ട്യൂമർ മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിന്റെ (TME) ഒരു പ്രധാന സവിശേഷതയാണ് ഇമ്മ്യൂണോമോഡുലേറ്ററി മെറ്റബോളൈറ്റുകൾ, എന്നാൽ ചില അപവാദങ്ങൾ ഒഴികെ, അവയുടെ ഐഡന്റിറ്റികൾ വലിയതോതിൽ അജ്ഞാതമായി തുടരുന്നു. ഇവിടെ, ഹൈ-ഗ്രേഡ് സീറസ് കാർസിനോമ (HGSC) ഉള്ള രോഗികളുടെ ട്യൂമറുകളിൽ നിന്നും അസൈറ്റുകളിൽ നിന്നുമുള്ള ട്യൂമറുകളും ടി കോശങ്ങളും വിശകലനം ചെയ്തു, ഈ വ്യത്യസ്ത TME കമ്പാർട്ടുമെന്റുകളുടെ മെറ്റബോളോം വെളിപ്പെടുത്താൻ. അസൈറ്റുകൾക്കും ട്യൂമർ കോശങ്ങൾക്കും വിപുലമായ മെറ്റബോളൈറ്റ് വ്യത്യാസങ്ങളുണ്ട്. അസൈറ്റുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ട്യൂമർ-ഇൻഫിൽട്രേറ്റിംഗ് ടി കോശങ്ങളിൽ 1-മെഥൈൽനിക്കോട്ടിനാമൈഡ് (MNA) ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമാണ്. ടി കോശങ്ങളിലെ MNA യുടെ അളവ് ഉയർന്നിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് N-മെഥൈൽട്രാൻസ്ഫെറേസിന്റെ (S-adenosylmethionine-ൽ നിന്ന് നിക്കോട്ടിനാമൈഡിലേക്കുള്ള മീഥൈൽ ഗ്രൂപ്പുകളുടെ കൈമാറ്റം ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്ന ഒരു എൻസൈം) പ്രകടനത്തിന്റെ അളവ് ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകളിലും ട്യൂമർ കോശങ്ങളിലും മാത്രമായി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു. പ്രവർത്തനപരമായി, ട്യൂമർ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്ന സൈറ്റോകൈൻ ട്യൂമർ നെക്രോസിസ് ഫാക്ടർ ആൽഫ സ്രവിക്കാൻ MNA ടി കോശങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു. അതിനാൽ, TME-ഉത്ഭവിച്ച MNA ടി കോശങ്ങളുടെ രോഗപ്രതിരോധ നിയന്ത്രണത്തിന് സംഭാവന നൽകുകയും മനുഷ്യ കാൻസർ ചികിത്സയ്ക്കുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള ഇമ്മ്യൂണോതെറാപ്പി ലക്ഷ്യത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.
ട്യൂമറിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ മെറ്റബോളിറ്റുകൾക്ക് ആന്റി-ട്യൂമർ പ്രതിരോധശേഷിയിൽ ആഴത്തിലുള്ള തടസ്സമുണ്ടാക്കാൻ കഴിയും, കൂടാതെ രോഗ പുരോഗതിക്ക് അവ ഒരു പ്രധാന പ്രേരകശക്തിയായി വർത്തിക്കുമെന്ന് കൂടുതൽ കൂടുതൽ തെളിവുകൾ കാണിക്കുന്നു (1). വാർബർഗ് പ്രഭാവത്തിന് പുറമേ, ട്യൂമർ കോശങ്ങളുടെ മെറ്റബോളിക് അവസ്ഥയെയും ട്യൂമർ മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിന്റെ (TME) രോഗപ്രതിരോധ അവസ്ഥയുമായുള്ള അതിന്റെ ബന്ധത്തെയും ചിത്രീകരിക്കുന്നതിനുള്ള സമീപകാല പ്രവർത്തനങ്ങൾ ആരംഭിച്ചു. എലികളുടെ മാതൃകകളെയും മനുഷ്യ ടി കോശങ്ങളെയും കുറിച്ചുള്ള പഠനങ്ങൾ ഗ്ലൂട്ടാമൈൻ മെറ്റബോളിസം (2), ഓക്സിഡേറ്റീവ് മെറ്റബോളിസം (3), ഗ്ലൂക്കോസ് മെറ്റബോളിസം (4) എന്നിവയ്ക്ക് വിവിധ രോഗപ്രതിരോധ കോശ ഉപഗ്രൂപ്പുകളിൽ സ്വതന്ത്രമായി പ്രവർത്തിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. ഈ പാതകളിലെ നിരവധി മെറ്റബോളിറ്റുകൾ ടി കോശങ്ങളുടെ ആന്റി-ട്യൂമർ പ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്നു. ടെട്രാഹൈഡ്രോബയോപ്റ്റെറിൻ (BH4) എന്ന കോഎൻസൈമിന്റെ ഉപരോധം ടി കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ തകരാറിലാക്കുമെന്നും ശരീരത്തിലെ BH4 ന്റെ വർദ്ധനവ് CD4 ഉം CD8 ഉം മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്ന ആന്റി-ട്യൂമർ രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണം വർദ്ധിപ്പിക്കുമെന്നും തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. കൂടാതെ, BH4 (5) നൽകുന്നതിലൂടെ കൈനൂറൈനിന്റെ രോഗപ്രതിരോധ ശേഷി ഇല്ലാതാക്കാൻ കഴിയും. ഐസോസിട്രേറ്റ് ഡീഹൈഡ്രജനേസ് (IDH) മ്യൂട്ടന്റ് ഗ്ലിയോബ്ലാസ്റ്റോമയിൽ, എനാന്റിയോമെറ്റബോളിക് (R)-2-ഹൈഡ്രോക്സിഗ്ലൂട്ടറേറ്റ് (R-2-HG) സ്രവണം ടി സെൽ ആക്റ്റിവേഷൻ, പ്രോലിഫറേഷൻ, സൈറ്റോലൈസിസ് പ്രവർത്തനം