൈഡിന്റെ ഫങ്ഷണൽ Gas1-GFP ക്ലസ്റ്ററുകളുടെ ആവശ്യകത (49) G യെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു hLag1 കോശങ്ങളുടെ സാധ്യമായ ഫിസിയോളജിക്കൽ അനന്തരഫലങ്ങൾ. GPI-AP പിശക്. എന്നിരുന്നാലും, ലിപിഡ് നീളത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒരു സോർട്ടിംഗ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് ER-ൽ നിന്ന് കോശ പ്രതലത്തിന്റെ പ്രവർത്തനപരമായ ഓർഗനൈസേഷൻ പ്രോഗ്രാം ചെയ്തിട്ടുണ്ടോ എന്ന് കൂടുതൽ പരിശോധിക്കുന്നത് ഞങ്ങളുടെ ഭാവി ഗവേഷണ വിഷയമായിരിക്കും.
ഈ കൃതിയിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന സാക്കറോമൈസിസ് സെറിവിസിയ സ്ട്രെയിനുകൾ പട്ടിക S1-ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു. തത്സമയ സെൽ ഇമേജിംഗിനായി SCLIM-ന്റെ MMY1583, MMY1635 സ്ട്രെയിനുകൾ W303-ന്റെ പശ്ചാത്തലത്തിലാണ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്. ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ ടാഗ് ഉപയോഗിച്ച് Sec13-mCherry പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഈ സ്ട്രെയിനുകൾ pFA6a പ്ലാസ്മിഡ് ഉപയോഗിച്ച് പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (PCR) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള രീതി ഉപയോഗിച്ചാണ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത് (23). GAL1 പ്രൊമോട്ടറുടെ നിയന്ത്രണത്തിൽ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്ന Mid2-iRFP പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന സ്ട്രെയിൻ ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നു. pKTiRFP-KAN വെക്റ്ററിൽ നിന്നുള്ള iRFP-KanMx സീക്വൻസിന്റെ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ (E. O'Shea യുടെ സമ്മാനം, ആഡ്ജെൻ പ്ലാസ്മിഡ് നമ്പർ 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ഗവേഷണ ഉറവിട ഐഡന്റിഫയർ (RRID): Addgene_64687) കൂടാതെ എൻഡോജെനസ് മിഡ്2-ന്റെ സി-ടെർമിനസിൽ ചേർത്തു. Mid2-iRFP ജീനോം സീക്വൻസ് ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്ത് GAL1 പ്രൊമോട്ടറിലേക്ക് ക്ലോൺ ചെയ്ത ശേഷം, അത് ഇന്റഗ്രേഷൻ പ്ലാസ്മിഡ് pRS306 ന്റെ Not I-Sac I സൈറ്റിലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ചു. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന പ്ലാസ്മിഡ് pRGS7, URA3 ലോക്കസിലേക്ക് സംയോജിപ്പിക്കുന്നതിന് Pst I ഉപയോഗിച്ച് ലീനിയറൈസ് ചെയ്തു.
സെൻട്രോമിയർ (CEN) പ്ലാസ്മിഡിൽ, GAL1 പ്രൊമോട്ടറുടെ നിയന്ത്രണത്തിലാണ് Gas1-GFP ഫ്യൂഷൻ ജീൻ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നത്, അത് ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നു. pRS416-GAS1-GFP പ്ലാസ്മിഡിൽ (24) (L. പോപ്പോളോയുടെ സമ്മാനം) നിന്ന് PCR വഴി Gas1-GFP ശ്രേണി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും CEN പ്ലാസ്മിഡ് pBEVY-GL LEU2 (C യുടെ സമ്മാനം) ന്റെ Xma I–Xho I സൈറ്റിലേക്ക് ക്ലോൺ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. മില്ലർ; ആഡ്ജീൻ പ്ലാസ്മിഡ് നമ്പർ 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: ആഡ്ജീൻ_51225). തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന പ്ലാസ്മിഡിന് pRGS6 എന്ന് പേരിട്ടു. pBEVY-GL LEU2 വെക്റ്ററിന്റെ GAL1 പ്രൊമോട്ടറുടെ നിയന്ത്രണത്തിലാണ് Axl2-GFP ഫ്യൂഷൻ ജീൻ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നത്, അതിന്റെ നിർമ്മാണം ഇപ്രകാരമാണ്. PCR വഴി pRS304-p2HSE-Axl2-GFP പ്ലാസ്മിഡിൽ (23) നിന്ന് Axl2-GFP ശ്രേണി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും pBEVY-GL LEU2 വെക്റ്ററിന്റെ ബാം HI-Pst I സൈറ്റിലേക്ക് ക്ലോൺ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന പ്ലാസ്മിഡിന് pRGS12 എന്ന് പേരിട്ടു. ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുടെ ശ്രേണി പട്ടിക S2 ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു.
ഈ സ്ട്രെയിനിൽ 0.2% അഡിനൈനും 2% ഗ്ലൂക്കോസും [YP-ഡെക്‌സ്ട്രോസ് (YPD)], 2% റാഫിനോസ് [YP-റാഫിനോസ്] സമ്പുഷ്ടമായ യീസ്റ്റ് സത്ത് പ്രോട്ടീൻ p (YP) മീഡിയം (1% യീസ്റ്റ് സത്ത്, 2% പ്രോട്ടീൻ ept). (YPR)] അല്ലെങ്കിൽ 2% ഗാലക്ടോസ് [YP-ഗാലക്ടോസ് (YPG)] എന്നിവ കാർബൺ സ്രോതസ്സായി ചേർത്തു, അല്ലെങ്കിൽ ഒരു സിന്തറ്റിക് മിനിമൽ മീഡിയത്തിൽ (0.15% യീസ്റ്റ് നൈട്രജൻ ബേസും 0.5% അമോണിയം സൾഫേറ്റും) പോഷകാഹാരത്തിന് ആവശ്യമായ ഉചിതമായ അമിനോ ആസിഡുകളും ബേസുകളും സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്തു, കൂടാതെ കാർബൺ സ്രോതസ്സായി 2% ഗ്ലൂക്കോസ് (സിന്തറ്റിക് ഗ്ലൂക്കോസ് മിനിമൽ മീഡിയം) അല്ലെങ്കിൽ 2% ഗാലക്ടോസ് (സിന്തറ്റിക് ഗാലക്ടോസ് മിനിമൽ മീഡിയം) എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.
