Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് CSS-ന് പരിമിതമായ പിന്തുണയേ ഉള്ളൂ. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്ഡേറ്റ് ചെയ്ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് ഓഫ് ചെയ്യുക). അതേസമയം, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലുകളും ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റും ഇല്ലാതെ ഞങ്ങൾ സൈറ്റ് പ്രദർശിപ്പിക്കും.
കശേരുക്കളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, പ്രാണികൾക്ക് പുരുഷ-പക്ഷപാതപരമായ ലൈംഗിക സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോണുകൾ ഇല്ലെന്ന് വ്യാപകമായി കരുതപ്പെടുന്നു. അനോഫിലിസ് ഗാംബിയയിൽ, എക്ഡിസോൺ സ്റ്റിറോയിഡ് 20-ഹൈഡ്രോക്സിഎക്ഡിസോൺ (20E) സ്ത്രീകൾ സമന്വയിപ്പിക്കുമ്പോൾ മുട്ട വികസനം നിയന്ത്രിക്കാനും പുരുഷന്മാർ ലൈംഗികമായി കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുമ്പോൾ ഇണചേരൽ റിഫ്രാക്ടറി കാലഘട്ടത്തിന് കാരണമാകാനും പരിണമിച്ചതായി തോന്നുന്നു3. മുട്ട വികാസവും ഇണചേരലും അനിവാര്യമായ പ്രത്യുൽപാദന സ്വഭാവങ്ങളായതിനാൽ, പെൺ അനോഫിലിസ് കൊതുകുകൾ ഈ ഹോർമോൺ സിഗ്നലുകളെ എങ്ങനെ സംയോജിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് മനസ്സിലാക്കുന്നത് പുതിയ മലേറിയ നിയന്ത്രണ പരിപാടികളുടെ രൂപകൽപ്പനയെ സുഗമമാക്കും. ഇവിടെ, എക്ഡിസ്റ്ററോയിഡ്-സജീവമാക്കുന്ന/നിർജ്ജീവമാക്കുന്ന എൻസൈമുകളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ ശൃംഖലയിലൂടെ വ്യത്യസ്തമായ ലൈംഗിക സ്റ്റിറോയിഡുകൾ ഈ പ്രത്യുൽപാദന പ്രവർത്തനങ്ങൾ നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തുന്നു. ലൈംഗിക കൈമാറ്റത്തിനും ഡീഫോസ്ഫോറിലേഷൻ വഴി സജീവമാക്കലിനും ശേഷം സ്ത്രീകളുടെ ലൈംഗിക സംവേദനക്ഷമത അടച്ചുപൂട്ടി പിതൃത്വത്തെ സംരക്ഷിക്കുന്ന ഒരു പുരുഷ-നിർദ്ദിഷ്ട ഓക്സിഡൈസ്ഡ് എക്ഡിസോൺ, 3-ഡീഹൈഡ്രോ-20E (3D20E) ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. ശ്രദ്ധേയമായി, 3D20E കൈമാറ്റം പ്ലാസ്മോഡിയം അണുബാധയ്ക്കിടെ മുട്ട വികസനം നിലനിർത്തുന്ന പ്രത്യുൽപാദന ജീനുകളുടെ പ്രകടനത്തെയും പ്രേരിപ്പിച്ചു, ഇത് രോഗബാധിതരായ സ്ത്രീകളുടെ ആരോഗ്യം ഉറപ്പാക്കുന്നു. സ്ത്രീ-ഉത്ഭവം 20E ലൈംഗിക പ്രതികരണം ഉളവാക്കുന്നില്ല, പക്ഷേ 20E- തടയുന്ന കൈനേസുകൾ തടഞ്ഞതിനുശേഷം ഇണചേരുന്ന വ്യക്തികളെ മുട്ടയിടാൻ അനുവദിക്കുന്നു. ഈ പുരുഷ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രാണികളുടെ സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോണിന്റെ തിരിച്ചറിയലും സ്ത്രീകളുടെ ലൈംഗിക സംവേദനക്ഷമത, പ്രത്യുൽപാദനക്ഷമത, പ്ലാസ്മോഡിയവുമായുള്ള ഇടപെടൽ എന്നിവ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലെ അതിന്റെ പങ്കും മലേറിയ പരത്തുന്ന കൊതുകുകളുടെ പ്രത്യുത്പാദന വിജയം കുറയ്ക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
മനുഷ്യ മലേറിയ പരാദങ്ങളുടെ ഏക വാഹകരായ അനോഫിലിസ് കൊതുകുകളിൽ വ്യാപകമായ കീടനാശിനി പ്രതിരോധം കാരണം മലേറിയ കേസുകളും മരണങ്ങളും വീണ്ടും വർദ്ധിച്ചുകൊണ്ടിരിക്കുകയാണ്4. പെൺ കൊതുകുകൾ ഒരിക്കൽ മാത്രമേ ഇണചേരുന്നുള്ളൂ എന്നതിനാൽ, ഈ കൊതുകുകളുടെ ഇണചേരൽ ജീവശാസ്ത്രം പുതിയ മലേറിയ നിയന്ത്രണ ഇടപെടലുകൾക്ക് പ്രത്യേകിച്ച് ആകർഷകമായ ലക്ഷ്യമാണ്5; ഈ ഒരൊറ്റ ഇണചേരൽ സംഭവം അണുവിമുക്തമാക്കുന്നത് വയലിലെ കൊതുകുകളുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുന്നതിന് വലിയ സാധ്യതയുണ്ടാക്കും.
പുരുഷന്മാരിൽ നിന്ന് ഉയർന്ന ടൈറ്റർ സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോണുകൾ സ്വീകരിച്ചതിനുശേഷം സ്ത്രീകൾ ലൈംഗികമായി ശേഷിയില്ലാത്തവരാകുന്നു. കൂടുതൽ ഇണചേരലിന് ബുദ്ധിമുട്ട് സൃഷ്ടിക്കുന്ന ഘടകം 20-ഹൈഡ്രോക്സി എക്ഡിസോൺ (20E) ആണെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, ഇത് ലാർവ ഘട്ടത്തിൽ ഉരുകൽ ചക്രത്തിന്റെ റെഗുലേറ്റർ എന്നറിയപ്പെടുന്ന ഒരു സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോണാണ്. 20E സമന്വയിപ്പിക്കാനും കൈമാറ്റം ചെയ്യാനുമുള്ള പുരുഷന്മാരുടെ കഴിവ് പ്രത്യേകിച്ച് അനോഫിലിസ് സ്പീഷീസുകളിൽ വികസിച്ചിരിക്കുന്നു, അവ ആഫ്രിക്കയിൽ വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു, അനോഫിലിസ് ഗാംബിയ ഉൾപ്പെടെയുള്ള മലേറിയയുടെ ഏറ്റവും അപകടകരമായ വെക്റ്ററുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഇത് പ്രത്യേകിച്ചും ശ്രദ്ധേയമാണ്, കാരണം ഈ സ്പീഷീസുകളിൽ ഓരോ രക്ത ഭക്ഷണത്തിനു ശേഷവും സ്ത്രീകളും 20E ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ 20E ഓജനിസിസ് ചക്രത്തെ നയിക്കുന്നു (റഫ. 8 കാണുക). എന്നിരുന്നാലും, സ്ത്രീകൾ ഇണചേരാനുള്ള കഴിവിൽ വിട്ടുവീഴ്ച ചെയ്യാതെ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത എക്ഡിസോണിന്റെ സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്നുള്ള സിഗ്നലുകൾ (പുരുഷ കൈമാറ്റവും രക്തദാന പ്രേരണയും) എങ്ങനെ സംയോജിപ്പിക്കുന്നു എന്നതിനെക്കുറിച്ച് വളരെക്കുറച്ചേ അറിയൂ. വാസ്തവത്തിൽ, സ്ത്രീകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്ന 20E ലൈംഗിക അസഹിഷ്ണുതയ്ക്ക് കാരണമാകുകയാണെങ്കിൽ, ഇത് കന്യകയ്ക്ക് ഭക്ഷണം നൽകുന്ന വ്യക്തികളിൽ വന്ധ്യതയിലേക്ക് നയിക്കും, ഈ കൊതുകുകളിൽ വളരെ സാധാരണമായ ഒരു പെരുമാറ്റമാണിത്5.
ഒരു സാധ്യമായ വിശദീകരണം, എ. ഗാംബിയ ആൺ ജീവികളിൽ നിന്ന് പരിഷ്കരിച്ച പുരുഷ-നിർദ്ദിഷ്ട എക്ഡിസോൺ കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്നു, ഇത് സ്ത്രീകളുടെ പ്രത്യുത്പാദന നാളത്തിൽ ഒരു സിഗ്നലിംഗ് കാസ്കേഡിനെ സജീവമാക്കുന്നു, ഇത് ഇണചേരൽ അസ്ഥിരതയിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, കശേരുക്കൾക്ക് ഈസ്ട്രജൻ, ആൻഡ്രോജൻ (റഫ്. 9 ൽ അവലോകനം ചെയ്‌തത്) പോലുള്ള ഒന്നിലധികം സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോണുകൾ ഉണ്ടെങ്കിലും, നമ്മുടെ അറിവിൽ, പ്രാണികളിൽ ആൻഡ്രോജെനിക്-പക്ഷപാതപരമായ സ്റ്റിറോയിഡുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടില്ല.
ലൈംഗിക പക്വതയുള്ള എ. ഗാംബിയയുടെ പുരുഷ പുരുഷ അനുബന്ധ ഗ്രന്ഥിയിൽ (MAG) സാധ്യമായ പരിഷ്കരണ സ്റ്റിറോയിഡുകൾക്കായി തിരയുന്നതിനായി ഞങ്ങൾ സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോണുകളുടെ ശേഖരം നിർണ്ണയിക്കാൻ പുറപ്പെട്ടു. മുമ്പ് ഉപയോഗിച്ചിരുന്ന കുറഞ്ഞ നിർദ്ദിഷ്ട രീതിക്ക് പകരം, ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിയും ടാൻഡം മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിയും (HPLC-MS/MS) ഉപയോഗിച്ച്, ഈ ടിഷ്യുവിൽ എക്ഡിസോൺ (E) ഉം 20E ഉം ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, ഇത് മുൻ ഫലം സ്ഥിരീകരിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, സാമ്പിളിൽ ഓക്സിഡൈസ്ഡ് ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് സ്റ്റിറോയിഡുകൾ ആധിപത്യം പുലർത്തി, 3-ഡീഹൈഡ്രോ-20E-22-ഫോസ്ഫേറ്റ് (3D20E22P)12 എന്ന ഫോർമുലയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 1). മറ്റ് രൂപങ്ങളിൽ 3-ഡീഹൈഡ്രോ-20E (3D20E), 20E-22-ഫോസ്ഫേറ്റ് (20E22P) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. 3D20E22P യുടെ HPLC-MS/MS സിഗ്നൽ തീവ്രത അതിന്റെ ഡീഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് രൂപമായ 3D20E നേക്കാൾ രണ്ട് ഓർഡറുകൾ കൂടുതലും E, 20E എന്നിവയേക്കാൾ മൂന്ന് ഓർഡറുകൾ കൂടുതലുമായിരുന്നു (ചിത്രം 1).ശരീരത്തിന്റെ മറ്റ് ഭാഗങ്ങളിലും താഴ്ന്ന പ്രത്യുത്പാദന അവയവങ്ങളിലും (LRT; എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ചിത്രം 1a) ആണുങ്ങളിലും പുതുതായി അടച്ച (<1 ദിവസം പ്രായമുള്ള) ആണുങ്ങളിലും സ്ത്രീകളിലും എക്ഡിസ്റ്ററോയിഡുകൾ ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു, MAG-ൽ മാത്രം 3D20E, 3D20E22P എന്നിവ കണ്ടെത്തി; E, 20E, 20E22P എന്നിവ രണ്ട് ലിംഗങ്ങളിലും ഉണ്ടായിരുന്നു (എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ചിത്രം 1b). ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് എ. ഗാംബിയയിലെ പ്രായപൂർത്തിയായ പുരുഷന്മാർ അവരുടെ MAG-കളിൽ സ്ത്രീകളാൽ സമന്വയിപ്പിക്കപ്പെടാത്ത പരിഷ്കരണ ഹോർമോണുകളുടെ ഉയർന്ന ടൈറ്ററുകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു എന്നാണ്.
4 ദിവസം പ്രായമുള്ള (4 ദിവസം പ്രായമുള്ള) കന്യക പുരുഷന്മാരിൽ നിന്നും കന്യകയും ഇണചേർന്ന സ്ത്രീകളിൽ നിന്നും (0.5, 3, 12 hpm) MAG, സ്ത്രീ LRT എന്നിവ വേർതിരിച്ചെടുത്തു. ഈ കലകളിലെ എക്ഡിസോൺ HPLC-MS/MS വിശകലനം ചെയ്തു (ശരാശരി ± സെം; ജോടിയാക്കാത്ത ടി-ടെസ്റ്റ്, രണ്ട് വശങ്ങളുള്ള, തെറ്റായ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് (FDR) ശരിയാക്കി; NS, കാര്യമായില്ല; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: 3 മണിക്കൂർ vs. 0.5 മണിക്കൂർ, P = 0.035; 12 മണിക്കൂർ vs. 3 മണിക്കൂർ, P = 0.0015; 12 മണിക്കൂർ vs. 0.5 മണിക്കൂർ, P = 0.030. 3D20E22P: 3 മണിക്കൂർ vs. 0.5 മണിക്കൂർ, P = 0.25; 12 മണിക്കൂർ vs. 3 മണിക്കൂർ, P = 0.0032; 12 മണിക്കൂർ vs. 0.5 മണിക്കൂർ, P = 0.015). മൂന്ന് ജൈവ പകർപ്പുകളിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റയാണ്. താൽപ്പര്യമുള്ള ഓരോ എക്ഡിസോണിന്റെയും പീക്ക് ഏരിയ കൊതുകുകളുടെ എണ്ണം അനുസരിച്ച് കണക്കാക്കി സാധാരണവൽക്കരിച്ചു. എക്ഡിസോണിനെ ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ നിറത്തിൽ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു: E, പച്ച; 20E, ഓറഞ്ച്; 20E22P, പർപ്പിൾ; 3D20E, നീല; 3D20E22P, പിങ്ക്. ഇൻസെറ്റ് കുറഞ്ഞ എക്ഡിസോൺ അളവ് കാണിക്കുന്നതിന് y-അക്ഷത്തിൽ സ്കെയിൽ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു.