എന്നിവയെ തടയുന്നു (6). അടുത്തിടെ, ഗ്ലൈക്കോളിസിസിന്റെ ഒരു ഉപോൽപ്പന്നമായ മീഥൈൽഗ്ലൈഓക്സൽ, മൈലോയ്ഡ് ഉത്ഭവമുള്ള സപ്രസ്സർ കോശങ്ങളാൽ ഉത്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്നുവെന്നും, മീഥൈൽഗ്ലൈഓക്സലിന്റെ ടി സെൽ ട്രാൻസ്ഫറിന് എഫെക്റ്റർ ടി സെൽ പ്രവർത്തനത്തെ തടയാൻ കഴിയുമെന്നും തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. ചികിത്സയിൽ, മീഥൈൽഗ്ലൈഓക്സലിന്റെ ന്യൂട്രലൈസേഷൻ മൈലോയ്ഡ്-ഡെറിവേഡ് സപ്രസ്സർ കോശങ്ങളുടെ (MDSC) പ്രവർത്തനത്തെ മറികടക്കുകയും മൗസ് മോഡലുകളിൽ ചെക്ക്‌പോയിന്റ് ബ്ലോക്ക്‌ഡേ തെറാപ്പിയെ സിനർജിസ്റ്റിക്കായി മെച്ചപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യും (7). ടി സെൽ പ്രവർത്തനവും പ്രവർത്തനവും നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ TME-ഡെറിവേഡ് മെറ്റബോളൈറ്റുകളുടെ പ്രധാന പങ്കിനെ ഈ പഠനങ്ങൾ കൂട്ടായി ഊന്നിപ്പറയുന്നു.
അണ്ഡാശയ കാൻസറിൽ ടി സെൽ പ്രവർത്തന വൈകല്യം വ്യാപകമായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് (8). ഹൈപ്പോക്സിയയിലും അസാധാരണമായ ട്യൂമർ വാസ്കുലേച്ചറിലും അന്തർലീനമായ ഉപാപചയ സവിശേഷതകളാണ് ഇതിന് കാരണം (9), ഇത് ഗ്ലൂക്കോസും ട്രിപ്റ്റോഫാനും ലാക്റ്റിക് ആസിഡ്, കൈനൂറൈനിൻ തുടങ്ങിയ ഉപോൽപ്പന്നങ്ങളാക്കി മാറ്റുന്നതിൽ കലാശിക്കുന്നു. അമിതമായ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ലാക്റ്റേറ്റ് ഇന്റർഫെറോൺ-γ (IFN-γ) യുടെ ഉത്പാദനം കുറയ്ക്കുകയും മൈലോസപ്രസ്സീവ് ഉപഗ്രൂപ്പുകളുടെ വ്യത്യാസത്തെ നയിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു (10, 11). ട്രിപ്റ്റോഫാൻ ഉപഭോഗം നേരിട്ട് ടി സെൽ വ്യാപനത്തെ തടയുകയും ടി സെൽ റിസപ്റ്റർ സിഗ്നലിംഗിനെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു (12-14). ഈ നിരീക്ഷണങ്ങൾ ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, രോഗപ്രതിരോധ മെറ്റബോളിസവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ധാരാളം പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഇൻ വിട്രോ ടി സെൽ കൾച്ചറിൽ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത മീഡിയ ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി, അല്ലെങ്കിൽ ഇൻ വിവോയിൽ ഹോമോലോജസ് മൗസ് മോഡലുകളിൽ മാത്രം പരിമിതപ്പെടുത്തി, ഇവയൊന്നും മനുഷ്യ കാൻസറുകളുടെ വൈവിധ്യത്തെയും ഫിസിയോളജിക്കൽ മാക്രോ, മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിനെയും പൂർണ്ണമായും പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നില്ല.
അണ്ഡാശയ കാൻസറിന്റെ ഒരു പൊതു സവിശേഷത പെരിറ്റോണിയൽ വ്യാപനവും അസൈറ്റുകളുടെ രൂപഭാവവുമാണ്. അസൈറ്റുകളിൽ കോശ ദ്രാവകം അടിഞ്ഞുകൂടുന്നത് രോഗത്തിന്റെ വികാസവുമായും രോഗനിർണയത്തിലെ മോശം അവസ്ഥയുമായും ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (15). റിപ്പോർട്ടുകൾ പ്രകാരം, ഈ സവിശേഷ കമ്പാർട്ടുമെന്റിൽ ഹൈപ്പോക്സിക് ആണ്, ഉയർന്ന അളവിൽ വാസ്കുലർ എൻഡോതെലിയൽ വളർച്ചാ ഘടകം (VEGF), ഇൻഡോലിയാമിൻ 2,3-ഡയോക്സിജനേസ് (IDO) എന്നിവയുണ്ട്, കൂടാതെ ടി റെഗുലേറ്ററി സെല്ലുകളും മൈലോയ്ഡ് ഇൻഹിബിറ്ററി കോശങ്ങളും ഇതിൽ നുഴഞ്ഞുകയറുന്നു (15-18). അസൈറ്റുകളുടെ ഉപാപചയ അന്തരീക്ഷം ട്യൂമറിന്റേതിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായിരിക്കാം, അതിനാൽ പെരിറ്റോണിയൽ സ്ഥലത്ത് ടി കോശങ്ങളുടെ പുനഃക്രമീകരണം വ്യക്തമല്ല. കൂടാതെ, ട്യൂമർ പരിതസ്ഥിതിയിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന അസൈറ്റുകളും മെറ്റബോളൈറ്റുകളും തമ്മിലുള്ള പ്രധാന വ്യത്യാസങ്ങളും വൈവിധ്യവും രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളുടെ നുഴഞ്ഞുകയറ്റത്തിനും ട്യൂമറുകളിലെ അവയുടെ പ്രവർത്തനത്തിനും തടസ്സമായേക്കാം, കൂടുതൽ ഗവേഷണം ആവശ്യമാണ്.