തത്സമയ ഇമേജിംഗിനായി, GAL1 പ്രൊമോട്ടറിന് കീഴിൽ ഘടന പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന താപനില-സെൻസിറ്റീവ് sec31-1 മ്യൂട്ടന്റ് സെല്ലുകളെ YPR മീഡിയത്തിൽ 24°C മുതൽ മിഡ്-ലോഗ് ഘട്ടം വരെ രാത്രിയിൽ വളർത്തി. 24°C മുതൽ 1 മണിക്കൂർ വരെ YPG-യിൽ ഇൻഡക്ഷൻ ചെയ്ത ശേഷം, കോശങ്ങളെ 37°C-ൽ SG-യിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് സ്രവ ബ്ലോക്കിൽ നിന്ന് പുറത്തുവിടാൻ 24°C-ലേക്ക് മാറ്റി. ഒരു ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡിൽ കോശങ്ങൾ ഉറപ്പിക്കാൻ കോൺകനാവാലിൻ എ ഉപയോഗിക്കുകയും SCLIM ചിത്രീകരിക്കുകയും ചെയ്തു. ഒളിമ്പസ് IX-71 ഇൻവെർട്ടഡ് ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പ്, UPlanSApo 100×1.4 ന്യൂമറിക്കൽ അപ്പർച്ചർ ഓയിൽ ലെൻസ് (ഒളിമ്പസ്), ഹൈ-സ്പീഡ്, ഹൈ-സിഗ്നൽ-ടു-നോയ്‌സ് റേഷ്യോ റൊട്ടേറ്റിംഗ് ഡിസ്ക് കൺഫോക്കൽ സ്കാനർ (യോകോഗാവ ഇലക്ട്രിക്), കസ്റ്റം സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ, കസ്റ്റം കൂളിംഗ് എന്നിവയുടെ സംയോജനമാണ് SCLIM. സിസ്റ്റത്തിന്റെ ഇമേജ് ഇന്റൻസിഫയറിന് (ഹമാമാറ്റ്സു ഫോട്ടോണിക്സ്) ×266.7 എന്ന അന്തിമ മാഗ്നിഫിക്കേഷനോടുകൂടിയ ഒരു മാഗ്നിഫൈയിംഗ് ലെൻസ് സിസ്റ്റവും ഇലക്ട്രോണുകളെ ഗുണിക്കുന്ന ഒരു ചാർജ്-കപ്പിൾഡ് ഡിവൈസ് ക്യാമറയും നൽകാൻ കഴിയും (ഹമാമാറ്റ്സു ഫോട്ടോണിക്സ്) (21). കസ്റ്റം സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (യോകോഗാവ ഇലക്ട്രിക്) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഇമേജ് ഏറ്റെടുക്കൽ നടത്തുന്നത്. 3D ഇമേജുകൾക്കായി, ഒബ്ജക്റ്റീവ് ലെൻസിനെ ലംബമായി വൈബ്രേറ്റ് ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ ഒരു കസ്റ്റം-നിർമ്മിത പീസോ ഇലക്ട്രിക് ആക്യുവേറ്റർ ഉപയോഗിച്ചു, കൂടാതെ ഒരു സ്റ്റാക്കിൽ 100 ​​nm അകലത്തിൽ ഒപ്റ്റിക്കൽ ഭാഗങ്ങൾ ശേഖരിച്ചു. Z-സ്റ്റാക്ക് ഇമേജ് 3D വോക്സൽ ഡാറ്റയായി പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ കറങ്ങുന്ന ഡിസ്ക് കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന സൈദ്ധാന്തിക പോയിന്റ് സ്പ്രെഡ് ഫംഗ്ഷൻ വോളോസിറ്റി സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (പെർക്കിൻഎൽമർ) ഡീകൺവല്യൂഷൻ പ്രോസസ്സിംഗിനായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. വോളോസിറ്റി സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് സഹ-സ്ഥാന വിശകലനത്തിനുള്ള ത്രെഷോൾഡ് സ്വയമേവ അളന്നു, കാർഗോ ഉൾപ്പെടെയുള്ള ERES അളന്നു. മെറ്റാമോർഫ് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (മോളിക്യുലാർ ഉപകരണങ്ങൾ) ഉപയോഗിച്ച് ലൈൻ സ്കാൻ വിശകലനം നടത്തി.
സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ സിഗ്നിഫിക്കൻസ് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഗ്രാഫ്പാഡ് പ്രിസം സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിക്കുക. ടു-ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി-ടെസ്റ്റിനും സാധാരണ വൺ-വേ അനാലിസിസ് ഓഫ് വേരിയൻസ് (ANOVA) ടെസ്റ്റിനും, ഗ്രൂപ്പുകൾ തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസങ്ങൾ P <0.05 (*)-ൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നതായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു.