ഇണചേരൽ സമയത്ത് 3D20E22P, 3D20E എന്നിവ കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്നുണ്ടോ എന്ന് അന്വേഷിക്കാൻ, ഇണചേരലിനുശേഷം വിവിധ സമയ പോയിന്റുകളിൽ ഞങ്ങൾ സ്ത്രീ LRT-കളെ വിച്ഛേദിച്ചു. കന്യകകളിൽ എക്ഡിസോൺ കണ്ടെത്തിയില്ലെങ്കിലും, ഇണചേരലിന് തൊട്ടുപിന്നാലെ LRT-യിൽ 3D20E22P യുടെ ഗണ്യമായ അളവ് (ഇണചേരലിന് 0.5 മണിക്കൂർ, hpm) ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, കാലക്രമേണ കുറയുന്നു, അതേസമയം 3D20E ലെവലുകൾ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 1). രാസപരമായി സമന്വയിപ്പിച്ച 3D20E ഒരു മാനദണ്ഡമായി ഉപയോഗിച്ചുകൊണ്ട്, ഇണചേരൽ LRT-കളിലെ ഈ സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോണിന്റെ അളവ് 20E-യെക്കാൾ കുറഞ്ഞത് 100 മടങ്ങ് കൂടുതലാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു (വിപുലീകൃത ഡാറ്റ പട്ടിക 1). അങ്ങനെ, ഇണചേരൽ സമയത്ത് സ്ത്രീ LRT-യിലേക്ക് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്ന പ്രധാന പുരുഷ എക്ഡിസോണാണ് 3D20E22P, ഇണചേരലിന് തൊട്ടുപിന്നാലെ അതിന്റെ ഡീഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് രൂപമായ 3D20E വളരെ സമൃദ്ധമായി മാറുന്നു. സ്ത്രീ ഇണചേരലിനു ശേഷമുള്ള ജീവശാസ്ത്രത്തിൽ പിന്നീടുള്ള എക്ഡിസോണിന് ഇത് ഒരു പ്രധാന പങ്ക് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഒരു പുതിയ RNA സീക്വൻസിങ് (RNA-seq) ഡാറ്റാസെറ്റ് (ചിത്രം 2a) സൃഷ്ടിച്ചതിനുശേഷം, ഒരു കസ്റ്റം-ബിൽറ്റ് ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് പൈപ്പ്‌ലൈൻ ഉപയോഗിച്ച്, ഞങ്ങൾ എക്ഡിസോൺ കൈനേസ് (EcK), എക്ഡിസോൺ ഓക്‌സിഡേസ് (EO), എക്ഡിസോൺ എൻകോഡിംഗ് 20E-മോഡിഫൈഡ് ഫോസ്ഫേറ്റേസ് ജീൻ എന്നിവയ്ക്കായി തിരഞ്ഞു. പ്രത്യുൽപാദന കലകളിൽ EPP) പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു. ഒരു കാൻഡിഡേറ്റ് EPP ജീനും രണ്ട് സാധ്യതയുള്ള EcK ജീനുകളും (EcK1, EcK2) ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, പക്ഷേ ഒരു നല്ല കാൻഡിഡേറ്റ് EO ജീൻ കണ്ടെത്താൻ കഴിഞ്ഞില്ല. ഗാംബിയൻ MAG-കളിൽ വ്യക്തിഗത EPP ജീനുകൾ ഉയർന്ന തലങ്ങളിൽ (98.9-ാം ശതമാനം) പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ടു, പക്ഷേ സ്ത്രീ LRT-കളിൽ അല്ല (ചിത്രം 2b), ഈ സ്ത്രീ കലയിൽ 3D20E22P യുടെ ഡീഫോസ്ഫോറിലേഷൻ സംഭവിച്ചതിനാൽ ഞങ്ങളുടെ പ്രതീക്ഷകൾക്ക് വിരുദ്ധമായി. അതിനാൽ, ഇണചേരൽ സമയത്ത് പുരുഷ EPP കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടാമെന്ന് ഞങ്ങൾ വിശ്വസിക്കുന്നു. തീർച്ചയായും, ഇണചേരലിനുശേഷം സ്ത്രീ പ്രോട്ടീനിനെ മറയ്ക്കാൻ ഞങ്ങൾ ഇൻ വിവോ സ്റ്റേബിൾ ഐസോടോപ്പ് ലേബലിംഗ് ഉപയോഗിച്ചു, സ്ത്രീ ആട്രിയത്തിൽ MS തിരിച്ചറിഞ്ഞ ഒരു എൻസൈം (ചിത്രം 2c, അനുബന്ധ പട്ടിക 1). നിർദ്ദിഷ്ട ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് MAG-ലും ഇണചേർന്ന (എന്നാൽ കന്യകയല്ല) സ്ത്രീ LRT-യിലും EPP-യുടെ സാന്നിധ്യം സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 2d).
a, EcK-കൾ, EO-കൾ, EPP-കൾ എന്നിവ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ജീനുകൾക്കായി ഓരോ ലിംഗത്തിന്റെയും പ്രത്യുത്പാദന കലകളിൽ തിരയുന്നതിനുള്ള ഒരു ഇഷ്ടാനുസൃത ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് പൈപ്പ്‌ലൈൻ. അമ്പടയാളങ്ങൾക്ക് അടുത്തുള്ള സംഖ്യകൾ ഓരോ ഘട്ടത്തിലും പുരുഷ-സ്ത്രീ സ്ഥാനാർത്ഥികളുടെ എണ്ണത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. പുരുഷന്മാരിൽ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഒരു EPP ജീനും (EPP) ഒരു EcK ജീനും (EcK1) രണ്ട് ലിംഗങ്ങളിലും പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഒരു EcK ജീനും (EcK2) തിരിച്ചറിഞ്ഞു, പക്ഷേ ഒരു കാൻഡിഡേറ്റ് EO ജീൻ നൽകുന്നില്ല.b, കന്യക (V) യിലും ഇണചേരലിലും (M) അനോഫിലിസ് ഗാംബിയയിലും അനോഫിലിസ് ആൽബിക്കൻസ് ടിഷ്യുകളിലും കാൻഡിഡേറ്റ് ജീൻ എക്സ്പ്രഷനെ താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന ഹീറ്റ്മാപ്പ്.Spca, ബീജസങ്കലനം; MAG-കൾ, പുരുഷന്മാരിലെ അനുബന്ധ ഗ്രന്ഥികൾ; സ്തനങ്ങൾ, ചിറകുകൾ, കാലുകൾ, തടിച്ച ശരീരങ്ങൾ, രണ്ട് ലിംഗങ്ങളിലുമുള്ള ആന്തരിക അവയവങ്ങൾ, സ്ത്രീകളിലെ അണ്ഡാശയങ്ങൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെ ശരീരത്തിന്റെ മറ്റ് ഭാഗങ്ങൾ. ഗാംബിയയിലെ MAG, ആട്രിയ എന്നിവയിൽ EcK2 വളരെ പ്രകടമാണ്, അതേസമയം EPP MAG.c-യിൽ മാത്രമേ കാണപ്പെടുന്നുള്ളൂ, 3, 12, 24 hpm എന്നിവയിൽ സ്ത്രീ ആട്രിയയിലേക്ക് പുരുഷ സ്ഖലന ഗ്രൂപ്പ് ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷന്റെ പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനം, ഇത് ഏറ്റവും സമൃദ്ധമായ 67 പ്രോട്ടീനുകളെ കാണിക്കുന്നു. എല്ലാ പ്രോട്ടീനുകളെയും ലേബൽ ചെയ്യാൻ (മറയ്ക്കാൻ) 15N അടങ്ങിയ ഭക്ഷണക്രമത്തിലാണ് സ്ത്രീകളെ വളർത്തിയത്. ടാഗ് ചെയ്യാത്ത പുരുഷന്മാരെ ടാഗ് ചെയ്ത സ്ത്രീകളുമായി ഇണചേർത്തു, പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനത്തിനായി സ്ത്രീ LRT-കളെ 3, 12, 24 hpm എന്നിവയിൽ വിച്ഛേദിച്ചു (സ്ഖലന പ്രോട്ടീനുകളുടെ പൂർണ്ണമായ പട്ടികയ്ക്കായി അനുബന്ധ പട്ടിക 1 കാണുക). ഈ കലകളുടെ പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനത്തിലൂടെ കന്യക പുരുഷന്മാരുടെ MAG-ൽ ഇൻസെറ്റ്, EPP, Eck1, EcK2 എന്നിവ കണ്ടെത്തി. d, ഇണചേർന്ന സ്ത്രീകളുടെ MAG, LRT എന്നിവയിൽ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് വഴി EPP കണ്ടെത്തി, പക്ഷേ കന്യക സ്ത്രീകളിലോ പുരുഷന്മാരിലോ ബാക്കിയുള്ള സ്ത്രീകളിലോ അല്ല. ശരീരം. ആന്റി-ആക്ടിൻ (ലോഡിംഗ് കൺട്രോൾ), ആന്റി-ഇപിപി ആന്റിബോഡികൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് മെംബ്രണുകളെ ഒരേസമയം പരിശോധിച്ചു. എല്ലാ പുരുഷന്മാരും കന്യകമാരാണ്. ജെൽ സോഴ്‌സ് ഡാറ്റയ്‌ക്കായി സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1 കാണുക. സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടുകൾ രണ്ടുതവണ നടത്തി.
MAG-ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത 3D20E22P ഉപയോഗിച്ച് HPLC-MS/MS ഉപയോഗിച്ച് EPP-യുടെ എക്ഡിസ്റ്ററോയിഡ് ഫോസ്ഫോസ്ഫേറ്റേസ് പ്രവർത്തനം പരിശോധിച്ചു (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 2a). കൂടാതെ, RNA- മധ്യസ്ഥ ഇടപെടൽ (RNAi) ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ EPP-യെ നിശബ്ദമാക്കിയപ്പോൾ, ഈ പുരുഷന്മാരുടെ പ്രത്യുത്പാദന കലകളിൽ ഫോസ്ഫേറ്റേസ് പ്രവർത്തനത്തിൽ ശക്തമായ കുറവ് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 3a), EPP- നിശബ്ദമാക്കിയ പുരുഷന്മാരുമായി ഇണചേർന്ന സ്ത്രീകൾക്ക് ഭാഗിക ജീൻ നിശബ്ദത പാലിച്ചിട്ടും ഡീഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് 3D20E യുടെ കുറഞ്ഞ അനുപാതം (ചിത്രം 3b) കാണിച്ചു (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 2b,c). ഇതിനു വിപരീതമായി, അതേ കൊതുകുകളിൽ 20E22P/20E അനുപാതത്തിൽ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങൾ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയില്ല, ഇത് എൻസൈം 3D20E22P-ക്ക് പ്രത്യേകമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കാം (ചിത്രം 3b).
a, ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് EPP RNA (dsEPP) അല്ലെങ്കിൽ ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് GFP RNA (dsGFP) നിയന്ത്രണങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് EPP സൈലൻസിംഗ് മൂലമുണ്ടാകുന്ന MAG-യിലെ ഫോസ്ഫേറ്റേസ് പ്രവർത്തനം കുറയുന്നു. ഓരോ റെപ്ലിക്കേറ്റിലും ഇരുപത് MAG പൂളുകൾ ഉപയോഗിച്ചു (P = 0.0046, ജോടിയാക്കിയ ടി-ടെസ്റ്റ്, രണ്ട്-വശങ്ങളുള്ളത്), പ്രത്യേക ഡോട്ടുകൾ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.b, EPP-സൈലൻസ് ചെയ്ത പുരുഷന്മാരുമായി ഇണചേർന്ന സ്ത്രീകൾക്ക് 3 hpm-ൽ ഡീഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് 3D20E യുടെ അനുപാതം ഗണ്യമായി കുറവായിരുന്നു (P = 0.0043, ജോടിയാക്കാത്ത ടി-ടെസ്റ്റ്, രണ്ട്-വശങ്ങളുള്ളത്), അതേസമയം 20E ലെവലുകൾ ബാധിക്കപ്പെട്ടില്ല (P = 0.063, ജോടിയാക്കാത്തത്). ടി-ടെസ്റ്റ്, രണ്ട് വശങ്ങളുള്ളത്). 13, 16, 19 എന്നിങ്ങനെ മൂന്ന് പെൺ ഇനങ്ങളുടെ പൂളുകളിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റ ശരാശരി ± സെം ആയി അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. സി, ഇപിപി-നിശബ്ദമാക്കിയ പുരുഷന്മാരുമായി ഇണചേർന്ന പെൺ ഇണകൾക്ക് വീണ്ടും ഇണചേരാനുള്ള നിരക്ക് ഗണ്യമായി കൂടുതലായിരുന്നു (പി = 0.0002, ഫിഷറിന്റെ കൃത്യമായ പരിശോധന, രണ്ട് വശങ്ങളുള്ളത്). ഇണചേരൽ നില ഉറപ്പാക്കാൻ സ്ത്രീകളെ ആദ്യം ഇണചേരാൻ നിർബന്ധിച്ചു; രണ്ട് ദിവസത്തിന് ശേഷം, ട്രാൻസ്ജെനിക് ബീജം വഹിക്കുന്ന മറ്റ് പുരുഷന്മാരുമായി അവരെ ബന്ധപ്പെട്ടു, ട്രാൻസ്ജെനിക്.ഡിയുടെ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ ഡിറ്റക്ഷൻ വഴി പുനർ-ഇണചേരൽ നിരക്ക് വിലയിരുത്തി. ഇപിപി-നിശബ്ദമാക്കിയ പുരുഷന്മാരുമായി ഇണചേർന്ന രക്തം കുടിക്കുന്ന സ്ത്രീകൾക്ക് പ്രത്യുൽപാദനക്ഷമത ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു (പി < 0.0001; മാൻ-വിറ്റ്നി ടെസ്റ്റ്, രണ്ട് വശങ്ങളുള്ളത്) കൂടാതെ അണ്ഡങ്ങളുടെ എണ്ണം ചെറുതായി കുറഞ്ഞു (പി = 0.088, മാൻ-വിറ്റ്നി ടെസ്റ്റ്, രണ്ട് വശങ്ങളുള്ളത്), അതേസമയം മുട്ടയിടൽ നിരക്കിനെ ബാധിച്ചില്ല (പി = 0.94, ഫിഷേഴ്‌സ് കൃത്യമായ പരിശോധന, രണ്ട് വശങ്ങളുള്ളത്). എല്ലാ പാനലുകളിലും, n എന്നത് ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സ്വതന്ത്രമായ കൊതുക് സാമ്പിളുകളുടെ എണ്ണത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.എൻ.എസ്, പ്രധാനമല്ല.*പി < 0.05, **പി < 0.01, ***പി < 0.001, ****പി < 0.001.
അടുത്തതായി, സ്ത്രീകളിൽ ഇണചേരൽ പ്രതിരോധം ഉണ്ടാക്കുന്നതിന് എക്ഡിസോൺ ഡീഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പ്രധാനമാണോ എന്ന് ഞങ്ങൾ വിലയിരുത്തി. പ്രത്യേകിച്ച്, ഇപിപി-ക്ഷയിച്ച പുരുഷന്മാരുമായി ഇണചേർന്ന സ്ത്രീകൾ, അധിക (ട്രാൻസ്ജെനിക്) പുരുഷന്മാരുമായി സമ്പർക്കം പുലർത്തുമ്പോൾ (ചിത്രം 3c) നിയന്ത്രണ സ്ത്രീകളേക്കാൾ (10.4%) വളരെ ഉയർന്ന ആവൃത്തിയിൽ (44.9%) വീണ്ടും ഇണചേർന്നത് (ചിത്രം 3d, ഇടത്) ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. പ്രത്യുൽപാദനക്ഷമതയിൽ ഗണ്യമായ കുറവും (ചിത്രം 3d, മധ്യഭാഗം) ഈ സ്ത്രീകൾ ഇടുന്ന മുട്ടകളുടെ എണ്ണത്തിൽ നേരിയ കുറവും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, അതേസമയം സ്ത്രീകൾ ഇടുന്ന മുട്ടകളുടെ ശതമാനം (ഇണചേരൽ വഴി സ്ത്രീകളിൽ ഉണ്ടാകുന്ന മറ്റൊരു പ്രതികരണം) ബാധിച്ചില്ല (ചിത്രം 3d, വലത്). 3D20E22P-യുടെ EPP-യുടെ നിരീക്ഷിച്ച പ്രത്യേകത കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, ഇണചേരൽ സമയത്ത് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്ന EPP വഴി 3D20E സജീവമാക്കുന്നത് കൂടുതൽ ഇണചേരലിനുള്ള സ്ത്രീകളുടെ സ്വീകാര്യത ഓഫാക്കുന്നതിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, മുമ്പ് 20E-യുടെ ലൈംഗിക കൈമാറ്റവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഒരു പെരുമാറ്റമാണിത്. അതിനാൽ, ഈ പുരുഷ-നിർദ്ദിഷ്ട ഹോർമോൺ സ്ത്രീകളുടെ പ്രത്യുൽപാദനക്ഷമതയെയും ശക്തമായി ബാധിക്കുന്നു.
അടുത്തതായി, രാസപരമായി സമന്വയിപ്പിച്ച 3D20E (ചിത്രം 4a–c) ഉം വാണിജ്യപരമായി ലഭ്യമായ 20E ഉം ഉപയോഗിച്ച് ലൈംഗിക പക്വതയുള്ള കന്യകമാരിൽ നടത്തിയ കുത്തിവയ്പ്പ് പരീക്ഷണങ്ങളിൽ 20E, 3D20E എന്നിവയുടെ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഞങ്ങൾ താരതമ്യം ചെയ്തു. രണ്ട് സാന്ദ്രതകളിലും ഇണചേരലിനോടുള്ള സ്ത്രീകളുടെ സംവേദനക്ഷമത നിർത്തുന്നതിൽ 3D20E 20E നേക്കാൾ ഗണ്യമായി കൂടുതൽ ഫലപ്രദമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 4d). ശ്രദ്ധേയമായി, LRT-യിലെ 3D20E യുടെ പകുതി ഫിസിയോളജിക്കൽ ലെവൽ (ഇഞ്ചക്ഷന് ശേഷമുള്ള 1,066 pg vs. ഇണചേരലിനു ശേഷമുള്ള 2,022 pg) ഏറ്റവും ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ ഇണചേരലിന് 24 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ് 20E (ഇഞ്ചക്ഷന് ശേഷമുള്ള 361 pg) ഫിസിയോളജിക്കൽ ലെവലിനേക്കാൾ 20 മടങ്ങ് കൂടുതലുള്ള റിഫ്രാക്റ്ററി പെൺ ഇണകളുടെ അനുപാതത്തെ പ്രേരിപ്പിച്ചു; ഇണചേരലിനു ശേഷമുള്ള 18 pg; എക്സ്റ്റൻഡഡ് ഡാറ്റ പട്ടിക 1). 20E യുടെ ലൈംഗിക കൈമാറ്റം ഇണചേരൽ റിഫ്രാക്റ്ററി കാലഘട്ടങ്ങൾക്ക് കാരണമാകില്ല എന്ന ആശയവുമായി ഈ ഫലം പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ രക്ഷാകർതൃ-ശിശു ബന്ധം ഉറപ്പാക്കുന്നതിൽ ഒരു പ്രധാന ഘടകമായി 3D20E യിലേക്ക് കൂടുതൽ വിരൽ ചൂണ്ടുന്നു. കന്യക സ്ത്രീകളിലെ മുട്ടയിടൽ പരിശോധനകളിൽ 3D20E 20E നേക്കാൾ കൂടുതൽ സജീവമായിരുന്നു (ചിത്രം 4e), ഭാഗിക EPP നിശബ്ദതയ്ക്ക് ശേഷം ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ച സാധാരണ മുട്ടയിടൽ നിരക്ക് ഇണചേരൽ-പ്രേരിത സ്ത്രീ ഘടകങ്ങൾ ഇപ്പോഴും ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്ന അവശിഷ്ട 3D20E പ്രവർത്തനത്തിന്റെ സാന്നിധ്യം മൂലമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
(a,b) 20E യിൽ നിന്ന് രാസപരമായി സമന്വയിപ്പിച്ച 3D20E (a) വളരെ ഉയർന്ന പരിവർത്തനം/കാര്യക്ഷമതയോടെ (മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര സിന്തസിസ് പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ശരാശരി ± sem ആയി അവതരിപ്പിച്ച ഡാറ്റ) (b).c, മാസ് സ്പെക്ട്രം (താഴെ പകുതി) ഇണചേർന്ന സ്ത്രീ LRT (മുകളിലെ പകുതി) യിൽ കാണപ്പെടുന്ന എക്ഡിസോണുമായി കൃത്യമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ഫിഷേഴ്‌സ് എക്‌സ്യാക്ട് ടെസ്റ്റ്, ടു-സൈഡഡ്) 10% എത്തനോൾ (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ഫിഷേഴ്‌സ് എക്‌സ്യാക്ട് ടെസ്റ്റ്, 2-സൈഡഡ്) എന്നിവയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ഉയർന്ന ഡോസുകളിൽ മാത്രം 20E നിയന്ത്രണത്തേക്കാൾ ഗണ്യമായി കൂടുതലായിരുന്നു (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ഫിഷേഴ്‌സ് എക്‌സ്‌യാക്ട് ടെസ്റ്റ്, 2-സൈഡഡ്).e, 3D20E കുത്തിവയ്പ്പ് കന്യക സ്ത്രീകളിൽ 10% എത്തനോൾ നിയന്ത്രണങ്ങളേക്കാൾ ഗണ്യമായി ഉയർന്ന സ്‌പോണിംഗ് നിരക്കിന് കാരണമായി (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ഫിഷേഴ്‌സ് എക്‌സ്‌യാക്ട് ടെസ്റ്റ്, ടു-സൈഡഡ്), അതേസമയം 20E ഉയർന്ന ഡോസുകളിൽ മാത്രം (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ഫിഷേഴ്‌സ് എക്‌സ്‌യാക്ട് ടെസ്റ്റ്, ടു-സൈഡഡ്). ഉയർന്ന ഡോസുകളിൽ 20E നേക്കാൾ ഗണ്യമായി ഉയർന്ന സ്‌പോണിംഗ് നിരക്കിന് കാരണമായി (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ഫിഷേഴ്‌സ് എക്‌സ്‌യാക്ട് ടെസ്റ്റ്, ടു-സൈഡഡ്).എല്ലാ പാനലുകളിലും, n ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സ്വതന്ത്രമായ കൊതുക് സാമ്പിളുകളുടെ എണ്ണത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.NS, അല്ല *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. ഡാറ്റ മൂന്ന് പകർപ്പുകളിൽ നിന്നുള്ളതാണ്.