ഈ പ്രശ്നങ്ങൾ പരിഹരിക്കുന്നതിനായി, വ്യത്യസ്ത കോശ തരങ്ങൾ (CD4 +, CD8 + T കോശങ്ങൾ ഉൾപ്പെടെ) ട്യൂമറുകൾക്കുള്ളിലും അവയ്ക്കിടയിലും പഠിക്കുന്നതിനായി ഞങ്ങൾ ഒരു സെൻസിറ്റീവ് സെൽ സെപ്പറേഷൻ, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി ടാൻഡം മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (LC-MS/MS) രീതി രൂപകൽപ്പന ചെയ്തു. ഇതിന്റെ മെറ്റബോളിറ്റുകൾ രോഗിയുടെ അതേ അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമർ പരിതസ്ഥിതിയിലും കോശങ്ങളെ വ്യാപിപ്പിക്കുന്നു. ഈ പ്രധാന പോപ്പുലേഷനുകളുടെ മെറ്റബോളിക് അവസ്ഥയുടെ ഉയർന്ന പരിഹാരമുള്ള ഛായാചിത്രം നൽകുന്നതിന് ഞങ്ങൾ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി, സിംഗിൾ-സെൽ ആർ‌എൻ‌എ സീക്വൻസിംഗ് (scRNA-seq) എന്നിവയുമായി സംയോജിച്ച് ഈ രീതി ഉപയോഗിക്കുന്നു. ട്യൂമർ ടി കോശങ്ങളിലെ 1-മെഥിൽ‌നിക്കോട്ടിനാമൈഡിന്റെ (MNA) അളവിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവ് ഈ രീതി വെളിപ്പെടുത്തി, കൂടാതെ ഇൻ വിട്രോ പരീക്ഷണങ്ങൾ ടി സെൽ പ്രവർത്തനത്തിൽ MNA യുടെ ഇമ്മ്യൂണോമോഡുലേറ്ററി പ്രഭാവം മുമ്പ് അജ്ഞാതമായിരുന്നുവെന്ന് കാണിച്ചു. പൊതുവേ, ഈ രീതി ട്യൂമറുകളും രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളും തമ്മിലുള്ള പരസ്പര ഉപാപചയ ഇടപെടലുകൾ വെളിപ്പെടുത്തുന്നു, കൂടാതെ രോഗപ്രതിരോധ നിയന്ത്രണ മെറ്റബോളിറ്റുകളെക്കുറിച്ചുള്ള അതുല്യമായ ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകുന്നു, ഇത് ടി സെൽ അധിഷ്ഠിത അണ്ഡാശയ കാൻസർ ഇമ്മ്യൂണോതെറാപ്പി ചികിത്സ അവസരങ്ങളുടെ ചികിത്സയ്ക്ക് ഉപയോഗപ്രദമാകും.
ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) ഉം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനവും [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ഒരേസമയം അളക്കാൻ ഞങ്ങൾ ഹൈ-ഡൈമൻഷണൽ ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി ഉപയോഗിച്ചു. രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളെയും ട്യൂമർ സെൽ പോപ്പുലേഷനുകളെയും വേർതിരിക്കുന്ന സാധാരണ മാർക്കറുകളാണ് ഇവ (പട്ടിക S2 ഉം ചിത്രവും S1A ഉം). ടി കോശങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, അസൈറ്റുകൾക്കും ട്യൂമർ സെല്ലുകൾക്കും ഉയർന്ന ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം ലെവലുകൾ ഉണ്ടെന്നും എന്നാൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനത്തിൽ ചെറിയ വ്യത്യാസങ്ങളുണ്ടെന്നും ഈ വിശകലനം കാണിച്ചു. ട്യൂമർ കോശങ്ങളുടെ ശരാശരി ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ടി കോശങ്ങളുടെ മൂന്നോ നാലോ ഇരട്ടിയാണ്, കൂടാതെ CD4 + T കോശങ്ങളുടെ ശരാശരി ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം CD8 + T കോശങ്ങളുടെ 1.2 ഇരട്ടിയാണ്, ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ട്യൂമർ ഇൻഫിൽട്രേറ്റിംഗ് ലിംഫോസൈറ്റുകൾക്ക് (TIL) ഒരേ TME യിൽ പോലും വ്യത്യസ്ത മെറ്റബോളിക് ആവശ്യകതകളുണ്ടെന്നാണ് (ചിത്രം 1A). ഇതിനു വിപരീതമായി, ട്യൂമർ കോശങ്ങളിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം CD4 + T കോശങ്ങളുടേതിന് സമാനമാണ്, കൂടാതെ രണ്ട് തരം കോശങ്ങളുടെയും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം CD8 + T കോശങ്ങളേക്കാൾ കൂടുതലാണ് (ചിത്രം 1B). പൊതുവേ, ഈ ഫലങ്ങൾ ഉപാപചയ നില വെളിപ്പെടുത്തുന്നു. ട്യൂമർ കോശങ്ങളുടെ ഉപാപചയ പ്രവർത്തനം CD4 + T കോശങ്ങളേക്കാൾ കൂടുതലാണ്, കൂടാതെ CD4 + T കോശങ്ങളുടെ ഉപാപചയ പ്രവർത്തനം CD8 + T കോശങ്ങളേക്കാൾ കൂടുതലാണ്. കോശ തരങ്ങളിലുടനീളമുള്ള ഈ ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, ട്യൂമറുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ CD4 +, CD8 + T കോശങ്ങളുടെ ഉപാപചയ നിലയിലോ അസൈറ്റുകളിലെ അവയുടെ ആപേക്ഷിക അനുപാതത്തിലോ സ്ഥിരമായ വ്യത്യാസമില്ല (ചിത്രം 1C). ഇതിനു വിപരീതമായി, CD45-സെൽ ഫ്രാക്ഷനിൽ, ട്യൂമറിലെ EpCAM+ കോശങ്ങളുടെ അനുപാതം അസൈറ്റുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 1D). EpCAM+, EpCAM- സെൽ ഘടകങ്ങൾക്കിടയിൽ വ്യക്തമായ ഉപാപചയ വ്യത്യാസവും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. EpCAM+ (ട്യൂമർ) കോശങ്ങൾക്ക് EpCAM- കോശങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച് ഉയർന്ന ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം എന്നിവയുണ്ട്, ഇത് TME-യിലെ ട്യൂമർ കോശങ്ങളിലെ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകളുടെ ഉപാപചയ പ്രവർത്തനത്തേക്കാൾ വളരെ കൂടുതലാണ് (ചിത്രം 1, E, F).