ഗ്യാസ്1-ജിഎഫ്‌പിയുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്‌കോപ്പിക്കായി, ലോഗ് ഫേസ് സെല്ലുകൾ രാത്രി മുഴുവൻ വൈപിഡിയിൽ വളർത്തി സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ശേഖരിച്ചു, ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർ ചെയ്ത സലൈൻ ഉപയോഗിച്ച് രണ്ടുതവണ കഴുകി, കുറഞ്ഞത് 15 മിനിറ്റെങ്കിലും ഐസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ മൈക്രോസ്കോപ്പിന് കീഴിൽ ചെക്ക് (24) ഉപയോഗിച്ചു. ഒബ്ജക്റ്റീവ് ലെൻസ്, എൽ5 (ജിഎഫ്‌പി) ഫിൽട്ടർ, ഹമാമത്സു ക്യാമറ, ആപ്ലിക്കേഷൻ സ്യൂട്ട് എക്‌സ് (എൽഎഎസ് എക്സ്) സോഫ്റ്റ്‌വെയർ എന്നിവ സജ്ജീകരിച്ച ലെയ്‌ക ഡിഎംഐ8 മൈക്രോസ്‌കോപ്പ് (എച്ച്സിഎക്സ് പിഎൽ എപിഒ 1003/1.40 ഓയിൽ പിഎച്ച്3 സിഎസ്) ആണ് ഏറ്റെടുക്കലിനായി ഉപയോഗിച്ചത്.
65°C താപനിലയിൽ 10 മിനിറ്റ് SDS സാമ്പിൾ ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിളുകൾ ഡീനാച്ചർ ചെയ്തു, തുടർന്ന് SDS-പോളിയക്രിലാമൈഡ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് (PAGE) ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചു. ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് വിശകലനത്തിനായി, ഓരോ ലെയ്‌നിലും 10 μl സാമ്പിൾ ലോഡ് ചെയ്തു. പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡി: 1:3000 നേർപ്പിക്കലിൽ മുയൽ പോളിക്ലോണൽ ആന്റി-ഗ്യാസ്1, 1:500 നേർപ്പിക്കലിൽ മുയൽ പോളിക്ലോണൽ ആന്റി-എംപി24, 1:3000 നേർപ്പിക്കലിൽ മുയൽ പോളിക്ലോണൽ ആന്റി-ജിഎഫ്‌പി (എച്ച്. റീസ്മാന്റെ സമ്മാനം) എന്നിവ ഉപയോഗിക്കുക. 1:5000 നേർപ്പിക്കലിൽ മൗസ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റി-പിജികെ1 ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ചു (ജെ. ഡി ലാ ക്രൂസിൽ നിന്നുള്ള സമ്മാനം). ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡി: 1:3000 നേർപ്പിക്കലിൽ (പിയേഴ്സ്) ഉപയോഗിക്കുന്ന ഹോർസ്റാഡിഷ് പെറോക്സിഡേസ് (HRP) സംയോജിത ആട് ആന്റി-മുയൽ ഇമ്യൂണോഗ്ലോബുലിൻ G (IgG). HRP-സംയോജിത ആട് ആന്റി-മൗസ് IgG 1:3000 (പിയേഴ്സ്) നേർപ്പിക്കലിൽ ഉപയോഗിച്ചു. സൂപ്പർസിഗ്നൽ വെസ്റ്റ് പിക്കോ റീജന്റ് (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ന്റെ കെമിലുമിനെസെൻസ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണ മേഖല നിരീക്ഷിച്ചു.
(31) ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ ER ഫ്രാക്ഷനിൽ ഒരു സ്വാഭാവിക ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷൻ പരീക്ഷണം നടത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, 100 ഒപ്റ്റിക്കൽ ഡെൻസിറ്റിയിൽ രണ്ടുതവണ 600 nm (OD600) ൽ TNE ബഫർ [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ഫിനൈൽമെഥൈൽസൾഫോണൈൽ ഫ്ലൂറൈഡ്, പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്റർ മിശ്രിതം) ഉപയോഗിച്ച് യീസ്റ്റ് സെല്ലുകൾ കഴുകുക. ഗ്ലാസ് ബീഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇത് തകർത്തു, തുടർന്ന് സെൽ അവശിഷ്ടങ്ങളും ഗ്ലാസ് ബീഡുകളും സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി നീക്കം ചെയ്തു. തുടർന്ന് സൂപ്പർനേറ്റന്റിനെ 17,000 ഗ്രാം താപനിലയിൽ 15 മിനിറ്റ് 4°C ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. പെല്ലറ്റ് TNE യിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു, ഡിജിറ്റലിസ് സാപ്പോണിൻ 1% എന്ന അന്തിമ സാന്ദ്രതയിലേക്ക് ചേർത്തു. സസ്പെൻഷൻ 4°C ൽ ഭ്രമണം ചെയ്തുകൊണ്ട് 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് ലയിക്കാത്ത ഘടകങ്ങൾ 4°C ൽ 13,000 ഗ്രാം താപനിലയിൽ 60 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് വഴി നീക്കം ചെയ്തു. ഗ്യാസ്1-ജിഎഫ്പി ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷനായി, ആദ്യം സാമ്പിൾ 4°C-ൽ ശൂന്യമായ അഗറോസ് ബീഡുകൾ (ക്രോമോടെക്) ഉപയോഗിച്ച് 1 മണിക്കൂർ പ്രീ-ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് 4°C-ൽ GFP-Trap_A (ക്രോമോടെക്) ഉപയോഗിച്ച് 3 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേറ്റഡ് ബീഡുകൾ 0.2% ഡിഗോക്സിജെനിൻ അടങ്ങിയ TNE ഉപയോഗിച്ച് അഞ്ച് തവണ കഴുകി, SDS സാമ്പിൾ ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ച്, SDS-PAGE-ൽ വേർതിരിച്ച്, ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി വിശകലനം ചെയ്തു.