മുൻ പഠനങ്ങളിൽ, സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോണുകളുടെ ലൈംഗിക കൈമാറ്റം MISO (ഇന്റ്യൂസ്ഡ് സ്റ്റിമുലേറ്റർ ഓഫ് ഓജെനിസിസ് 11) യുടെ പ്രകടനത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, ഇത് എ. ഗാംബിയ സ്ത്രീകളെ പി. ഫാൽസിപാരം അണുബാധയിൽ നിന്ന് സംരക്ഷിക്കുന്ന ഒരു സ്ത്രീ പ്രത്യുത്പാദന ജീൻ ആണ്, ഇത് ഏറ്റവും മാരകമായ മനുഷ്യ മലേറിയ പരാദമായ 13 മൂലമുണ്ടാകുന്ന ആരോഗ്യ ചെലവുകൾ. മലേറിയ ബാധിച്ച പ്രദേശങ്ങളിലെ അനോഫിലിസിന്റെ പ്രത്യുത്പാദന ക്ഷമതയ്ക്ക് MISO യുടെ പ്രാധാന്യം കണക്കിലെടുത്ത്, ഏത് ഹോർമോണാണ് ഈ ജീനിന്റെ പ്രകടനത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതെന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഞങ്ങൾ തീരുമാനിച്ചു. 20E കുത്തിവയ്പ്പ് HR3, HR4 പോലുള്ള ചില ന്യൂക്ലിയർ ഹോർമോൺ റിസപ്റ്ററുകളെയും (HR) പ്രത്യേകിച്ച് അല്ലെങ്കിൽ കൂടുതൽ ശക്തമായി പ്രേരിപ്പിക്കുമ്പോൾ, യോക്കോജെനിക് ജീനുകളായ Vg14, 15, 16 പോലുള്ള സാധാരണ ഡൌൺസ്ട്രീം സ്റ്റിറോയിഡ് ലക്ഷ്യങ്ങളെയും MISO കൂടുതൽ ശക്തമായി പ്രേരിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 3). അങ്ങനെ, ഈ ആൻഡ്രോജെനിക് സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോണിന്റെ ലൈംഗിക കൈമാറ്റം പരാദ അണുബാധ മൂലമുണ്ടാകുന്ന ചെലവുകളിൽ നിന്ന് സ്ത്രീകളെ സംരക്ഷിക്കുന്ന സംവിധാനങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതായി തോന്നുന്നു. കൂടാതെ, 3D20E, E റിസപ്റ്റർ EcR-ന്റെ രണ്ട് ഐസോഫോമുകളെയും വ്യത്യസ്തമായി ബാധിക്കുന്നു, EcR-A യെ പ്രേരിപ്പിക്കുകയും EcR-B യെ അടിച്ചമർത്തുകയും ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ HPX15 ഉൾപ്പെടെയുള്ള മറ്റ് ഇണചേരൽ-പ്രേരക ജീനുകളെ കൂടുതൽ ശക്തമായി പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് സ്ത്രീകളുടെ പ്രത്യുൽപാദനക്ഷമതയെ ബാധിക്കുന്നു. EPP- നിശബ്ദമാക്കിയ പുരുഷന്മാരുമായി ഇണചേർന്ന സ്ത്രീകളിൽ കാണപ്പെടുന്ന ഗണ്യമായ വന്ധ്യതയെ ഇത് വിശദീകരിക്കും (വിപുലീകൃത ഡാറ്റ ചിത്രം 3). ലൈംഗിക-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രവർത്തനത്തിന് അടിവരയിടുന്ന രണ്ട് എക്ഡിസോൺ ഹോർമോണുകൾ മുൻഗണന നൽകി സജീവമാക്കിയ താഴ്‌ന്ന പാതകളുടെ നിലനിൽപ്പിനെ ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
അടുത്തതായി, ഞങ്ങളുടെ ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് പൈപ്പ്‌ലൈനിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ രണ്ട് EcK ജീനുകളുടെ പ്രവർത്തനം ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. EcK1 അല്ലെങ്കിൽ EcK2 നിശബ്ദമാക്കുന്നത് പുരുഷന്മാരിൽ ഗണ്യമായ മരണനിരക്കിന് കാരണമായി (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 4a), എക്ഡിസോൺ ഫോസ്ഫോറിലേഷനും അതുവഴി നിഷ്ക്രിയത്വവും അതിജീവനത്തിന് പ്രധാനമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. EcK2 EcK1 നേക്കാൾ ഉയർന്ന തലങ്ങളിൽ പ്രകടിപ്പിക്കുകയും പ്രോട്ടിയോമിക്സ് MAG-കളിൽ കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്തതിനാൽ (ചിത്രം 2b,c, സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 2), 20E ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് ഞങ്ങൾ അതിന്റെ എക്ഡിസ്റ്ററോയിഡ് കൈനേസ് പ്രവർത്തനം സാധൂകരിച്ചു, അതിന്റെ ഫലമായി ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ 20E22P (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 2) ഉണ്ടായി. 4b). 3D20E ഒരു സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ഉൽപ്പന്നമായ 3D20E22P (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 4c) കണ്ടെത്താൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞില്ല, ഇത് EcK2 ന്റെ ഇഷ്ടപ്പെട്ട ലക്ഷ്യമായിരിക്കാം എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഞങ്ങളുടെ RNA-seq വിശകലനം അനുസരിച്ച്, കന്യക സ്ത്രീകളുടെ LRT യിലും EcK2 വളരെ ഉയർന്ന തോതിൽ പ്രകടമായിരുന്നു, അവിടെ ഇണചേരലിനുശേഷം അത് ഓഫാക്കി (ചിത്രം 2b). ഈ ഡാറ്റ ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു, രക്തം നൽകുന്നത് EcK2 എക്സ്പ്രഷനെ ബാധിച്ചിട്ടില്ലെന്ന് കണ്ടെത്തി (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 5a). ഞങ്ങളുടെ പ്രാരംഭ MS പരീക്ഷണങ്ങൾ വിപുലീകരിച്ചുകൊണ്ട്, 20E22P യുടെ പീക്ക് 20E യുടെ പീക്കുമായി അടുത്ത ബന്ധമുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (രക്തഭക്ഷണത്തിന് 22-26 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ്; വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 5b). കന്യക സ്ത്രീകളിൽ EcK2 നിശബ്ദമാക്കുന്നത് രക്തഭക്ഷണത്തിന് 26 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ് 20E മുതൽ 20E22P വരെയുള്ള ആപേക്ഷിക അനുപാതത്തിൽ 3 മടങ്ങ് വർദ്ധനവിന് കാരണമായി (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രങ്ങൾ 2c, 5c), ഇത് സ്ത്രീകളിൽ EcK2 20E ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യുന്നുണ്ടെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു. ശ്രദ്ധേയമായി, EcK2-ക്ഷയിച്ച കന്യകമാർ പൂർണ്ണ ലൈംഗിക സംവേദനക്ഷമത നിലനിർത്തി (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 5d,e), 20E യുടെ സ്ത്രീ ഉത്പാദനം ഇണചേരൽ റിഫ്രാക്റ്ററിക്ക് കാരണമാകുന്നില്ലെന്ന് കൂടുതൽ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ആർത്തവം. എന്നിരുന്നാലും, നിയന്ത്രണങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച് ഈ പെൺമൃഗങ്ങൾക്ക് മുട്ടയിടൽ നിരക്ക് ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു, 30%-ത്തിലധികം കന്യകകൾ മുട്ടയിടുന്നു (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം. 5f). രക്തം കുടിച്ചതിന് ശേഷം ഇരട്ട-സ്ട്രാൻഡഡ് Eck2 RNA (dsEcK2) കുത്തിവയ്പ്പുകൾ നടത്തിയിരുന്നെങ്കിൽ, മുട്ടയിടൽ നടന്നില്ല, ആ ഘട്ടത്തിൽ രക്തം കഴിച്ചതുമൂലം 20E കൊടുമുടി കുറഞ്ഞു. മൊത്തത്തിൽ, രക്തം വലിച്ചെടുത്തതിന് ശേഷം ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്ന 20E മുട്ടയിടലിന് കാരണമാകുമെന്ന ഒരു മാതൃകയെ ഈ ഫലങ്ങൾ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു, പക്ഷേ ഇണചേരൽ വഴി സ്പാനിംഗ് ബ്ലോക്ക് (EcK2 ഉം ഒരുപക്ഷേ മറ്റ് ഘടകങ്ങളും) ഓഫാക്കുമ്പോൾ മാത്രം. 20E അല്ലെങ്കിൽ 3D20E കുത്തിവയ്പ്പുകൾ കന്യകകളിൽ EcK2 എക്സ്പ്രഷനെ തടഞ്ഞില്ല (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം. 5g), മറ്റ് ഘടകങ്ങൾ ഈ കൈനേസിന്റെ തടസ്സത്തിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, രക്തം കഴിച്ചതിന് ശേഷമുള്ള 20E ലെവലുകൾ ഇണചേരൽ അസ്വസ്ഥത ഉണ്ടാക്കാൻ പര്യാപ്തമല്ല, പക്ഷേ ലൈംഗികമായി കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്ന 3D20E യുടെ ഉയർന്ന ടൈറ്ററുകളാൽ ഫലപ്രദമായി ട്രിഗർ ചെയ്യപ്പെട്ടു.
എ. ഗാംബിയയുടെ പ്രത്യുത്പാദന വിജയത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന സംവിധാനങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള പ്രധാന ഉൾക്കാഴ്ചകൾ ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ നൽകുന്നു. 3D20E യുടെ ഉയർന്ന ടൈറ്ററുകളെ സമന്വയിപ്പിക്കാൻ പുരുഷന്മാർ പരിണമിച്ച ഒരു മാതൃക ഉയർന്നുവന്നിട്ടുണ്ട്, ഇത് സ്ത്രീകളെ കൂടുതൽ ഇണചേരാൻ സെൻസിറ്റൈസേഷൻ ഇല്ലാതാക്കുന്നതിലൂടെ പിതൃത്വം ഉറപ്പാക്കുന്ന പുരുഷ-നിർദ്ദിഷ്ട പരിഷ്കരിച്ച എക്ഡിസോണാണ്. അതേസമയം, പുരുഷ-നിർദ്ദിഷ്ട ഇപിപിയുടെ ലൈംഗിക കൈമാറ്റത്തിന് പ്രതികരണമായി സ്ത്രീകളിൽ 3D20E സജീവമാക്കുന്നതിനുള്ള കാര്യക്ഷമമായ ഒരു സംവിധാനവും ഈ മലേറിയ വെക്റ്ററുകൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്. ഞങ്ങളുടെ അറിവിൽ, പ്രാണികളിൽ സവിശേഷവും നിർണായകവുമായ പ്രവർത്തനം നടത്തുന്ന പുരുഷ-സ്ത്രീ ആധിപത്യമുള്ള സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോൺ സിസ്റ്റത്തിന്റെ ആദ്യ ഉദാഹരണമാണിത്. പുരുഷ-നിർദ്ദിഷ്ട എക്ഡിസോൺ പ്രവർത്തനം അനുമാനിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും കൃത്യമായി തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല. ഉദാഹരണത്തിന്, വലിയതോതിൽ തെളിയിക്കപ്പെടാത്ത ഒരു സിദ്ധാന്തം 18, ഈ പ്രവർത്തനങ്ങൾ 20E മുൻഗാമിയായ E1 നിർവ്വഹിക്കാമെന്നതാണ്. ഡ്രോസോഫിലയിൽ, മോണാൻഡ്രി ചെറിയ ലൈംഗിക പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ലൈംഗിക കൈമാറ്റത്തിലൂടെയാണ് ആരംഭിക്കുന്നത് എന്ന് എല്ലാവർക്കും അറിയാം19,20, ഇത് നിർദ്ദിഷ്ട ലൈംഗിക പെപ്റ്റൈഡിലൂടെ സ്ത്രീകളുടെ പ്രത്യുത്പാദന ലഘുലേഖയെ നവീകരിക്കുന്ന ന്യൂറോണുകളുമായി ഇടപഴകുന്നു. റിസപ്റ്ററുകൾ21,22. എ. ഗാംബിയ പെൺജീവികളിൽ 3D20E നിയന്ത്രിക്കുന്ന ഡൌൺസ്ട്രീം സിഗ്നലിംഗ് കാസ്കേഡുകൾ നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനും കൊതുകുകൾക്കും ഡ്രോസോഫിലയ്ക്കും ഇടയിൽ ഈ കാസ്കേഡുകൾ സംരക്ഷിക്കാൻ കഴിയുമോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനും കൂടുതൽ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്.
ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ സ്ത്രീകളുടെ പ്രത്യുൽപാദനത്തിലും പെരുമാറ്റത്തിലും 3D20E യുടെ പ്രധാന പങ്ക് കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, 3D20E സിന്തസിസിനും സജീവമാക്കലിനും കാരണമാകുന്ന പാതകൾ ഭാവിയിലെ കൊതുക് നിയന്ത്രണ തന്ത്രങ്ങൾക്ക് പുതിയ അവസരങ്ങൾ വാഗ്ദാനം ചെയ്യുന്നു, ഉദാഹരണത്തിന് അണുവിമുക്തമായ പ്രാണികളുടെ സാങ്കേതിക തന്ത്രങ്ങളിൽ മത്സരാധിഷ്ഠിതമായ അണുവിമുക്തമായ പുരുഷന്മാരുടെ ഉത്പാദനം. കാട്ടു വിടുതലിനായി ഉപയോഗിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ കന്യക കളിയിൽ 3D20E അനുകരിക്കുക. എ. ഗാംബിയയും മറ്റ് സെല്ലിയ ജീവിവർഗങ്ങളും അവരുടെ ബീജത്തെ ഇണചേരൽ പ്ലഗുകളിലേക്ക് കട്ടപിടിക്കാനുള്ള കഴിവ് നേടിയപ്പോൾ 3D20E യുടെ പുരുഷ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രവർത്തനം വികസിച്ചിരിക്കാം, കാരണം ഇത് ധാരാളം ഹോർമോണുകളുടെയും ഹോർമോൺ-സജീവമാക്കുന്ന എൻസൈമുകളുടെയും കാര്യക്ഷമമായ കൈമാറ്റം അനുവദിക്കുന്നു. അതാകട്ടെ, 3D20E പരിണാമം നടപ്പിലാക്കുന്നത് മോണാൻഡ്രി ഉയർന്ന മലേറിയ വ്യാപനമുള്ള പ്രദേശങ്ങളിൽ സ്ത്രീകൾക്ക് (MISO യുടെ ഉയർന്ന പ്രകടനത്തിലൂടെ) അവരുടെ പ്രത്യുത്പാദന ക്ഷമതയെ അനുകൂലിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു സംവിധാനം നൽകുന്നു, ഇത് പരോക്ഷമായി പ്ലാസ്മോഡിയം സംക്രമണത്തിന് കാരണമാകുന്നു. പെൺ അനോഫിലിസ് കൊതുകുകളിൽ പി. ഫാൽസിപാറത്തിന്റെ അതിജീവനത്തിലും വളർച്ചയിലും പെൺ 20E ആഴത്തിലുള്ള സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നുണ്ടെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളതിനാൽ, 24 ആൺ, പെൺ സ്റ്റിറോയിഡ് ഹോർമോൺ പാതകൾ ഇപ്പോൾ കൊതുക്-പരാദ ഇടപെടലുകളുടെ പ്രധാന വശങ്ങളാണ്.
A. gambiae G3 വർഗ്ഗങ്ങളെ സാധാരണ പ്രാണികളുടെ സാഹചര്യങ്ങളിൽ (26-28 °C, 65-80% ആപേക്ഷിക ആർദ്രത, 12:12 മണിക്കൂർ വെളിച്ചം/ഇരുണ്ട ഫോട്ടോപീരിയഡ്) വളർത്തി. ലാർവകൾക്ക് പൊടിച്ച മത്സ്യ ഭക്ഷണം (ടെട്രാമിൻ ട്രോപ്പിക്കൽ ഫ്ലേക്സ്, കോയി പെല്ലറ്റുകൾ, ടെട്രാ പോണ്ട് സ്റ്റിക്കുകൾ എന്നിവ 7:7:2 എന്ന അനുപാതത്തിൽ) നൽകി. മുതിർന്ന കൊതുകുകൾക്ക് അഡ് ലിബിറ്റം 10% ഡെക്‌സ്ട്രോസ് ലായനിയും ആഴ്ചതോറുമുള്ള മനുഷ്യ രക്തവും നൽകി (രക്ത ഘടകങ്ങൾ പഠിക്കുക). സൂക്ഷ്മദർശിനി ഉപയോഗിച്ച് അറ്റങ്ങൾ പരിശോധിച്ച ശേഷം പ്യൂപ്പൽ ഘട്ടത്തിൽ ലിംഗഭേദം വേർതിരിച്ചാണ് കന്യക കൊതുകുകളെ ലഭിച്ചത്. DsRed ട്രാൻസ്ജീൻ വഹിക്കുന്ന പുരുഷന്മാരെ മുമ്പ് വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട്.