(A ഉം B ഉം) ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം ചെയ്യുന്നതിന്റെ മീഡിയൻ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത (MFI) (2-NBDG) (A) CD4 + T കോശങ്ങളുടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനവും (MitoTracker കടും ചുവപ്പ്) (B) അസൈറ്റുകളിൽ നിന്നും ട്യൂമറിൽ നിന്നുമുള്ള പ്രതിനിധി ഗ്രാഫുകൾ (ഇടത്) ടാബുലേറ്റഡ് ഡാറ്റയും (വലത്), CD8 + T സെല്ലുകളും EpCAM + CD45- ട്യൂമർ കോശങ്ങളും. (C) അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമറിലും CD4 +, CD8 + കോശങ്ങളുടെ (CD3 + T കോശങ്ങളുടെ) അനുപാതം. (D) അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമറിലും EpCAM + ട്യൂമർ കോശങ്ങളുടെ അനുപാതം (CD45−). (E ഉം F ഉം) EpCAM + CD45- ട്യൂമർ, EpCAM-CD45- മാട്രിക്സ് ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം (2-NBDG) (E) മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം (MitoTracker കടും ചുവപ്പ്) (F) പ്രതിനിധി ഗ്രാഫുകൾ (ഇടത്) ടാബുലേറ്റഡ് ഡാറ്റയും (വലത്) അസൈറ്റുകളും ട്യൂമർ കോശങ്ങളും. (G) ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി വഴി CD25, CD137, PD1 എക്സ്പ്രഷന്റെ പ്രതിനിധി ഗ്രാഫുകൾ. (H ഉം I ഉം) CD4 + T സെല്ലുകളിലെ (H) CD8 + T സെല്ലുകളിലെ (I) CD25, CD137, PD1 എക്സ്പ്രഷൻ. (J ഉം K ഉം) CCR7, CD45RO എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള നേവ്, സെൻട്രൽ മെമ്മറി (Tcm), ഇഫക്റ്റർ (Teff), ഇഫക്റ്റർ മെമ്മറി (Tem) ഫിനോടൈപ്പുകൾ. അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമറുകളിലും CD4 + T സെല്ലുകളുടെ (J) CD8 + T സെല്ലുകളുടെ (K) പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങളും (ഇടത്) ടാബുലാർ ഡാറ്റയും (വലത്). ജോടിയാക്കിയ ടി-ടെസ്റ്റ് (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001) വഴി നിർണ്ണയിക്കുന്ന പി മൂല്യങ്ങൾ. ലൈൻ പൊരുത്തപ്പെടുന്ന രോഗികളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (n = 6). FMO, ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈനസ് ഒന്ന്; MFI, മീഡിയൻ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത.
കൂടുതൽ വിശകലനത്തിൽ, ഉയർന്ന തോതിൽ പരിഹരിക്കപ്പെട്ട ടി സെൽ ഫിനോടൈപ്പിക് സ്റ്റാറ്റസ് തമ്മിലുള്ള മറ്റ് പ്രധാന വ്യത്യാസങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തി. ട്യൂമറുകളിലെ സജീവമാക്കിയ (ചിത്രം 1, G മുതൽ I വരെ) എഫെക്റ്റർ മെമ്മറിയും (ചിത്രം 1, J, K) അസൈറ്റുകളേക്കാൾ (CD3 + T സെല്ലുകളുടെ അനുപാതം) വളരെ സാധാരണമാണ്. അതുപോലെ, ആക്ടിവേഷൻ മാർക്കറുകളുടെ (CD25, CD137) എക്സ്പ്രഷൻ വഴിയും ഡിപ്ലിഷൻ മാർക്കറുകളുടെ [പ്രോഗ്രാം ചെയ്ത സെൽ ഡെത്ത് പ്രോട്ടീൻ 1 (PD1)] എക്സ്പ്രഷൻ വഴിയും ഫിനോടൈപ്പ് വിശകലനം ചെയ്തത്, ഈ പോപ്പുലേഷനുകളുടെ മെറ്റബോളിക് സവിശേഷതകൾ വ്യത്യസ്തമാണെങ്കിലും (ചിത്രം S1, B മുതൽ E വരെ), എന്നാൽ നേവ്, എഫെക്റ്റർ അല്ലെങ്കിൽ മെമ്മറി ഉപസെറ്റുകൾക്കിടയിൽ (ചിത്രം S1, F മുതൽ I വരെ) കാര്യമായ മെറ്റബോളിക് വ്യത്യാസങ്ങളൊന്നും സ്ഥിരമായി നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ലെന്ന് കാണിച്ചു. സെൽ ഫിനോടൈപ്പുകൾ സ്വയമേവ നൽകുന്നതിന് മെഷീൻ ലേണിംഗ് രീതികൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഈ ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചത് (21), ഇത് രോഗിയുടെ അസൈറ്റുകളിൽ ധാരാളം അസ്ഥി മജ്ജ കോശങ്ങളുടെ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) സാന്നിധ്യം വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം S2A). തിരിച്ചറിഞ്ഞ എല്ലാ കോശ തരങ്ങളിലും, ഈ മൈലോയ്ഡ് കോശ ജനസംഖ്യ ഏറ്റവും ഉയർന്ന ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം എന്നിവ കാണിച്ചു (ചിത്രം S2, B മുതൽ G വരെ). HGSC രോഗികളിൽ അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമറുകളിലും കാണപ്പെടുന്ന ഒന്നിലധികം കോശ തരങ്ങൾ തമ്മിലുള്ള ശക്തമായ ഉപാപചയ വ്യത്യാസങ്ങളെ ഈ ഫലങ്ങൾ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.