(31) ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ ER ഫ്രാക്ഷനിൽ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് നിർണ്ണയം നടത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ ER ഫ്രാക്ഷൻ 0.5 mM ഡൈതിയോബിസ് (സുക്സിനിമിഡൈൽ പ്രൊപ്പിയോണേറ്റ്) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു (പിയേഴ്സ്, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, റോക്ക്ഫോർഡ്, IL, USA; 20°C, 20 മിനിറ്റ്). ഗ്ലൈസിൻ (50 mM അന്തിമ സാന്ദ്രത, 5 മിനിറ്റ്, 20°C) ചേർത്ത് ക്രോസ്ലിങ്കിംഗ് പ്രതികരണം ശമിപ്പിച്ചു.
മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ (50), വൈൽഡ്-ടൈപ്പ്, GhLag1 സ്ട്രെയിനുകളിലെ സെറാമൈഡിന്റെ MS വിശകലനം നടത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, 30°C താപനിലയിൽ YPD-യിൽ കോശങ്ങളെ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഘട്ടത്തിലേക്ക് (3 മുതൽ 4 OD600 യൂണിറ്റ്/മില്ലി) വളർത്തി, 25×107 കോശങ്ങൾ വിളവെടുത്തു. ട്രൈക്ലോറോഅസെറ്റിക് ആസിഡ് ഉപയോഗിച്ച് അവയുടെ മെറ്റബോളിസം ശമിപ്പിക്കുന്നു. എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ലായകവും [എത്തനോൾ, വെള്ളം, ഈതർ, പിരിഡിൻ, 4.2 N അമോണിയം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ് (15:15:5:1:0.018 v/v)] 1.2 nmol ആന്തരിക സ്റ്റാൻഡേർഡ് C17 സെറാമൈഡും (860517, അവന്തി പോളാർ ലിപിഡ്) ഗുണനിലവാരവും ഉപയോഗിക്കുക. എക്സ്ട്രാക്റ്റിന്റെ നേരിയ ആൽക്കലൈൻ ജലവിശ്ലേഷണം നടത്താൻ മോണോമെത്തിലാമൈൻ റിയാജന്റ് [മെത്തനോൾ, വെള്ളം, n-ബ്യൂട്ടനോൾ, മെത്തിലാമൈൻ ലായനി (4:3:1:5 v/v)] ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് ഉപ്പ് നീക്കം ചെയ്യാൻ വെള്ളം-പൂരിത n-ബ്യൂട്ടനോൾ ഉപയോഗിക്കുക. ഒടുവിൽ, സത്ത് ഒരു പോസിറ്റീവ് മോഡ് ലായകത്തിൽ [ക്ലോറോഫോം/മെഥനോൾ/വെള്ളം (2:7:1) + 5 mM അമോണിയം അസറ്റേറ്റ്] വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്ത് മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിലേക്ക് കുത്തിവച്ചു. സ്ഫിംഗോലിപിഡ് തന്മാത്രകളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിനും അളക്കുന്നതിനുമായി മൾട്ടി-റിയാക്ഷൻ മോണിറ്ററിംഗ് (MRM) നടത്തി. ലിപിഡ് വിശകലനത്തിനായി TSQ വാന്റേജ് ടെർഷ്യറി ക്വാഡ്രുപോൾ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഒരു റോബോട്ടിക് നാനോഫ്ലോ അയോൺ സ്രോതസ്സായ നാനോമേറ്റ് HD (അഡ്വിയോൺ ബയോസയൻസസ്, ഇത്താക്ക, NY) സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. ഓരോ സെറാമൈഡ് വിഭാഗത്തിനും കൂട്ടിയിടി ഊർജ്ജം ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു. MS ഡാറ്റ പോസിറ്റീവ് മോഡിൽ ലഭിച്ചു. ഓരോ ജൈവ പകർപ്പിനും, ലിപിഡ് സിഗ്നൽ മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര അളവുകളുടെ ശരാശരിയാണ്.
(31) ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, Gas1-GFP പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കോശങ്ങളെ (800×107) സ്വാഭാവിക ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷന് വിധേയമാക്കി. ശുദ്ധീകരിച്ച Gas1-GFP SDS-PAGE ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ച് ഒരു പോളി വിനൈലിഡിൻ ഫ്ലൂറൈഡ് (PVDF) മെംബ്രണിലേക്ക് മാറ്റി. PVDF-നെ അമൈഡ് കറുപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് കളർ ചെയ്തുകൊണ്ട് പ്രോട്ടീൻ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു. Gas1-GFP ബാൻഡ് PVDF-ൽ നിന്ന് മുറിച്ച് 5 തവണ മെഥനോൾ ഉപയോഗിച്ചും ഒരു തവണ ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി-MS (LC-MS) ഗ്രേഡ് വെള്ളം ഉപയോഗിച്ചും കഴുകി. മെംബ്രൻ സ്ട്രിപ്പ് 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), ബഫർ, 500μl പുതുതായി ലയിപ്പിച്ച 1 M സോഡിയം നൈട്രൈറ്റ് മിശ്രിതം എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 37°C-ൽ 3 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട്, Gas1-GFP-യിൽ നിന്ന് ലിപിഡ് അംശം പുറത്തുവിടുകയും ലൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു (51). അതിനുശേഷം, മെംബ്രൻ സ്ട്രിപ്പ് LC-MS ഗ്രേഡ് വെള്ളത്തിൽ നാല് തവണ കഴുകി, മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഉണക്കി, വിശകലനം വരെ -80°C-ൽ നൈട്രജൻ അന്തരീക്ഷത്തിൽ സൂക്ഷിച്ചു. ഒരു നിയന്ത്രണമെന്ന നിലയിൽ, ഓരോ പരീക്ഷണത്തിനും PVDF മെംബ്രണിന്റെ ഒരു ശൂന്യ സാമ്പിൾ ഉപയോഗിച്ചു. Gas1-GFP-യിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ലിപിഡ് പിന്നീട് വിവരിച്ചതുപോലെ MS വിശകലനം ചെയ്തു (50). ചുരുക്കത്തിൽ, GPI-ലിപിഡ് അടങ്ങിയ PVDF സ്ട്രിപ്പുകൾ 75μl നെഗറ്റീവ് മോൾഡ് ലായകത്തിൽ [ക്ലോറോഫോം/മെഥനോൾ (1:2) + 5 mM അമോണിയം അസറ്റേറ്റ്] വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുകയും സ്ഫിംഗോലിപിഡ് സ്പീഷീസുകളുടെ (TSQ Vantage) ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോണൈസേഷൻ (ESI)-MRM/MS വിശകലനം നടത്തുകയും ചെയ്തു. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, നെഗറ്റീവ് അയോൺ മോഡിലാണ് MS ഡാറ്റ ലഭിച്ചത്.