മുമ്പ് വിവരിച്ച പ്രോട്ടോക്കോളുകൾ അനുസരിച്ചാണ് നിർബന്ധിത ഇണചേരൽ പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തിയത്. സ്വാഭാവിക ഇണചേരലിനായി, 4 ദിവസം പ്രായമുള്ള കന്യക പെൺമൃഗങ്ങളെ ലൈംഗിക പക്വതയുള്ള കന്യക പെൺമൃഗങ്ങളുമായി 1:3 അനുപാതത്തിൽ രണ്ട് രാത്രികളിൽ സൂക്ഷിച്ചു. പുരുഷന്മാർക്ക് dsEPP കുത്തിവച്ച പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, ഫോസ്ഫേറ്റസ് പ്രവർത്തനം പരമാവധി നിശബ്ദമാക്കിയപ്പോൾ, കുത്തിവയ്പ്പിന് ശേഷമുള്ള 3-4 ദിവസങ്ങളിൽ സഹ-കൂടുകൾ ഒത്തുചേർന്നു (വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 2b).
കൊതുക് കലകൾ, ശേഷിക്കുന്ന ശവശരീരങ്ങൾ (ശരീരത്തിന്റെ ബാക്കി ഭാഗം), അല്ലെങ്കിൽ മുഴുവൻ ശരീരവും 100% മെഥനോൾ ആയി വിഘടിപ്പിച്ച് ഒരു ബീഡർ (2 mm ഗ്ലാസ് ബീഡുകൾ, 2,400 rpm, 90 സെക്കൻഡ്) ഉപയോഗിച്ച് ഏകീകൃതമാക്കി. ടിഷ്യു അളവുകളും മെഥനോൾ അളവുകളും ഇപ്രകാരമായിരുന്നു: ശരീരത്തിന്റെ ബാക്കി ഭാഗം, 1,000 µl-ൽ 50; MAG, 50–100 80 µl; പെൺ LRT, 25–50 80 µl. അതേ അളവിലുള്ള മെഥനോൾ ഉപയോഗിച്ച് അവശിഷ്ടം രണ്ടാമത്തെ മെഥനോൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കലിന് വിധേയമാക്കി. സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി കോശ അവശിഷ്ടങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്തു. രണ്ട് വേർതിരിച്ചെടുക്കലുകളിൽ നിന്നുമുള്ള മെഥനോൾ സംയോജിപ്പിച്ച് നൈട്രജൻ പ്രവാഹത്തിൽ ഉണക്കി, തുടർന്ന് വെള്ളത്തിൽ 80% മെഥനോൾ ചേർത്ത് വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു: ശരീരത്തിന്റെ ബാക്കി ഭാഗം, 50 µl; MAG-കളും പെൺ LRT-യും, 30 µl.
ഒരു മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ (ID-X, തെർമോ ഫിഷർ) ഒരു LC ഉപകരണവുമായി (വാൻക്വിഷ്, തെർമോ ഫിഷർ) സംയോജിപ്പിച്ചാണ് സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്തത്. 25 °C-ൽ നിലനിർത്തിയിരുന്ന 3 µm, 100 × 4.6 mm കോളത്തിലേക്ക് (ഇൻസ്പയർ C8, ഡിക്മ) 5 µl സാമ്പിൾ കുത്തിവച്ചു. LC-യുടെ മൊബൈൽ ഘട്ടങ്ങൾ A (വെള്ളം, 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡ്), B (അസെറ്റോണിട്രൈൽ, 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡ്) എന്നിവയായിരുന്നു. LC ഗ്രേഡിയന്റ് ഇപ്രകാരമായിരുന്നു: 1 മിനിറ്റിന് 5% B, തുടർന്ന് 11 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 100% B ആയി വർദ്ധിച്ചു. 100%-ൽ 8 മിനിറ്റിനു ശേഷം, 4 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 5% B-യിൽ കോളം വീണ്ടും സന്തുലിതമാക്കുക. ഫ്ലോ റേറ്റ് 0.3 ml ആയിരുന്നു min-1. MS സ്രോതസ്സിലെ അയോണൈസേഷൻ പോസിറ്റീവ്, നെഗറ്റീവ് മോഡുകളിൽ ചൂടാക്കിയ ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോണൈസേഷൻ വഴിയാണ് സാധ്യമാകുന്നത്.
മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ 350 മുതൽ 680 വരെയുള്ള m/z ശ്രേണിയിലുള്ള ഡാറ്റയെ പൂർണ്ണ MS മോഡിൽ 60,000 റെസല്യൂഷനിൽ അളക്കുന്നു. [M + H]+ (എല്ലാ ടാർഗെറ്റുകളും), [M - H2O + H]+ (എല്ലാ ടാർഗെറ്റുകളും), [M - H]- (ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ടാർഗെറ്റുകളും) എന്നിവയിൽ MS/MS ഡാറ്റ നേടി. ഒരു മാനദണ്ഡവും ലഭ്യമല്ലാത്ത ടാർഗെറ്റുകളുടെ എക്ഡിസോൺ ഗുണങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിക്കാൻ MS/MS ഡാറ്റ ഉപയോഗിച്ചു. ലക്ഷ്യമിടാത്ത എക്ഡിസ്റ്ററോയിഡുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ, >15% ആപേക്ഷിക സമൃദ്ധിയുള്ള എല്ലാ HPLC കൊടുമുടികൾക്കുമുള്ള MS/MS ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്തു. ശുദ്ധമായ മാനദണ്ഡങ്ങളിൽ നിന്ന് സൃഷ്ടിച്ച സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഒരു നിർദ്ദിഷ്ട സാമ്പിളിന്റെ (മറ്റെല്ലാ ടാർഗെറ്റുകളുടെയും) കേവല അളവുകളോ നേർപ്പിക്കലുകളോ കണക്കാക്കാൻ ഒരു പുരുഷനിൽ കണ്ടെത്തിയ അളവുകളുമായി അവയുടെ തുല്യത കണക്കാക്കുക. 3D20E-ക്ക്, ഇനിപ്പറയുന്ന അഡക്റ്റുകളുടെ ആകെത്തുക ഉപയോഗിച്ച് അളവ് നടത്തി: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.ട്രേസ്ഫൈൻഡർ (പതിപ്പ് 4.1) ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ വേർതിരിച്ചെടുത്ത് അളവ് നിർണ്ണയിച്ചു. എക്സ്കാലിബർ (പതിപ്പ് 4.4) ഉപയോഗിച്ച് എംഎസ്/എംഎസ് ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്തു. ഇ, 20ഇ, 3D20ഇ എന്നിവയുടെ എംഎസ് സ്പെക്ട്രയെ അതത് മാനദണ്ഡങ്ങളുമായി താരതമ്യം ചെയ്തു. ഗിറാർഡിന്റെ റിയാജന്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഡെറിവേറ്റൈസേഷൻ വഴി 3D20E22P വിശകലനം ചെയ്തു. 20E22P m/z അനുപാതത്തിൽ വിശകലനം ചെയ്തു.
MAG-ൽ നിന്ന് 3D20E22P ശുദ്ധീകരിച്ചു. HPLC-MS/MS വിശകലനത്തിന്റെ അതേ LC സാഹചര്യങ്ങളിൽ, ക്വാഡ്രുപോൾ മാസ്-ബേസ്ഡ് ഡിറ്റക്ടർ (QDa, അക്വിറ്റി, വാട്ടേഴ്‌സ്) ഉപയോഗിച്ച് അൾട്രാ-പെർഫോമൻസ് ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫ് (അക്വിറ്റി, വാട്ടേഴ്‌സ്) ഉപയോഗിച്ച് ഒരു വിശകലന സ്കെയിലിൽ ശുദ്ധീകരണം നടത്തി. മുമ്പ് നിശ്ചയിച്ച അതേ നിലനിർത്തൽ സമയത്ത് 3D20E22P-യുമായി ബന്ധപ്പെട്ട m/z കണ്ടെത്തിയപ്പോൾ ഫ്രാക്ഷൻ ശേഖരണം ട്രിഗർ ചെയ്തു. മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ വേർതിരിച്ചെടുത്ത സംയുക്തങ്ങളുടെ പരിശുദ്ധി HPLC-MS/MS പരിശോധിച്ചു.
നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിച്ച് TRI റിയാജന്റ് (തെർമോ ഫിഷർ) ഉപയോഗിച്ച് 10-12 പ്രത്യുത്പാദന കലകളിൽ നിന്നോ ശരീരത്തിന്റെ മറ്റ് ഭാഗങ്ങളിൽ നിന്നോ (തലയില്ലാത്തത്) മൊത്തം RNA വേർതിരിച്ചെടുത്തു. RNA TURBO DNase (തെർമോ ഫിഷർ) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു. നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിച്ച് മോളോണി മുറിൻ ലുക്കീമിയ വൈറസ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് (M-MLV RT; തെർമോ ഫിഷർ) ഉപയോഗിച്ചാണ് cDNA സമന്വയിപ്പിച്ചത്. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR (RT-qPCR; എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ടേബിൾ 2) നുള്ള പ്രൈമറുകൾ മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ചിരുന്നു24 അല്ലെങ്കിൽ പ്രൈമർ-BLAST26 ഉപയോഗിച്ച് രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരുന്നു, 70-150 bp വലുപ്പമുള്ളതും സ്പാനിംഗ് എക്സോൺ-എക്സോൺ ജംഗ്ഷനുകളുള്ളതോ പ്രൈമർ പെയർ പ്രൈമറുകളോ ഉള്ള ഉൽപ്പന്നങ്ങൾക്ക് മുൻഗണന നൽകി. മൂന്ന് മുതൽ നാല് വരെ ബയോളജിക്കൽ റെപ്ലിക്കേറ്റുകളിൽ നിന്നുള്ള cDNA സാമ്പിളുകൾ RT-qPCR-നായി വെള്ളത്തിൽ നാലിരട്ടി ലയിപ്പിച്ചു. 1× PowerUp SYBR ഗ്രീൻ മാസ്റ്റർ മിക്സ് (തെർമോ ഫിഷർ), പ്രൈമറുകൾ, 5 µl നേർപ്പിച്ച cDNA എന്നിവ അടങ്ങിയ 15 µl റെപ്ലിക്കേറ്റ് പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളിൽ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ നടത്തി. പ്രതികരണങ്ങൾ ഒരു ക്വാണ്ട്സ്റ്റുഡിയോ 6 പ്രോ റിയൽ-ടൈം പിസിആർ സിസ്റ്റവും (തെർമോ ഫിഷർ) ഡാറ്റയും ഡിസൈൻ ആൻഡ് അനാലിസിസ് (പതിപ്പ് 2.4.3) ഉപയോഗിച്ച് ശേഖരിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. ഈ പഠനത്തിൽ കാണിച്ചതുപോലെ, ആപേക്ഷിക അളവ് റൈബോസോമൽ ജീൻ RpL19 (AGAP004422) ലേക്ക് സാധാരണവൽക്കരിച്ചു, അതിന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ രക്തം നൽകുമ്പോഴോ ഇണചേരുമ്പോഴോ കാര്യമായ മാറ്റമൊന്നും വരുത്തിയില്ല.
ഒരു Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ഉപയോഗിച്ച് RNA ഗുണനിലവാരം പരിശോധിച്ചു. ബ്രോഡ് ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഓഫ് MIT, ഹാർവാർഡ് എന്നിവിടങ്ങളിൽ Illumina പെയർ-എൻഡ് ലൈബ്രറികൾ തയ്യാറാക്കി പ്രവർത്തിപ്പിച്ചു. HISAT2 (പതിപ്പ് 2.0.5) ഉപയോഗിച്ച് A. gambiae ജീനോമുമായി (PEST സ്ട്രെയിൻ, പതിപ്പ് 4.12) സീക്വൻസിങ് റീഡുകൾ വിന്യസിച്ചു. മാപ്പിംഗ് ഗുണനിലവാരമുള്ള (MAPQ) സ്കോറുകൾ <30 ഉള്ള റീഡുകൾ Samtools (പതിപ്പ് 1.3.1) ഉപയോഗിച്ച് നീക്കം ചെയ്തു. ജീനുകളിലേക്ക് മാപ്പ് ചെയ്ത റീഡുകളുടെ എണ്ണം ഡിഫോൾട്ട് പാരാമീറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് htseq-count (പതിപ്പ് 0.9.1) ഉപയോഗിച്ച് എണ്ണി. R (പതിപ്പ് 4.0.3) ലെ DESeq2 പാക്കേജ് (പതിപ്പ് 1.28.1) ഉപയോഗിച്ച് നോർമലൈസ് ചെയ്ത റീഡ് കൗണ്ടുകൾ കണക്കാക്കി, ഡിഫറൻഷ്യൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം ചെയ്തു.