TIL-ന്റെ മെറ്റബോളിക് സവിശേഷതകൾ മനസ്സിലാക്കുന്നതിലെ പ്രധാന വെല്ലുവിളി, ട്യൂമറുകളിൽ നിന്ന് മതിയായ പരിശുദ്ധി, ഗുണനിലവാരം, അളവ് എന്നിവയുള്ള ടി സെൽ സാമ്പിളുകൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കേണ്ടതിന്റെ ആവശ്യകതയാണ്. ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള തരംതിരിക്കലും ബീഡ് സമ്പുഷ്ടീകരണ രീതികളും സെല്ലുലാർ മെറ്റബോളൈറ്റ് പ്രൊഫൈലുകളിൽ മാറ്റങ്ങൾക്ക് കാരണമായേക്കാമെന്ന് സമീപകാല പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് (22-24). ഈ പ്രശ്നം മറികടക്കാൻ, LC-MS/MS വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ് ശസ്ത്രക്രിയയിലൂടെ നീക്കം ചെയ്ത മനുഷ്യ അണ്ഡാശയ കാൻസറിൽ നിന്ന് TIL-നെ വേർതിരിച്ച് ഒറ്റപ്പെടുത്തുന്നതിനായി ഞങ്ങൾ ബീഡ് സമ്പുഷ്ടീകരണ രീതി ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്തു (മെറ്റീരിയലുകളും രീതികളും കാണുക; ചിത്രം 2A). മെറ്റബോളൈറ്റ് മാറ്റങ്ങളിൽ ഈ പ്രോട്ടോക്കോളിന്റെ മൊത്തത്തിലുള്ള സ്വാധീനം വിലയിരുത്തുന്നതിന്, മുകളിൽ പറഞ്ഞ ബീഡ് വേർപെടുത്തൽ ഘട്ടത്തിന് ശേഷം ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാക്കൾ സജീവമാക്കിയ ടി സെല്ലുകളുടെ മെറ്റബോളൈറ്റ് പ്രൊഫൈലുകളെ ബീഡ് വേർപെടുത്താതെ ഐസിൽ തന്നെ തുടരുന്ന കോശങ്ങളുമായി ഞങ്ങൾ താരതമ്യം ചെയ്തു. ഈ ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ വിശകലനത്തിൽ ഈ രണ്ട് അവസ്ഥകൾക്കിടയിൽ ഉയർന്ന ബന്ധമുണ്ടെന്ന് കണ്ടെത്തി (r = 0.77), കൂടാതെ 86 മെറ്റബോളൈറ്റുകളുടെ ഗ്രൂപ്പിന്റെ സാങ്കേതിക ആവർത്തനക്ഷമതയ്ക്ക് ഉയർന്ന ആവർത്തനക്ഷമതയുണ്ട് (ചിത്രം 2B). അതിനാൽ, ഈ രീതികൾക്ക് കോശ തരം സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിന് വിധേയമാകുന്ന കോശങ്ങളിൽ കൃത്യമായ മെറ്റബോളൈറ്റ് വിശകലനം നടത്താൻ കഴിയും, അങ്ങനെ HGSC-യിലെ നിർദ്ദിഷ്ട മെറ്റബോളൈറ്റുകളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിനുള്ള ആദ്യത്തെ ഉയർന്ന റെസല്യൂഷൻ പ്ലാറ്റ്‌ഫോം നൽകുന്നു, അതുവഴി കോശ സവിശേഷതയെക്കുറിച്ച് ആളുകൾക്ക് ആഴത്തിലുള്ള ധാരണ നേടാൻ ഇത് പ്രാപ്തമാക്കുന്നു. ലൈംഗിക ഉപാപചയ പരിപാടി.