നേരത്തെ സൂചിപ്പിച്ചതുപോലെ, GPI ആങ്കറിന്റെ ലിപിഡ് ഭാഗം [3H]-ഇനോസിറ്റോൾ-ലേബൽ ചെയ്ത GPI-AP (16) ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചു. ഒരു ലായക സംവിധാനം (55:45:10 ക്ലോറോഫോം-മെഥനോൾ-0.25% KCl) ഉപയോഗിച്ച് നേർത്ത-പാളി ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി ഉപയോഗിച്ച് ലിപിഡുകൾ വേർതിരിച്ചു, FLA-7000 (ഫ്യൂജിഫിലിം) ഉപയോഗിച്ച് ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.
Gas1-GFP (600×107) പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കോശങ്ങളെ TNE ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് TNE ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് രണ്ടുതവണ കഴുകി, ഗ്ലാസ് ബീഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പൊട്ടിച്ച്, സെൽ അവശിഷ്ടങ്ങളും ഗ്ലാസ് ബീഡുകളും നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. സൂപ്പർനേറ്റന്റിനെ പിന്നീട് 17,000 ഗ്രാം താപനിലയിൽ 4°C താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. പെല്ലറ്റ് TNE-യിൽ കഴുകി, 0.2% ഡിജിറ്റാലിസ് സാപ്പോണിൻ അടങ്ങിയ TNE-യിൽ 1 U PI-PLC (ഇൻവിട്രോജൻ) ഉപയോഗിച്ച് 37°C താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. എൻസൈം ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം, 17,000 ഗ്രാം 4°C താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ സെൻട്രിഫ്യൂജേഷൻ വഴി മെംബ്രൺ നീക്കം ചെയ്തു. Gas1-GFP ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിന്, സൂപ്പർനേറ്റന്റിനെ രാത്രി മുഴുവൻ 4°C താപനിലയിൽ GFP-Trap_A (Chromotek) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. SDS-PAGE കൊണ്ട് വേർതിരിച്ച ശുദ്ധീകരിച്ച Gas1-GFP കൂമാസി ബ്രില്യന്റ് ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. അക്വഡക്റ്റിന് ചുറ്റുമുള്ള ചാരനിറത്തിൽ നിന്ന് ഗ്യാസ്1-ജിഎഫ്‌പി സ്റ്റെയിനിംഗ് ബാൻഡ് മുറിച്ചുമാറ്റി, തുടർന്ന് അയോഡോഅസെറ്റാമൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് ആൽക്കൈലേഷനും ഡൈതിയോത്രെയിറ്റോൾ ഉപയോഗിച്ച് റിഡക്ഷനും ചെയ്ത ശേഷം, ട്രിപ്സിൻ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻ-ജെൽ ദഹനം നടത്തി. ജിപിഐ-ഗ്ലൈകാനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ട്രിപ്റ്റിക് പെപ്റ്റൈഡുകളും പെപ്റ്റൈഡുകളും വേർതിരിച്ചെടുത്ത് ഉണക്കുക. ഉണങ്ങിയ പെപ്റ്റൈഡ് 20 μl വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിച്ചു. എൽസിയിലേക്ക് ഒരു ഭാഗം (8μl) കുത്തിവയ്ക്കുക. നിർദ്ദിഷ്ട ഗ്രേഡിയന്റ് സാഹചര്യങ്ങളിൽ പെപ്റ്റൈഡുകളെ വേർതിരിക്കാൻ ഒരു ഒക്ടാഡെസൈൽസിലാൻ (ODS) കോളം (ഡെവലോസ്സിൽ 300ODS-HG-5; ആന്തരിക വ്യാസം 150 mm×1.0 mm; നോമുറ കെമിക്കൽ, ഐച്ചി പ്രിഫെക്ചർ, ജപ്പാൻ) ഉപയോഗിച്ചു. മൊബൈൽ ഘട്ടം ലായക A (0.08% ഫോർമിക് ആസിഡ്), ലായക B (80% അസെറ്റോണിട്രൈലിൽ 0.15% ഫോർമിക് ആസിഡ്) എന്നിവയാണ്. 