PSI-BLAST അൽഗോരിതം (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ഉപയോഗിച്ച് എ. ഗാംബിയ ജീനോമിൽ ആദ്യം തിരച്ചിൽ നടത്തിയാണ് എക്ഡിസോൺ-പരിഷ്കരിക്കുന്ന ജീൻ സ്ഥാനാർത്ഥികളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞത്. സ്ഥിരസ്ഥിതി മൂല്യങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇനിപ്പറയുന്ന ക്വറി പ്രോട്ടീൻ സീക്വൻസുകളുള്ള പാരാമീറ്ററുകൾ: ബോംബിക്സ് മോറി (ആക്സസ്ഷൻ നമ്പർ. NP_001038956.1), മസ്ക ഡൊമെസ്റ്റിക്ക (ആക്സസ്ഷൻ നമ്പർ. XP_005182020.1, XP_005175332.1, XP_011294434.1), മൈക്രോപ്ലൈറ്റിസ് ഡെമോലിറ്റർ (ആക്സസ്ഷൻ നമ്പർ. XP_008552646.1, XP_008552645.1) എന്നിവയിൽ നിന്നുള്ള EcK ബി. മോറി (ആക്സസ്ഷൻ നമ്പർ. NP_001036900), ഡ്രോസോഫില മെലനോഗാസ്റ്റർ (ആക്സസ്ഷൻ നമ്പർ. NP_651202), ആപിസ് മെല്ലിഫെറ (ആക്സഷൻ നമ്പർ. XP_394838) അസൈർത്തോസിഫോൺ പിസം (ആക്സഷൻ നമ്പർ. XP_001947166); ബി. മോറിയിൽ നിന്നുള്ള ഇപിപി (ആക്സഷൻ നമ്പർ. XP_001947166) NP_001177919.1, NP_001243996.1), ഡി. മെലനോഗാസ്റ്ററിന്റെ ഇഒ (ആക്സഷൻ നമ്പർ. NP_572986.1) (ഘട്ടം 1). അടുത്തതായി, ഗാംബിയയിലെ പ്രത്യുത്പാദന കലകളിൽ (സ്ത്രീ LRT അല്ലെങ്കിൽ MAG) ഉയർന്ന mRNA എക്സ്പ്രഷൻ (>100 ഫ്രാഗ്മെന്റുകൾ/കിലോബേസ് എക്സോണുകൾ പെർ മില്യൺ മാപ്പ്ഡ് റീഡുകൾ (FPKM) അല്ലെങ്കിൽ >85%) അടിസ്ഥാനമാക്കി ഫിൽട്ടർ ഹിറ്റുകൾ (ഘട്ടം 2). പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനായി, ഇണചേരൽ സമയത്ത് എക്ഡിസോൺ സമന്വയിപ്പിക്കുകയോ കൈമാറ്റം ചെയ്യുകയോ ചെയ്യാത്ത അനോഫിലിസ് ഇനമായ എ. ആൽബിമാനസിന്റെ പ്രത്യുത്പാദന കലയിലും പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കാൻഡിഡേറ്റ് എൻസൈമുകൾ ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു. എ. ആൽബിമാനസ് പ്രത്യുത്പാദന കലയിലെ (ഘട്ടം 3) കുറഞ്ഞ എക്സ്പ്രഷൻ (<100 FPKM അല്ലെങ്കിൽ <85-ാം ശതമാനം) അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് കാൻഡിഡേറ്റ് ജീനുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്തത്. ഒരു അന്തിമ ഫിൽട്ടർ എന്ന നിലയിൽ (ഘട്ടം 4), കാൻഡിഡേറ്റ് ജീനുകൾ ഇനിപ്പറയുന്നവയിൽ ഒന്നെങ്കിലും തൃപ്തിപ്പെടുത്തേണ്ടതുണ്ട്: (1) വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ജീനുകളുടെ വിശകലനം അനുസരിച്ച് ഇണചേരലിനുശേഷം ഗണ്യമായി മുകളിലേക്ക് നിയന്ത്രിച്ചിരിക്കുന്നു (P < 0.05), (2) പ്രത്യുത്പാദനപരമല്ലാത്ത കലകളിൽ (<85 % അല്ലെങ്കിൽ <100 FPKM).
മുമ്പ് വിവരിച്ച രീതികൾ 28,29,30 ൽ മുഴുവൻ ജീവജാലങ്ങളുടെയും ഐസോടോപ്പിക് ലേബലിംഗ് നേടുന്നതിനായി ഞങ്ങൾ പരിഷ്കരിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് സാക്കറോമൈസിസ് സെറിവിസിയ ടൈപ്പ് II (YSC2, സിഗ്മ) നൈട്രജന്റെ ഏക ഉറവിടമായി യീസ്റ്റ് നൈട്രജൻ ബേസിൽ (BD Difco, DF0335) (wt/vol) 2% ഗ്ലൂക്കോസ് (G7528, സിഗ്മ), 1.7% അമിനോ ആസിഡ്-രഹിതവും അമോണിയം സൾഫേറ്റ്. കൾച്ചർ മീഡിയം), 5% 15N അമോണിയം സൾഫേറ്റ് (NLM-713, >99%, കേംബ്രിഡ്ജ് ഐസോടോപ്പ് ലബോറട്ടറീസ്) എന്നിവ അടങ്ങിയ യീസ്റ്റ് നൈട്രജൻ ബേസിൽ (BD Difco, DF0335) നൈട്രജന്റെ ഏക ഉറവിടമായി പരീക്ഷിച്ചു. സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി യീസ്റ്റ് വീണ്ടെടുക്കുകയും കൊതുക് ലാർവകൾക്ക് പ്യൂപ്പേഷൻ വരെ അഡ് ലിബിറ്റം നൽകുകയും ചെയ്തു. നാലാമത്തെ ഇൻസ്റ്റാർ മരണനിരക്ക് തടയാൻ മത്സ്യമാംസം (300 ലാർവകൾക്ക് 0.5 മില്ലിഗ്രാം) അടങ്ങിയ സപ്ലിമെന്റ്. ഇണചേരൽ സമയത്ത് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്ന ആൺ പ്രോട്ടീം വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനായി ലേബൽ ചെയ്യാത്ത ആൺ പ്രോട്ടീമുമായി ഇണചേരൽ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ സ്ത്രീകളെ മാത്രമേ ഉപയോഗിച്ചിരുന്നുള്ളൂ.
4-6 ദിവസം പ്രായമുള്ള 15N-ടാഗ് ചെയ്ത കന്യക പെൺമൃഗങ്ങളെ പ്രായവുമായി പൊരുത്തപ്പെടാത്ത ടാഗ് ചെയ്യാത്ത കന്യക പുരുഷന്മാരുമായി ഇണചേരാൻ നിർബന്ധിച്ചു. എപ്പിഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പിയിൽ ഇണചേരൽ പ്ലഗുകൾ കണ്ടെത്തി വിജയകരമായ ഇണചേരൽ പരിശോധിച്ചു. 3, 12, 24 hpm എന്നിവയിൽ, 45-55 ഇണചേരൽ പെൺമൃഗങ്ങളുടെ ആട്രിയയെ 50 µl അമോണിയം ബൈകാർബണേറ്റ് ബഫറായി (pH 7.8) വിഘടിപ്പിച്ച് ഒരു പെസ്റ്റൽ ഉപയോഗിച്ച് ഏകീകൃതമാക്കി. ഹോമോജെനേറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്ത് സൂപ്പർനേറ്റന്റ് 50 mM അമോണിയം ബൈകാർബണേറ്റിൽ 0.1% റാപ്പിജെസ്റ്റിന്റെ (186001860, വാട്ടേഴ്സ്) 50 µl-ൽ കലർത്തി. ഓരോ സാമ്പിളിൽ നിന്നുമുള്ള സൂപ്പർനേറ്റന്റും പെല്ലറ്റും ഡ്രൈ ഐസിൽ ഫ്രീസുചെയ്‌ത് ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് വാഷിംഗ്ടൺ സർവകലാശാലയിലെ മാക്കോസ് ലബോറട്ടറിയിലേക്ക് അയച്ചു, അവിടെ LC-MS/MS-നുള്ള സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കൽ പൂർത്തിയായി. 50 mM അമോണിയത്തിൽ 0.1% റാപ്പിജെസ്റ്റിന്റെ 50 µl-ൽ പെല്ലറ്റ് വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു. ഒരു വാട്ടർ ബാത്തിൽ ബൈകാർബണേറ്റും സോണിക്കേറ്റും. പെല്ലറ്റിന്റെയും സൂപ്പർനേറ്റന്റിന്റെയും പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത BCA അസ്സേ ഉപയോഗിച്ച് അളന്നു, സാമ്പിളുകൾ 5 mM ഡൈതിയോത്രെയിറ്റോൾ (DTT; സിഗ്മ) ഉപയോഗിച്ച് കുറച്ചു, 15 mM അയോഡോഅസെറ്റാമൈഡ് (സിഗ്മ) ഉപയോഗിച്ച് ആൽക്കൈലേറ്റ് ചെയ്തു, ട്രിപ്സിനൈസേഷൻ: ട്രിപ്സിൻ:സബ്‌സ്ട്രേറ്റ് അനുപാതം ഉപയോഗിച്ച് 1 മണിക്കൂർ 37 °C (1:0 50) ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. റാപ്പിജെസ്റ്റ് 200 mM HCl ചേർത്ത് ലൈസ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് 37 °C ൽ 45 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, 4 °C ൽ 10 മിനിറ്റ് 14,000 rpm ൽ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ നടത്തി അവശിഷ്ടങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്തു. സാമ്പിളുകൾ ഡ്യുവൽ-മോഡ് സോളിഡ്-ഫേസ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ (ഒയാസിസ് MCX കാട്രിഡ്ജുകൾ, വാട്ടർസ്) ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, 0.33 µg µl-1 എന്ന അന്തിമ പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയ്ക്കായി 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു. കന്യക പുരുഷന്മാരിൽ നിന്ന് ലേബൽ ചെയ്യാത്ത MAG പ്രോട്ടീനുകളും സമാനമായി വിശകലനം ചെയ്തു. രണ്ട് ഓരോ സാമ്പിളിനും വിശകലന പകർപ്പുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു. അടുത്തതായി, ജൂപ്പിറ്റർ C12 റിവേഴ്‌സ്ഡ്-ഫേസ് റെസിൻ (ഫിനോമെനെക്സ്), 180 മിനിറ്റ് ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് പായ്ക്ക് ചെയ്ത 4-സെ.മീ ഫ്യൂസ്ഡ് സിലിക്ക കാസിൽ1 (PQ) ഫ്രിറ്റ് ട്രാപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് 25-സെ.മീ ഫ്യൂസ്ഡ് സിലിക്ക 75-μm കോളം ഉപയോഗിച്ച് ഓരോന്നിന്റെയും 1 µg വിശകലനം ചെയ്തു. സാമ്പിൾ ഡൈജസ്റ്റുകൾ - നാനോഎക്യുഐടി യുപിഎൽസി സിസ്റ്റം (വാട്ടേഴ്സ്) ഉപയോഗിച്ച് ഒരു ക്യു-എക്‌സാക്ടീവ് എച്ച്എഫ് മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ (തെർമോ ഫിഷർ) എംഎസ്/എംഎസ് പ്രവർത്തിപ്പിച്ചു. ഓരോ റണ്ണിനും ജനറേറ്റ് ചെയ്‌ത ഡാറ്റാ-അനുബന്ധ അക്വിസിഷൻ ഡാറ്റ പ്രോട്ടിയോവിസാർഡ് (പതിപ്പ് 3.0.20287) ഉപയോഗിച്ചും അനോഫിലിസ് ഗാംബിയ (വെക്ടർബേസ് പതിപ്പ് 54), അനോഫിലിസ് കൊളുസി എന്നിവയിൽ നിന്നുള്ള പ്രോട്ടീൻ സീക്വൻസുകൾ അടങ്ങിയ ഫാസ്റ്റ ഡാറ്റാബേസിനെതിരെ കോമെറ്റ്31 (പതിപ്പ് 3.2) ഉപയോഗിച്ചും mzML ഫോർമാറ്റിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്‌തു. മാലി-എൻഐഎച്ച് (വെക്ടർബേസ് പതിപ്പ് 54), സാക്കറോമൈസസ് സെറെവിസിയ (യൂണിപ്രോട്ട്, മാർച്ച് 2021), എ. ഗാംബിയ ആർഎൻഎ-സെക്, അറിയപ്പെടുന്ന മനുഷ്യ മലിനീകരണത്തിന്റെ മൂന്ന്-ഫ്രെയിം വിവർത്തനങ്ങൾ എന്നിവയിൽ ഒരു തിരയൽ നടത്തി. പെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പ്-മാച്ച് ചെയ്‌ത എഫ്‌ഡി‌ആറുകൾ 0.01 എന്ന പരിധിയുള്ള പെർക്കോലേറ്റർ32 (പതിപ്പ് 3.05) ഉപയോഗിച്ച് നിർണ്ണയിച്ചു, കൂടാതെ പ്രോട്ടീൻ പാർസിമണി ഉപയോഗിച്ച് പെപ്റ്റൈഡുകൾ പ്രോട്ടീൻ ഐഡന്റിഫിക്കേഷനുകളായി കൂട്ടിച്ചേർക്കപ്പെട്ടു. ലൈംലൈറ്റ്33 (പതിപ്പ് 2.2.0). മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ, ഓരോ റണ്ണിലും ഓരോ പ്രോട്ടീനിനും കണക്കാക്കിയ നോർമലൈസ്ഡ് സ്പെക്ട്രൽ അബൻഡൻസി ഫാക്ടർ (NSAF) ഉപയോഗിച്ചാണ് ആപേക്ഷിക പ്രോട്ടീൻ സമൃദ്ധി കണക്കാക്കിയത്. രണ്ട് വ്യത്യസ്ത ജൈവ പകർപ്പുകളിൽ നിന്നുള്ള സാമ്പിളുകളിൽ ഓരോ പ്രോട്ടീനുമായും താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ NSAF ശരാശരി കണക്കാക്കി. ലേബൽ ചെയ്ത കന്യകകളിൽ നിന്ന് ചെറിയ അളവിൽ ലേബൽ ചെയ്യാത്ത പ്രോട്ടീൻ കണ്ടെത്താൻ കഴിയുമെങ്കിലും 15N ലേബലിംഗ് സ്ത്രീ പ്രോട്ടീമിനെ വിജയകരമായി മറച്ചു. HPLC "കാരി ഓവർ" യുടെ ഫലമായി പുരുഷ/ഇണചേരൽ സാമ്പിളുകൾക്ക് ശേഷം അസംസ്കൃത സാമ്പിളുകൾ പ്രവർത്തിപ്പിച്ച സാങ്കേതിക റണ്ണുകളിൽ മാത്രം സ്ത്രീ അസംസ്കൃത സാമ്പിളുകളിൽ പുരുഷ പ്രോട്ടീൻ കുറവ് (1-5 സ്പെക്ട്ര) കണ്ടെത്തൽ ഞങ്ങൾ രേഖപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. ലേബൽ ചെയ്ത കന്യകകളിൽ നിന്ന് 'മലിനീകരണം' ആയി കാണപ്പെടുന്ന ഇടയ്ക്കിടെയുള്ള പ്രോട്ടീനുകൾ സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 1 ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു.