(എ) കാന്തിക ബീഡ് സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം. എൽസി-എംഎസ്/എംഎസ് വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ്, കോശങ്ങൾ തുടർച്ചയായി മൂന്ന് റൗണ്ട് കാന്തിക ബീഡ് സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിന് വിധേയമാക്കുകയോ ഐസിൽ തന്നെ തുടരുകയോ ചെയ്യും. (ബി) മെറ്റബോളൈറ്റുകളുടെ സമൃദ്ധിയിൽ സമ്പുഷ്ടീകരണ തരത്തിന്റെ പ്രഭാവം. ഓരോ സമ്പുഷ്ടീകരണ തരത്തിനും ശരാശരി മൂന്ന് അളവുകൾ ± SE. ചാരനിറത്തിലുള്ള വര 1:1 ബന്ധത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. ആക്സിസ് ലേബലിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ആവർത്തിച്ചുള്ള അളവുകളുടെ ഇൻട്രാ-ക്ലാസ് പരസ്പരബന്ധം (ICC). NAD, നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് അഡിനൈൻ ഡൈന്യൂക്ലിയോടൈഡ്. (സി) രോഗി മെറ്റബോളൈറ്റ് വിശകലനത്തിന്റെ വർക്ക്ഫ്ലോയുടെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം. അസൈറ്റുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ട്യൂമറുകൾ രോഗികളിൽ നിന്ന് ശേഖരിച്ച് ക്രയോപ്രിസർവ് ചെയ്യുന്നു. ഓരോ സാമ്പിളിന്റെയും ഒരു ചെറിയ ഭാഗം ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി വഴി വിശകലനം ചെയ്തു, ശേഷിക്കുന്ന സാമ്പിളുകൾ CD4+, CD8+, CD45- സെല്ലുകൾക്കായി മൂന്ന് റൗണ്ട് സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിന് വിധേയമാക്കി. ഈ സെൽ ഭിന്നസംഖ്യകൾ എൽസി-എംഎസ്/എംഎസ് ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. (ഡി) സ്റ്റാൻഡേർഡ് മെറ്റബോളൈറ്റ് സമൃദ്ധിയുടെ ഹീറ്റ് മാപ്പ്. സാമ്പിളുകൾക്കിടയിലുള്ള യൂക്ലിഡിയൻ ദൂരങ്ങളുടെ വാർഡിന്റെ ക്ലസ്റ്ററിംഗിനെ ഡെൻഡ്രോഗ്രാം പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. (E) സാമ്പിൾ മെറ്റാബോലൈറ്റ് മാപ്പിന്റെ പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് അനാലിസിസ് (PCA), ഓരോ സാമ്പിളിന്റെയും മൂന്ന് പകർപ്പുകൾ കാണിക്കുന്നു, ഒരേ രോഗിയിൽ നിന്നുള്ള സാമ്പിളുകൾ ഒരു ലൈൻ വഴി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. (F) രോഗിയിൽ കണ്ടീഷൻ ചെയ്ത സാമ്പിളിന്റെ മെറ്റാബോലൈറ്റ് പ്രൊഫൈലിന്റെ PCA (അതായത്, ഭാഗിക ആവർത്തനം ഉപയോഗിച്ച്); സാമ്പിൾ തരം കോൺവെക്സ് ഹൾ ഉപയോഗിച്ച് പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു. PC1, പ്രധാന ഘടകം 1; PC2, പ്രധാന ഘടകം 2.
അടുത്തതായി, ആറ് HGSC രോഗികളുടെ പ്രാഥമിക അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമറുകളിലും CD4 +, CD8 +, CD45-കോശ ഭിന്നസംഖ്യകളിലെ 99 മെറ്റബോളിറ്റുകളെ വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ ഈ സമ്പുഷ്ടീകരണ രീതി പ്രയോഗിച്ചു (ചിത്രം 2C, ചിത്രം S3A, പട്ടിക S3, S4). ജീവനുള്ള കോശങ്ങളുടെ യഥാർത്ഥ വലിയ സാമ്പിളിന്റെ 2% മുതൽ 70% വരെ താൽപ്പര്യമുള്ള ജനസംഖ്യയാണ്, കൂടാതെ രോഗികൾക്കിടയിൽ കോശങ്ങളുടെ അനുപാതം വളരെയധികം വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു. ബീഡുകൾ വേർതിരിച്ചതിനുശേഷം, സാമ്പിളിലെ എല്ലാ ജീവനുള്ള കോശങ്ങളുടെയും ശരാശരി 85% ത്തിലധികം താൽപ്പര്യമുള്ള സമ്പുഷ്ടമായ ഭിന്നസംഖ്യ (CD4+, CD8+ അല്ലെങ്കിൽ CD45-) ആണ്. മനുഷ്യ ട്യൂമർ ടിഷ്യു മെറ്റബോളിസത്തിൽ നിന്ന് കോശ ജനസംഖ്യ വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഈ സമ്പുഷ്ടീകരണ രീതി ഞങ്ങളെ അനുവദിക്കുന്നു, ഇത് വലിയ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല. ഈ പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗിച്ച്, എൽ-കൈനുറെനൈനും അഡിനോസിനും, ഈ രണ്ട് നന്നായി സ്വഭാവ സവിശേഷതകളുള്ള രോഗപ്രതിരോധ ശേഷി കുറയ്ക്കുന്ന മെറ്റബോളിറ്റുകളും ട്യൂമർ ടി കോശങ്ങളിലോ ട്യൂമർ കോശങ്ങളിലോ ഉയർന്നതാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു (ചിത്രം S3, B, C). അതുകൊണ്ട്, രോഗികളുടെ കലകളിലെ ജൈവശാസ്ത്രപരമായി പ്രധാനപ്പെട്ട മെറ്റബോളിറ്റുകളെ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള നമ്മുടെ കോശ വിഭജനത്തിന്റെയും മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി സാങ്കേതികവിദ്യയുടെയും വിശ്വാസ്യതയും കഴിവും ഈ ഫലങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു.