50 μl min-1 എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ 55 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ലായക A ഉപയോഗിച്ച് കോളം ഇല്യൂറ്റ് ചെയ്യാൻ ഒരു Accela HPLC സിസ്റ്റം (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, ബോസ്റ്റൺ, മസാച്യുസെറ്റ്സ്) ഉപയോഗിച്ചു, തുടർന്ന് ലായക B യുടെ സാന്ദ്രത 40% ആയി വർദ്ധിപ്പിച്ചു. , യുണൈറ്റഡ് സ്റ്റേറ്റ്സ്). ESI അയോൺ സ്രോതസ്സിലേക്ക് എല്യൂട്ട് തുടർച്ചയായി അവതരിപ്പിച്ചു, കൂടാതെ GPI-ഗ്ലൈകാനുകളുള്ള ട്രിപ്റ്റിക് പെപ്റ്റൈഡുകളും പെപ്റ്റൈഡുകളും LTQ Orbitrap XL (ഹൈബ്രിഡ് ലീനിയർ അയോൺ ട്രാപ്പ്-ഓർബിട്രാപ്പ് മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ; തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) വിശകലനം ചെയ്തു. MS സജ്ജീകരണത്തിൽ, കാപ്പിലറി ഉറവിടത്തിന്റെ വോൾട്ടേജ് 4.5 kV ആയി സജ്ജീകരിച്ചു, ട്രാൻസ്ഫർ കാപ്പിലറിയുടെ താപനില 300°C ആയി നിലനിർത്തി. കാപ്പിലറി വോൾട്ടേജും ട്യൂബ് ലെൻസ് വോൾട്ടേജും യഥാക്രമം 15 V ഉം 50 V ഉം ആയി സജ്ജീകരിച്ചു. 300/m/z മാസ്/ചാർജ് അനുപാതം (m/z) 3000 എന്ന മാസ് ശ്രേണിയിൽ, പോസിറ്റീവ് അയോൺ മോഡിൽ (60,000 റെസല്യൂഷൻ; 10 പാർട്സ് പെർ മില്യൺ എന്ന മാസ് കൃത്യത) MS ഡാറ്റ ലഭിച്ചു. LTQ Orbitrap XL ലെ അയോൺ ട്രാപ്പ് വഴിയാണ് MS/MS ഡാറ്റ ലഭിക്കുന്നത് [ഡാറ്റ ആശ്രയിക്കുന്ന ആദ്യത്തെ 3 അക്കങ്ങൾ, കൂട്ടിയിടി പ്രേരിത വിഘടനം (CID)].
GROMACS (52) സോഫ്റ്റ്‌വെയറും MARTINI 2 ഫോഴ്‌സ് ഫീൽഡും (53-55) ഉപയോഗിച്ചാണ് MD സിമുലേഷനുകൾ നടത്തിയത്. തുടർന്ന് CHARMM GUI മെംബ്രൻ ബിൽഡർ (56, 57) ഉപയോഗിച്ച് ഡയോലിയോയിൽഫോസ്ഫാറ്റിഡൈൽകോളിൻ (DOPC), Cer C18 അല്ലെങ്കിൽ DOPC, Cer C26 എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു ബൈലെയർ നിർമ്മിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു. സ്ഫിംഗോസിൻ വാലിൽ നിന്ന് അധിക ബീഡുകൾ നീക്കം ചെയ്തുകൊണ്ട് Cer C26 ന്റെ ടോപ്പോളജിയും കോർഡിനേറ്റുകളും DXCE യിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞതാണ്. ഇരട്ട പാളി സന്തുലിതമാക്കുന്നതിനും അത് പ്രവർത്തിപ്പിക്കുന്നതിനും താഴെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രക്രിയ ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് Emp24 അടങ്ങിയ ഒരു സിസ്റ്റം നിർമ്മിക്കുന്നതിന് സിസ്റ്റത്തിന്റെ അവസാന കോർഡിനേറ്റുകൾ ഉപയോഗിക്കുക. വിഷ്വൽ MD (VMD) ടൂൾ മോളിക്യുലാർ ഘടന (58) ഉപയോഗിച്ച് യീസ്റ്റ് Emp24 ന്റെ ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ ഡൊമെയ്ൻ (അവശിഷ്ടങ്ങൾ 173 മുതൽ 193 വരെ) ഒരു α-ഹെലിക്സ് ആയി നിർമ്മിച്ചു. തുടർന്ന്, ഓവർലാപ്പിംഗ് ലിപിഡുകൾ നീക്കം ചെയ്തതിനുശേഷം, പ്രോട്ടീൻ പരുക്കൻ ഗ്രാനുലാർ ചെയ്ത് CHARMM GUI ഉപയോഗിച്ച് ബൈലെയറിലേക്ക് ചേർത്തു. അന്തിമ സിസ്റ്റത്തിൽ 1202 DOPC ഉം 302 Cer C26 ഉം അല്ലെങ്കിൽ 1197 DOPC ഉം 295 Cer C18 ഉം Emp24 ഉം അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. സിസ്റ്റത്തെ 0.150M സാന്ദ്രതയിലേക്ക് അയോണൈസ് ചെയ്യുക. രണ്ട് ദ്വിപാളി കോമ്പോസിഷനുകൾക്കായി നാല് സ്വതന്ത്ര പകർപ്പുകൾ നിർമ്മിച്ചു.
ലിപിഡ് ബൈലെയർ CHARMM GUI പ്രക്രിയ ഉപയോഗിച്ച് സന്തുലിതമാക്കുന്നു, ഇതിൽ 405,000 ഘട്ടങ്ങൾ കുറയ്ക്കുകയും പിന്നീട് സന്തുലിതമാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, അവിടെ സ്ഥാന നിയന്ത്രണങ്ങൾ ക്രമേണ കുറയ്ക്കുകയും ഇല്ലാതാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ സമയ ഘട്ടം 0.005 ps ൽ നിന്ന് 0.02 ps ആയി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു. സന്തുലിതാവസ്ഥയ്ക്ക് ശേഷം, 0.02 ps സമയ ഘട്ടത്തോടെ ഇത് 6 µs ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു. Emp24 ചേർത്തതിനുശേഷം, സിസ്റ്റം ചെറുതാക്കാനും സന്തുലിതമാക്കാനും അതേ CHARMM GUI പ്രക്രിയ ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് ഉൽ‌പാദനത്തിൽ 8 സെക്കൻഡ് പ്രവർത്തിപ്പിക്കുക.