ജെൻസ്ക്രിപ്റ്റിൽ രണ്ട് ആന്റിജനിക് പെപ്റ്റൈഡുകൾ, QTTDRVAPAPDQQQ (ഐസോടൈപ്പ് PA-യിൽ) ഉം MESDGTTPSGDSEQ (ഐസോടൈപ്പ് PA-യിലും PB-യിലും) ഉം. രണ്ട് പെപ്റ്റൈഡുകളും സംയോജിപ്പിച്ച്, പിന്നീട് കാരിയർ പ്രോട്ടീൻ KLH-ലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ച് ന്യൂസിലാൻഡ് മുയലുകളിൽ കുത്തിവച്ചു. നാലാമത്തെ കുത്തിവയ്പ്പിന് ശേഷം മുയലുകളെ ബലിയർപ്പിച്ചു, അഫിനിറ്റി ശുദ്ധീകരണം വഴി മൊത്തം IgG വേർതിരിച്ചു. ഏറ്റവും കൂടുതൽ EPP-നിർദ്ദിഷ്ട മുയലിൽ നിന്നുള്ള IgG കൂടുതൽ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗിനായി ഉപയോഗിച്ചു.
വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടുകൾക്ക്, 4 ദിവസം പ്രായമുള്ള കന്യക പുരുഷന്മാരിൽ നിന്നും കന്യക അല്ലെങ്കിൽ ബലപ്രയോഗത്തിലൂടെ ഇണചേർന്ന സ്ത്രീകളിൽ നിന്നുമുള്ള MAG (n = 10, ഇവിടെ n എന്നത് ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സ്വതന്ത്രമായ കൊതുക് സാമ്പിളുകളുടെ എണ്ണത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു) പെൺ LRT (n = 30) (<10 ഇണചേരലിനു ശേഷമുള്ളവ), പ്രോട്ടീൻ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ബഫർ (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% സോഡിയം ഡീഓക്സിചോളേറ്റ്; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്റർ കോക്ക്ടെയിൽ (റോച്ചെ)) പ്രത്യേകം ചേർത്തു. ഒരു ബീഡർ ഉപയോഗിച്ച് വിഭജിച്ച ഉടൻ തന്നെ സാമ്പിളുകൾ ഏകീകൃതമാക്കി (2 mm ഗ്ലാസ് ബീഡുകൾ, 2,400 rpm, 90 സെക്കൻഡ്). 4 °C-ൽ 20,000 ഗ്രാം സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ലയിക്കാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്തു. ബ്രാഡ്‌ഫോർഡ് അസ്സേ (ബയോ-റാഡ്) പ്രോട്ടീനുകൾ അളന്നു. തുടർന്ന്, 20 µg MAG പ്രോട്ടീൻ, 40 µg LRT പ്രോട്ടീൻ, കൂടാതെ 20 µg ശേഷിക്കുന്ന ബൾക്ക് പ്രോട്ടീൻ MOPS ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 10% Bis-Tris NuPAGE ഉപയോഗിച്ച് ഡീനാച്ചർ ചെയ്യുകയും വേർതിരിക്കുകയും ചെയ്തു. iBlot2 ട്രാൻസ്ഫർ സിസ്റ്റം (തെർമോ ഫിഷർ) ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീനുകൾ പോളി വിനൈലിഡിൻ ഫ്ലൂറൈഡ് മെംബ്രണുകളിലേക്ക് മാറ്റി. 1× PBS-T (PBS-ൽ 0.1% Tween-20) ൽ മെംബ്രണുകൾ രണ്ടുതവണ കഴുകി, തുടർന്ന് 22°C ൽ ഒഡീസി ബ്ലോക്കിംഗ് ബഫറിൽ (Li-Cor) 1 മണിക്കൂർ തടഞ്ഞു. കസ്റ്റം റാബിറ്റ് ആന്റി-ഇപിപി പോളിക്ലോണൽ പ്രൈമറി ആന്റിബോഡി (ബ്ലോക്കിംഗ് ബഫറിൽ 1:700), എലി ആന്റി-ആക്ടിൻ മോണോക്ലോണൽ പ്രൈമറി ആന്റിബോഡി MAC237 (Abeam; 1:4,000) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 4°C ൽ രാത്രി മുഴുവൻ മെംബ്രണുകളെ കുലുക്കി. PBS-T ഉപയോഗിച്ച് മെംബ്രണുകളെ കഴുകി, തുടർന്ന് 0.01% അടങ്ങിയ ബ്ലോക്കിംഗ് ബഫറിൽ സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡികൾ (കഴുത ആന്റി-റാബിറ്റ് 800CW, ആട് ആന്റി-റാറ്റ് 680LT (Li-Cor), രണ്ടും 1:20,000) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. 22 °C താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് SDS ഉം 0.2% Tween -20 ഉം. PBS-T ഉപയോഗിച്ച് മെംബ്രണുകൾ കഴുകുകയും ഒഡീസി CLx സ്കാനർ ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രീകരിക്കുകയും ചെയ്തു. ഇമേജുകൾ ശേഖരിച്ച് ഇമേജ് സ്റ്റുഡിയോയിൽ (പതിപ്പ് 5.2) പ്രോസസ്സ് ചെയ്തു. EPP-RA ഐസോഫോമിന് (82 kDa) അനുയോജ്യമായ ഒരു പ്രത്യേക ബാൻഡ് കണ്ടെത്തിയില്ല.
EPP യുടെ കോഡിംഗ് മേഖലകൾ (ഹിസ്റ്റിഡിൻ ഫോസ്ഫേറ്റേസ് ഡൊമെയ്ൻ അടങ്ങിയ ഐസോഫോം AGAP002463-RB ആയി, NCBI സംരക്ഷിത ഡൊമെയ്ൻ തിരയൽ 34) ഉം EcK2 (AGAP002181) ഉം pET-21a(+) പ്ലാസ്മിഡിലേക്ക് (നോവാജെൻ മില്ലിപോർ സിഗ്മ) ക്ലോൺ ചെയ്തു; പ്രൈമറുകൾ എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ടേബിൾ 2 ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. pET-21a(+)-EcK2 കൺസ്ട്രക്റ്റിന്റെ C-ടെർമിനൽ 6xHis ടാഗിന് മുമ്പ് എട്ട് GS4 ലിങ്കറുകൾ (ടാൻഡെമിൽ) ചേർത്തു. NEBExpress സെൽ-ഫ്രീ E. coli പ്രോട്ടീൻ സിന്തസിസ് റിയാക്ഷൻ (ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്സ്) ഉപയോഗിച്ചാണ് റീകോമ്പിനന്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ നിർമ്മിച്ചത്. NEBExpress Ni സ്പിൻ കോളങ്ങൾ (ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്സ്) ഉപയോഗിച്ച് റീകോമ്പിനന്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ ശുദ്ധീകരിച്ചു. NEBExpress സെൽ-ഫ്രീ E. coli പ്രോട്ടീൻ സിന്തസിസ് കിറ്റിൽ നിന്നുള്ള DNA ടെംപ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡൈഹൈഡ്രൊഫോളേറ്റ് റിഡക്റ്റേസ് (DHFR) നിയന്ത്രണ പ്രോട്ടീൻ നിർമ്മിച്ചത്. പ്രോട്ടീനുകൾ PBS-ൽ -20 °C-ൽ 3 മാസം വരെ സൂക്ഷിച്ചു.
4-നൈട്രോഫെനൈൽ ഫോസ്ഫേറ്റ് (pNPP; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ഉപയോഗിച്ചാണ് EPP യുടെയും ടിഷ്യു എക്സ്ട്രാക്റ്റുകളുടെയും ഫോസ്ഫേറ്റേസ് പ്രവർത്തനം അളന്നത്. റിയാക്ഷൻ ബഫറിൽ 25 mM Tris, 50 mM അസറ്റിക് ആസിഡ്, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. റിയാക്ഷൻ ബഫറിൽ ടിഷ്യു ഹോമോജെനൈസ് ചെയ്യുകയും സെൽ അവശിഷ്ടങ്ങൾ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി നീക്കം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. 2.5 mg ml-1 pNPP അടങ്ങിയ റിയാക്ഷൻ ബഫറിലേക്ക് എൻസൈമോ ടിഷ്യു എക്സ്ട്രാക്റ്റോ ചേർത്ത് പ്രതികരണം ആരംഭിക്കുക. റിയാക്ഷൻ മിശ്രിതം മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഇരുണ്ട സ്ഥലത്ത് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, വിവിധ സമയങ്ങളിൽ 405 nm ൽ ആഗിരണം അളന്നുകൊണ്ട് pNPP യിൽ നിന്ന് പരിവർത്തനം ചെയ്ത pNP യുടെ അളവ് കണക്കാക്കി.
ഇൻ വിട്രോ ഇസികെ പ്രവർത്തനത്തിനായി, 27 °C താപനിലയിൽ 2 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP, 10 mM MgCl2 എന്നിവ അടങ്ങിയ 200 µl ബഫറിൽ (pH 7.5) 0.2 mg 20E അല്ലെങ്കിൽ 3D20E ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. 800 µl മെഥനോൾ ചേർത്ത് പ്രതിപ്രവർത്തനം നിർത്തി, തുടർന്ന് -20 °C താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ തണുപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് 4 °C താപനിലയിൽ 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 20,000 ഗ്രാം താപനിലയിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. സൂപ്പർനേറ്റന്റിനെ HPLC-MS/MS വിശകലനം ചെയ്തു. നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളെ ചൂടാക്കി നിർജ്ജീവമാക്കുന്നതിന്, പ്രോട്ടീനുകളെ PBS-ൽ 50% ഗ്ലിസറോളിൽ 20 മിനിറ്റ് 95 °C താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.
ഇൻ വിട്രോ ഇപിപി പ്രവർത്തനത്തിനായി, പ്രോട്ടീൻ 3D20E22P (HPLC-MS/MS ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ച 18 ജോഡി MAG-കളിൽ കണ്ടെത്തിയ അളവിന് തുല്യം) ഉപയോഗിച്ച് 25 mM Tris, 50 mM അസറ്റിക് ആസിഡ്, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT എന്നിവ അടങ്ങിയ 100 µl ബഫറിൽ (pH 7.5) 27 °C-ൽ 3 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. 400 µl മെഥനോൾ ചേർത്ത് പ്രതിപ്രവർത്തനം നിർത്തി -20 °C-ൽ 1 മണിക്കൂർ തണുപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് 20,000 ഗ്രാം 4 °C-ൽ 10 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. സൂപ്പർനേറ്റന്റിനെ HPLC-MS/MS വിശകലനം ചെയ്തു.