രോഗികൾക്കിടയിലും അവയ്ക്കിടയിലും കോശ തരങ്ങളുടെ ശക്തമായ ഉപാപചയ വേർതിരിവ് ഞങ്ങളുടെ വിശകലനം വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 2D, ചിത്രം S4A). പ്രത്യേകിച്ച്, മറ്റ് രോഗികളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, രോഗി 70 വ്യത്യസ്ത ഉപാപചയ സവിശേഷതകൾ കാണിച്ചു (ചിത്രം 2E, ചിത്രം S4B), രോഗികൾക്കിടയിൽ ഗണ്യമായ ഉപാപചയ വൈവിധ്യം ഉണ്ടാകാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. മറ്റ് രോഗികളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ (1.2 മുതൽ 2 ലിറ്റർ വരെ; പട്ടിക S1), രോഗി 70 (80 മില്ലി) ൽ ശേഖരിച്ച അസൈറ്റുകളുടെ ആകെ അളവ് കുറവായിരുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. പ്രധാന ഘടക വിശകലന സമയത്ത് (ഉദാഹരണത്തിന്, ഭാഗിക ആവർത്തന വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച്) ഇൻറർ-പേഷ്യന്റ് വൈവിധ്യത്തിന്റെ നിയന്ത്രണം കോശ തരങ്ങൾക്കിടയിലുള്ള സ്ഥിരമായ മാറ്റങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ കോശ തരങ്ങളും/അല്ലെങ്കിൽ സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതിയും മെറ്റാബോലൈറ്റ് പ്രൊഫൈൽ അനുസരിച്ച് വ്യക്തമായി സംയോജിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു (ചിത്രം 2F). ഒറ്റ മെറ്റാബോലൈറ്റുകളുടെ വിശകലനം ഈ ഇഫക്റ്റുകൾക്ക് പ്രാധാന്യം നൽകുകയും കോശ തരങ്ങളും സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതിയും തമ്മിലുള്ള കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്തു. നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ട ഏറ്റവും തീവ്രമായ വ്യത്യാസം MNA ആണെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, ഇത് സാധാരണയായി CD45- കോശങ്ങളിലും ട്യൂമറിലേക്ക് നുഴഞ്ഞുകയറുന്ന CD4+, CD8+ കോശങ്ങളിലും സമ്പുഷ്ടമാണ് (ചിത്രം 3A). CD4 + കോശങ്ങളെ സംബന്ധിച്ചിടത്തോളം, ഈ പ്രഭാവം ഏറ്റവും വ്യക്തമാണ്, കൂടാതെ CD8 + കോശങ്ങളിലെ MNA യെയും പരിസ്ഥിതി ശക്തമായി ബാധിക്കുന്നതായി തോന്നുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ഇത് പ്രധാനമല്ല, കാരണം ആറ് രോഗികളിൽ മൂന്ന് പേർക്ക് മാത്രമേ ട്യൂമർ CD8+ സ്കോറുകൾക്കായി വിലയിരുത്താൻ കഴിയൂ. MNA കൂടാതെ, അസൈറ്റുകളിലെയും ട്യൂമറുകളിലെയും വ്യത്യസ്ത തരം കോശങ്ങളിൽ, TIL-ൽ മോശമായി ചിത്രീകരിക്കപ്പെടുന്ന മറ്റ് മെറ്റബോളിറ്റുകളും വ്യത്യസ്തമായി സമ്പന്നമാണ് (ചിത്രങ്ങൾ S3, S4). അതിനാൽ, കൂടുതൽ ഗവേഷണത്തിനായി ഈ ഡാറ്റ ഇമ്മ്യൂണോമോഡുലേറ്ററി മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ ഒരു വാഗ്ദാനമായ സെറ്റ് വെളിപ്പെടുത്തുന്നു.
(എ) അസൈറ്റുകളിൽ നിന്നും ട്യൂമറിൽ നിന്നുമുള്ള CD4+, CD8+, CD45- കോശങ്ങളിലെ MNA യുടെ സാധാരണ ഉള്ളടക്കം. ബോക്സ് പ്ലോട്ട് മീഡിയൻ (ലൈൻ), ഇന്റർക്വാർട്ടൈൽ ശ്രേണി (ഫ്രെയിം ഹിഞ്ച്), ഡാറ്റ ശ്രേണി എന്നിവ കാണിക്കുന്നു, ഇന്റർക്വാർട്ടൈൽ ശ്രേണിയുടെ (ഫ്രെയിം വിസ്കർ) 1.5 മടങ്ങ് വരെ. പേഷ്യന്റ് മെറ്റീരിയൽസ് ആൻഡ് മെത്തേഡുകളിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, P മൂല്യം നിർണ്ണയിക്കാൻ രോഗിയുടെ ലിംമ മൂല്യം ഉപയോഗിക്കുക (*P<0.05 ഉം **P<0.01 ഉം). (ബി) MNA മെറ്റബോളിസത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം (60). മെറ്റബോളൈറ്റുകൾ: എസ്-അഡെനോസിൽ-1-മെഥിയോണിൻ; എസ്എഎച്ച്, എസ്-അഡെനോസിൻ-1-ഹോമോസിസ്റ്റൈൻ; എൻഎ, നിക്കോട്ടിനാമൈഡ്; എംഎൻഎ, 1-മെഥൈൽനിക്കോട്ടിനാമൈഡ്; 2-പിവൈ, 1-മെഥൈൽ- 2-പിരിഡോൺ-5-കാർബോക്സാമൈഡ്; 4-പിവൈ, 1-മെഥൈൽ-4-പിരിഡോൺ-5-കാർബോക്സാമൈഡ്; എൻആർ, നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് റൈബോസ്; എൻ‌എം‌എൻ, നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് മോണോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ്. എൻ‌സൈമുകൾ (പച്ച): എൻ‌എൻ‌എം‌ടി, നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് എൻ-മെഥൈൽ‌ട്രാൻസ്ഫെറേസ്; എസ്‌ഐ‌ആർ‌ടി, സിർ‌ട്ടുയിനുകൾ; എൻ‌എ‌എം‌പി‌ടി, നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് ഫോസ്ഫോറിബോസിൽ ട്രാൻസ്ഫെറേസ്; എ‌ഒ‌എക്സ് 1, ആൽ‌ഡിഹൈഡ് ഓക്സിഡേസ് 1; എൻ‌ആർ‌കെ, നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് റൈബോസൈഡ് കൈനേസ്; എൻ‌എം‌എൻ‌എടി, നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് മോണോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് അഡിനൈലേറ്റ് ട്രാൻസ്ഫെറേസ്; പി‌എൻ‌പി 1, പ്യൂരിൻ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് ഫോസ്ഫോറിലേസ്. (സി) അസൈറ്റുകൾ (ചാരനിറം), ട്യൂമർ (ചുവപ്പ്; n = 3 രോഗികൾ) എന്നിവയുടെ scRNA-seq ന്റെ t-SNE. (ഡി) scRNA-seq ഉപയോഗിച്ച് തിരിച്ചറിഞ്ഞ വ്യത്യസ്ത സെൽ പോപ്പുലേഷനുകളിലെ NNMT എക്സ്പ്രഷൻ. (ഇ) SK-OV-3, ഹ്യൂമൻ എംബ്രിയോൺ കിഡ്നി (HEK) 293T, T സെല്ലുകൾ, MNA- ചികിത്സിച്ച T സെല്ലുകൾ എന്നിവയിൽ NNMT, AOX1 എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ. SK-OV-3 മായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ മടക്കിയ എക്സ്പ്രഷൻ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. SEM ഉള്ള എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേൺ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (n = 6 ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാക്കൾ). 