എല്ലാ സിസ്റ്റങ്ങൾക്കും, ബാലൻസിംഗ് പ്രക്രിയയിൽ, മർദ്ദം ബെറെൻഡ്‌സെൻ ബറോസ്റ്റാറ്റ് (59) ആണ് നിയന്ത്രിക്കുന്നത്, ഉൽ‌പാദന പ്രക്രിയയിൽ, മർദ്ദം പാരിനെല്ലോ-റഹ്മാൻ ബറോസ്റ്റാറ്റ് (60) ആണ് നിയന്ത്രിക്കുന്നത്. എല്ലാ സാഹചര്യങ്ങളിലും, ശരാശരി മർദ്ദം 1 ബാർ ആണ്, ഒരു സെമി-ഐസോട്രോപിക് പ്രഷർ കപ്ലിംഗ് സ്കീം ഉപയോഗിക്കുന്നു. സന്തുലിതാവസ്ഥയിലും ഉൽ‌പാദന പ്രക്രിയയിലും, വേഗത പുനഃക്രമീകരണത്തോടുകൂടിയ ഒരു തെർമോസ്റ്റാറ്റ് (61) യഥാക്രമം പ്രോട്ടീൻ, ലിപിഡ്, ലായക കണികകൾ എന്നിവയുടെ താപനില ജോടിയാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു. മുഴുവൻ പ്രവർത്തനത്തിനിടയിലും, ലക്ഷ്യ താപനില 310K ആണ്. 0.005 ബഫർ ടോളറൻസുള്ള വെർലെറ്റ് സ്കീം ഉപയോഗിച്ച് ഒരു ജോടിയാക്കൽ ലിസ്റ്റ് സൃഷ്ടിച്ചാണ് നോൺ-ബോണ്ടിംഗ് ഇന്ററാക്ഷൻ കണക്കാക്കുന്നത്. റിയാക്ഷൻ ഫീൽഡും 1.1 nm ന്റെ കട്ട്-ഓഫ് ദൂരവും ഉപയോഗിച്ചാണ് കൂലോംബ് ടേം കണക്കാക്കുന്നത്. വാൻഡർ വാൽസ് ടേം 1.1 nm ന്റെ കട്ട്-ഓഫ് ദൂരമുള്ള ഒരു കട്ട്-ഓഫ് സ്കീം ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ വെർലെറ്റ് കട്ട്-ഓഫ് സ്കീം പൊട്ടൻഷ്യൽ ഡ്രിഫ്റ്റിനായി ഉപയോഗിക്കുന്നു (62).
VMD ഉപയോഗിച്ച്, DOPC ഫോസ്ഫേറ്റ് ബീഡുകൾ അല്ലെങ്കിൽ സെറാമൈഡ് AM1 ബീഡുകൾക്കും പ്രോട്ടീനിനും ഇടയിലുള്ള കട്ട്ഓഫ് തരംഗദൈർഘ്യം 0.7 nm ആണ്, കൂടാതെ പ്രോട്ടീനുമായി ഇടപഴകുന്ന ലിപിഡുകളുടെ എണ്ണം കണക്കാക്കുന്നു. താഴെ പറയുന്ന ഫോർമുല അനുസരിച്ച്, (63) ലെ പോലെ ഡിപ്ലീഷൻ-എൻറിച്ച്മെന്റ് (DE) ഘടകം കണക്കാക്കുക: DE ഘടകം = (പ്രോട്ടീനിലെ ആകെ ലിപിഡുകളുടെ അളവ് 0.7) പ്രോട്ടീൻ 0.7 ൽ (മൊത്തം ലിപിഡുകളിലെ Cer ന്റെ അളവ്)
റിപ്പോർട്ട് ചെയ്ത മൂല്യം ശരാശരിയായി ലഭിക്കുന്നു, പിശക് ബാറുകൾ SE യുടെ നാല് സ്വതന്ത്ര പകർപ്പുകളാണ്. DE ഘടകത്തിന്റെ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് പ്രാധാന്യം t ടെസ്റ്റ് [(ശരാശരിDE-ഘടകം-1)/SE] ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കുന്നു. വൺ-ടെയിൽഡ് ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷനിൽ നിന്ന് P മൂല്യം കണക്കാക്കുക.
ട്രെയ്‌സിന്റെ അവസാന 250 ns-ൽ Emp24 അടങ്ങിയ സിസ്റ്റത്തിന്റെ 2D ലാറ്ററൽ ഡെൻസിറ്റി മാപ്പ് കണക്കാക്കാൻ GROMACS ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ചു. സെറാമൈഡിന്റെ സമ്പുഷ്ടീകരണം/ക്ഷയം മാപ്പ് ലഭിക്കുന്നതിന്, Cer-ന്റെ സാന്ദ്രത മാപ്പിനെ Cer-ന്റെയും DOPC-യുടെയും മാപ്പിന്റെ ആകെത്തുക കൊണ്ട് ഹരിക്കുന്നു, തുടർന്ന് ബോഡിയിലെ Cer-ന്റെ സാന്ദ്രത കൊണ്ട് ഹരിക്കുന്നു. അതേ കളർ മാപ്പ് സ്കെയിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു.