മിശ്രലിംഗ തലയില്ലാത്ത കൊതുകിന്റെ മൃതദേഹങ്ങളിൽ നിന്ന് തയ്യാറാക്കിയ cDNA-യിൽ നിന്നാണ് EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp), EcK2 (556 bp) എന്നിവയ്ക്കുള്ള PCR ശവങ്ങൾ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തത്. eGFP നിയന്ത്രണത്തിന്റെ PCR ശവശരീരം (495 bp) മുമ്പ് വിവരിച്ച pCR2.1-eGFP-യിൽ നിന്ന് ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തു; PCR പ്രൈമറുകൾ എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ടേബിൾ 2 ൽ ലിസ്റ്റ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. pL4440 പ്ലാസ്മിഡിലെ വിപരീത T7 പ്രൊമോട്ടറുകൾക്കിടയിൽ PCR ഫ്രാഗ്മെന്റ് ചേർത്തു. NEB 5-α കോംപിറ്റന്റ് E. coli (ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോലാബ്സ്) ൽ നിന്ന് പ്ലാസ്മിഡ് കൺസ്ട്രക്റ്റുകൾ വീണ്ടെടുത്തു, ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് DNA സീക്വൻസിംഗ് വഴി പരിശോധിച്ചു (ഇൻസേർട്ട് സീക്വൻസിനായി സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ 1 കാണുക). pL4440-അധിഷ്ഠിത പ്ലാസ്മിഡിൽ നിന്നുള്ള ഇൻസേർട്ട് വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ T7 പ്രൊമോട്ടറുമായി (വിപുലീകൃത ഡാറ്റ പട്ടിക 2) പൊരുത്തപ്പെടുന്ന പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ചു. PCR ഉൽപ്പന്ന വലുപ്പം അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് വഴി സ്ഥിരീകരിച്ചു. മെഗാസ്ക്രിപ്റ്റ് T7 ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കിറ്റ് (തെർമോ ഫിഷർ) ഉപയോഗിച്ച് PCR ടെംപ്ലേറ്റുകളിൽ നിന്ന് dsRNA ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യുകയും മുമ്പ് വിവരിച്ച പരിഷ്കാരങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ചെയ്തു.
ഡിഎസ്ആർഎൻഎ കുത്തിവയ്പ്പിനായി, എക്ലോഷൻ കഴിഞ്ഞ് ഒരു ദിവസത്തിനുള്ളിൽ മുതിർന്ന പുരുഷന്മാരുടെയോ സ്ത്രീകളുടെയോ (നാനോജെക്റ്റ് III, ഡ്രമ്മണ്ട്) നെഞ്ചിലേക്ക് 10 ng nl-1 സാന്ദ്രതയിൽ 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) കുത്തിവച്ചു. ആർഎൻഎ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ, സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ്, ആർടി-ക്യുപിസിആർ എന്നിവയിലൂടെ കുറഞ്ഞത് മൂന്ന് ജൈവ പകർപ്പുകളിലെങ്കിലും ജീൻ നോക്ക്ഡൗൺ അളവ് നിർണ്ണയിച്ചു. എക്ഡിസോൺ കുത്തിവയ്പ്പിനായി, 4 ദിവസം പ്രായമുള്ള കന്യകയോ 6 ദിവസം പ്രായമുള്ള കന്യകയോ രക്തം കുടിക്കുന്ന സ്ത്രീകൾക്ക് യഥാക്രമം 1.3, 2.1 സാന്ദ്രതയിൽ 20E യുടെ 0.13, 0.21, അല്ലെങ്കിൽ 0.63 µg അല്ലെങ്കിൽ 3D20E (നാനോജെക്റ്റ് III, ഡ്രമ്മണ്ട്) കുത്തിവച്ചു, പരീക്ഷണാത്മക രൂപകൽപ്പന അല്ലെങ്കിൽ 6.3 ng nl-1 അനുസരിച്ച്. 10% ന്റെ 100 nl കുത്തിവയ്ക്കുക. (vol/vol) വെള്ളത്തിൽ എത്തനോൾ; 10% എത്തനോളിൽ 3D20E22P യുടെ 100 nl (ഒരു ജോഡി MAG-കളിൽ കണ്ടെത്തിയ അളവിന്റെ 75% ന് തുല്യം). കൊതുകുകളെ ക്രമരഹിതമായി കുത്തിവയ്പ്പ് ഗ്രൂപ്പിലേക്ക് നിയോഗിച്ചു.
മുട്ടയിടൽ പരിശോധനയ്ക്കായി, 3 ദിവസം പ്രായമുള്ള പെൺകൊതുകുകൾക്ക് മനുഷ്യ രക്തം ഉപയോഗിച്ച് അഡ് ലിബിറ്റം നൽകി. ഭാഗികമായി തീറ്റ നൽകിയതോ അല്ലാത്തതോ ആയ കൊതുകുകളെ നീക്കം ചെയ്യുക. ചികിത്സയെ ആശ്രയിച്ച്, രക്തഭക്ഷണത്തിന് ശേഷം കുറഞ്ഞത് 48 മണിക്കൂറെങ്കിലും പെൺകൊതുകുകളെ പ്രത്യേക മുട്ടയിടൽ കപ്പുകളിൽ നാല് രാത്രികളിൽ വച്ചു. ഒരു സ്റ്റീരിയോസ്കോപ്പിന് കീഴിൽ മുട്ടകൾ എണ്ണി (സ്റ്റെമി 508, സീസ്); ഇണചേർന്ന പെൺകൊതുകുകൾക്ക്, ലാർവകളായി വിരിഞ്ഞ മുട്ടകളെ ഫലഭൂയിഷ്ഠമായി കണക്കാക്കി.
ഇണചേരൽ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി, ചികിത്സയെ ആശ്രയിച്ച് ഇണചേരലിനെതിരെ പ്രതിരോധം വികസിപ്പിക്കുന്നതിനായി പെൺമൃഗങ്ങളെ കുറഞ്ഞത് 2 ദിവസമെങ്കിലും അനുവദിച്ചു, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് പ്രായവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ആൺമൃഗങ്ങളെ പിന്നീട് അതേ കൂട്ടിൽ കൊണ്ടുവന്നു. രണ്ട് രാത്രികൾക്ക് ശേഷം, പെൺമൃഗങ്ങളുടെ ബീജസങ്കലനം ചെയ്ത വെസിക്കിളുകൾ വിച്ഛേദിക്കപ്പെട്ടു, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl (pH 8.2) എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു ബഫറിൽ ഫ്രീസ്-ഥാ, സോണിക്കേഷൻ എന്നിവയിലൂടെ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ പുറത്തുവന്നു. 55 °C-ൽ 15 മിനിറ്റ് പ്രോട്ടീനേസ് K (0.86 µg µl-1) ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിളുകൾ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് 95 °C-ൽ 10 മിനിറ്റ്. ക്രൂഡ് ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ തയ്യാറെടുപ്പുകൾ 10 മടങ്ങ് നേർപ്പിച്ച് Y ക്രോമസോം സീക്വൻസുകളുടെ qPCR കണ്ടെത്തലിന് വിധേയമാക്കി; പ്രൈമറുകൾ എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ടേബിൾ 2-ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. Y ക്രോമസോം സീക്വൻസിന്റെ അഭാവം ഇണചേരൽ ഇല്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
പുനർ-ഇണചേരൽ പരിശോധനകൾക്കായി, ഇണചേരൽ നില സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിനായി ഫോഴ്‌സ്-ഇണചേർന്ന പെൺമൃഗങ്ങളെ ഇണചേരൽ പ്ലഗുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിനായി പരിശോധിച്ചു, മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ [36] പുരുഷന്മാരുടെ അഭാവത്തിൽ ഇണചേരലിന് അപവർത്തനം വികസിപ്പിക്കാൻ 2 ദിവസം അനുവദിച്ചു. DsRed ട്രാൻസ്ജെനിക് ബീജം വഹിക്കുന്ന പുരുഷന്മാരെ പിന്നീട് പെൺ കൂടുകളിൽ പ്രവേശിപ്പിച്ചു. രണ്ട് രാത്രികൾക്ക് ശേഷം, ബീജസങ്കലന വെസിക്കിളുകൾ സ്ത്രീകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്തു, മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ തയ്യാറാക്കി ഡിഎസ്ആർഡ് ട്രാൻസ്ജെനിന്റെ qPCR കണ്ടെത്തലിന് വിധേയമാക്കി; പ്രൈമറുകൾ എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ പട്ടിക 2 ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. DsRed ട്രാൻസ്ജെനിന്റെ അഭാവം റീ-ഇണചേരൽ നടന്നിട്ടില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ 3D20E സംശ്ലേഷണം ചെയ്തു 37. ചുരുക്കത്തിൽ, 10 മില്ലിഗ്രാം 20E (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) 10 മില്ലി വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് 30 മില്ലിഗ്രാം പ്ലാറ്റിനം ബ്ലാക്ക് (പൊടി രൂപത്തിൽ, സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ചേർത്തു. പ്രതിപ്രവർത്തന മിശ്രിതത്തിലേക്ക് O2 ന്റെ ഒരു മൃദുവായ സ്ട്രീം തുടർച്ചയായി കുമിളകളാക്കി, അത് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഇളക്കി. 6 മണിക്കൂറിനുശേഷം, പ്രതിപ്രവർത്തനം നിർത്താൻ 30 മില്ലി മെഥനോൾ ചേർത്തു. ഉൽപ്രേരക കണികകൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി മിശ്രിതം സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. മുറിയിലെ താപനിലയിൽ വാക്യൂവിൽ വരണ്ടതാക്കാൻ സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ബാഷ്പീകരിക്കപ്പെട്ടു. HPLC-MS/MS വിശകലനത്തിനായി കുത്തിവയ്ക്കുന്നതിനായി ഉണങ്ങിയ പ്രതിപ്രവർത്തന ഉൽപ്പന്നം 10% എത്തനോൾ, മെഥനോൾ എന്നിവയിൽ ലയിപ്പിച്ചു. പരിവർത്തന നിരക്ക് (20E മുതൽ 3D20E വരെ) ഏകദേശം 97% ആയിരുന്നു (ചിത്രം 4b), ഇണചേർന്ന സ്ത്രീകളിൽ കാണപ്പെടുന്നതിനോട് സംശ്ലേഷണം ചെയ്ത 3D20E യുടെ MS സ്പെക്ട്രം പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 4c).
നടത്തിയ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ പരിശോധനകളുടെ പ്രത്യേക വിശദാംശങ്ങൾ ലെജന്റിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ഫിഷേഴ്‌സ് എക്‌സ്‌എക്ട് ടെസ്റ്റ്, മാന്റൽ-കോക്‌സ് ടെസ്റ്റ്, സ്റ്റുഡന്റ്‌സ് ടി-ടെസ്റ്റ് എന്നിവ നടത്താൻ ഗ്രാഫ്‌പാഡ് (പതിപ്പ് 9.0) ഉപയോഗിച്ചു. ഒരു കസ്റ്റം ആർ സ്ക്രിപ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് കോക്രാൻ-മാന്റൽ-ഹെയിൻസെൽ പരിശോധനകൾ നടത്തിയത് (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test ൽ ലഭ്യമാണ്). 0.05 എന്ന സിഗ്‌നിഫിക്കൻസ് ത്രെഷോൾഡുള്ള ഷാപിറോ-വിൽക്ക് ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ നോർമാലിറ്റിക്കായി പരീക്ഷിച്ചു. ഡാറ്റ നോർമാലിറ്റി പരിശോധനയിൽ പരാജയപ്പെട്ടപ്പോൾ, മാൻ-വിറ്റ്‌നി ടെസ്റ്റ് നടത്തി. മാന്റൽ-കോക്‌സ് ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സർവൈവൽ ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്തു. ആർ‌എൻ‌എ-സെക് ജീൻ-ലെവൽ ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം നടത്താൻ ഡി‌എസ്‌ഇക്2 പാക്കേജ് (പതിപ്പ് 1.28.1) ഉപയോഗിച്ചു. ഗ്രാഫിലെ തിരശ്ചീന ബാർ മീഡിയനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. എല്ലാ പരിശോധനകൾക്കും ത്രെഷോൾഡായി പി = 0.05 എന്ന സിഗ്‌നിഫിക്കൻസ് മൂല്യം ഉപയോഗിച്ചു.
പഠന രൂപകൽപ്പനയെക്കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ വിവരങ്ങൾക്ക്, ഈ ലേഖനവുമായി ലിങ്ക് ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന നേച്ചർ റിസർച്ച് റിപ്പോർട്ട് സംഗ്രഹം കാണുക.
PRIDE പാർട്ണർ റിപ്പോസിറ്ററി (https://www.ebi.ac.uk/pride/) വഴി PXD032157 എന്ന ഡാറ്റാസെറ്റ് ഐഡന്റിഫയർ ഉപയോഗിച്ച് MS പ്രോട്ടിയോമിക് ഡാറ്റ ProteomeXchange കൺസോർഷ്യത്തിൽ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) നിക്ഷേപിച്ചു.
RNA-seq ഡാറ്റാസെറ്റ് GSE198665 എന്ന സീരിയൽ റെക്കോർഡിന് കീഴിൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ കോംപ്രിഹെൻസീവ് ലൈബ്രറിയിൽ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) നിക്ഷേപിച്ചിരിക്കുന്നു.
നിലവിലെ പഠനത്തിനിടെ സൃഷ്ടിക്കപ്പെട്ടതും/അല്ലെങ്കിൽ വിശകലനം ചെയ്തതുമായ അധിക ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ ന്യായമായ അഭ്യർത്ഥന പ്രകാരം അനുബന്ധ രചയിതാക്കളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ചേക്കാം. ഈ ലേഖനം ഉറവിട ഡാറ്റ നൽകുന്നു.
ഡി ലൂഫ്, എ. എക്ഡിസ്റ്ററോയിഡുകൾ: അവഗണിക്കപ്പെട്ട പ്രാണി ലൈംഗിക സ്റ്റിറോയിഡുകൾ? പുരുഷൻ: ബ്ലാക്ക് ബോക്സ്. ഇൻസെക്ട് സയൻസ്.13, 325–338 (2006).
റെഡ്ഫെർൺ, സിപിഎഫ് 20-ഹൈഡ്രോക്സിഎക്ഡിസോൺ, അനോഫിലിസ് സ്റ്റീഫൻസിലെ അണ്ഡാശയ വികസനം. ജെ. ഇൻസെക്റ്റ് ഫിസിയോളജി. 28, 97–109 (1982).