ഈ ലേഖനത്തിനായുള്ള അനുബന്ധ വസ്തുക്കൾക്ക്, ദയവായി http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 കാണുക.
ക്രിയേറ്റീവ് കോമൺസ് ആട്രിബ്യൂഷൻ-നോൺ-കൊമേഴ്‌സ്യൽ ലൈസൻസിന്റെ നിബന്ധനകൾക്ക് കീഴിൽ വിതരണം ചെയ്യുന്ന ഒരു ഓപ്പൺ ആക്‌സസ് ലേഖനമാണിത്, അന്തിമ ഉപയോഗം വാണിജ്യ നേട്ടത്തിനായിട്ടല്ലാത്തിടത്തോളം, യഥാർത്ഥ കൃതി ശരിയാണെന്നാണ് അടിസ്ഥാനം എങ്കിൽ, ഏത് മാധ്യമത്തിലും ഉപയോഗിക്കാനും വിതരണം ചെയ്യാനും പുനർനിർമ്മിക്കാനും ഇത് അനുവദിക്കുന്നു. റഫറൻസ്.
കുറിപ്പ്: നിങ്ങൾ പേജിലേക്ക് ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന വ്യക്തിക്ക് ഇമെയിൽ കാണണമെന്ന് നിങ്ങൾ ആഗ്രഹിക്കുന്നുണ്ടെന്നും അത് സ്പാം അല്ലെന്നും അറിയാൻ വേണ്ടി മാത്രമേ നിങ്ങളുടെ ഇമെയിൽ വിലാസം നൽകാൻ ഞങ്ങൾ ആവശ്യപ്പെടുകയുള്ളൂ. ഞങ്ങൾ ഒരു ഇമെയിൽ വിലാസവും പിടിച്ചെടുക്കില്ല.
നിങ്ങൾ ഒരു സന്ദർശകനാണോ എന്ന് പരിശോധിക്കുന്നതിനും സ്വയമേവയുള്ള സ്പാം സമർപ്പിക്കൽ തടയുന്നതിനും ഈ ചോദ്യം ഉപയോഗിക്കുന്നു.
സോഫിയ റോഡ്രിഗസ്-ഗല്ലാർഡോ, കസുവോ കുറോകാവ, സൂസന സാബിഡോ-ബോസോ, അലജാൻഡ്രോ കോർട്ടെസ് · ഗോമസ് (അലജാൻഡ്രോ കോർട്ടെസ്-ഗോമസ്), അറ്റ്സുകോ ഇകെഡ (അറ്റ്സുകോ ഇകെഡ), വലേറിയ സോണി (വലേറിയ സോണി), ഓക്സിലിയാഡോറ എസ് പെറിയോസ്, അഗ്വിലേറോ-റിയോമെറോ), (സെർജിയോ ലോപ്പസ്), മിഹോ വാഗ (മിഹോ വാഗ), മിസാക്കോ അർമാൻ (മിസാക്കോ അർമാൻ), മിയാകോ റിമാൻ (മിയാക്കോ റിമാൻ), പ്രോവ് അകിര, സ്റ്റെഫാനോ ഫാനി, അകിഹിക്കോ നകാനോ, മാനുവൽ മുനിസ്
തിരഞ്ഞെടുത്ത ഔട്ട്‌പുട്ട് സൈറ്റുകളിൽ പ്രോട്ടീൻ തരംതിരിക്കുന്നതിന് സെറാമൈഡ് ചെയിൻ നീളത്തിന്റെ പ്രാധാന്യം 3D ഹൈ-റെസല്യൂഷൻ റിയൽ-ടൈം ഇമേജിംഗ് വെളിപ്പെടുത്തുന്നു.
സോഫിയ റോഡ്രിഗസ്-ഗല്ലാർഡോ, കസുവോ കുറോകാവ, സൂസന സാബിഡോ-ബോസോ, അലജാൻഡ്രോ കോർട്ടെസ് · ഗോമസ് (അലജാൻഡ്രോ കോർട്ടെസ്-ഗോമസ്), അറ്റ്സുകോ ഇകെഡ (അറ്റ്സുകോ ഇകെഡ), വലേറിയ സോണി (വലേറിയ സോണി), ഓക്സിലിയാഡോറ എസ് പെറിയോസ്, അഗ്വിലേറോ-റിയോമെറോ), (സെർജിയോ ലോപ്പസ്), മിഹോ വാഗ (മിഹോ വാഗ), മിസാക്കോ അർമാൻ (മിസാക്കോ അർമാൻ), മിയാകോ റിമാൻ (മിയാക്കോ റിമാൻ), പ്രോവ് അകിര, സ്റ്റെഫാനോ ഫാനി, അകിഹിക്കോ നകാനോ, മാനുവൽ മുനിസ്
തിരഞ്ഞെടുത്ത ഔട്ട്‌പുട്ട് സൈറ്റുകളിൽ പ്രോട്ടീൻ തരംതിരിക്കുന്നതിന് സെറാമൈഡ് ചെയിൻ നീളത്തിന്റെ പ്രാധാന്യം 3D ഹൈ-റെസല്യൂഷൻ റിയൽ-ടൈം ഇമേജിംഗ് വെളിപ്പെടുത്തുന്നു.
©2020 അമേരിക്കൻ അസോസിയേഷൻ ഫോർ ദി അഡ്വാൻസ്‌മെൻ്റ് ഓഫ് സയൻസ്. എല്ലാ അവകാശങ്ങളും നിക്ഷിപ്തം. HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef, COUNTER എന്നിവയുടെ പങ്കാളിയാണ് AAAS. സയൻസ് അഡ്വാൻസസ് ISSN 2375-2548.