35-ൽ കൂടുതലുള്ള Ct മൂല്യങ്ങൾ കണ്ടെത്താനാകാത്തതായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, T സെല്ലുകളിലും 8mM MNA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച T കോശങ്ങളിലും SLC22A1, SLC22A2 എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ. SK-OV-3 യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ മടക്കിയ എക്സ്പ്രഷൻ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. SEM ഉള്ള എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേൺ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (n = 6 ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാക്കൾ). 35-ൽ കൂടുതലുള്ള Ct മൂല്യങ്ങൾ കണ്ടെത്താനാകാത്തതായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു (UD). (G) MNA ഉപയോഗിച്ച് 72 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത ശേഷം സജീവമാക്കിയ ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാവ് T കോശങ്ങളിലെ സെൽ MNA ഉള്ളടക്കം. SEM ഉള്ള എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേൺ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (n = 4 ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാക്കൾ).
നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് എൻ-മീഥൈൽട്രാൻസ്ഫെറേസ് (NNMT; ചിത്രം 3B) വഴി S-adenosyl-1-methionine (SAM) ൽ നിന്ന് നിക്കോട്ടിനാമൈഡ് (NA) ലേക്ക് മീഥൈൽ ഗ്രൂപ്പ് കൈമാറ്റം ചെയ്തുകൊണ്ടാണ് MNA ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നത്. വിവിധതരം മനുഷ്യ കാൻസറുകളിൽ NNMT അമിതമായി പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ വ്യാപനം, അധിനിവേശം, മെറ്റാസ്റ്റാസിസ് എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (25-27). TME-യിലെ ടി കോശങ്ങളിലെ MNA യുടെ ഉറവിടം നന്നായി മനസ്സിലാക്കാൻ, മൂന്ന് HGSC രോഗികളുടെ അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമറുകളിലും കോശ തരങ്ങളിലുടനീളം NNMT യുടെ പ്രകടനത്തെ ചിത്രീകരിക്കാൻ ഞങ്ങൾ scRNA-seq ഉപയോഗിച്ചു (പട്ടിക S5). ഏകദേശം 6,500 കോശങ്ങളുടെ വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമർ പരിതസ്ഥിതികളിലും, NNMT എക്സ്പ്രഷൻ അനുമാനിക്കപ്പെടുന്ന ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ്, ട്യൂമർ സെൽ പോപ്പുലേഷനുകളിൽ മാത്രമായി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു എന്നാണ് (ചിത്രം 3, C, D). PTPRC (CD45 +) പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഒരു പോപ്പുലേഷനിലും വ്യക്തമായ NNMT എക്സ്പ്രഷൻ ഇല്ല എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ് (ചിത്രം 3D, ചിത്രം S5A), ഇത് മെറ്റാബോലൈറ്റ് സ്പെക്ട്രത്തിൽ കണ്ടെത്തിയ MNA ടി സെല്ലുകളിൽ അവതരിപ്പിച്ചിട്ടുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ആൽഡിഹൈഡ് ഓക്സിഡേസ് 1 (AOX1) ന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ MNA യെ 1-മീഥൈൽ-2-പൈറിഡോൺ-5-കാർബോക്സാമൈഡ് (2-PYR) അല്ലെങ്കിൽ 1-മീഥൈൽ-4-പൈറിഡോൺ-5-കാർബോക്സാമൈഡ് (4-PYR) ആക്കി മാറ്റുന്നു; ചിത്രം 3B) COL1A1 (ചിത്രം S5A) പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകളുടെ ജനസംഖ്യയിൽ മാത്രമായി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു, ഇത് ടി കോശങ്ങൾക്ക് പരമ്പരാഗത MNA മെറ്റബോളിസത്തിന്റെ കഴിവില്ലെന്ന് ഒരുമിച്ച് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. HGSC രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള അസൈറ്റുകളിൽ നിന്നുള്ള രണ്ടാമത്തെ സ്വതന്ത്ര സെൽ ഡാറ്റ സെറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഈ MNA- യുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേൺ പരിശോധിച്ചു (ചിത്രം S5B; n = 6) (16). കൂടാതെ, MNA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്ന ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാവിന്റെ ടി കോശങ്ങളുടെ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (qPCR) വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് കൺട്രോൾ SK-OV-3 അണ്ഡാശയ ട്യൂമർ കോശങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, NNMT അല്ലെങ്കിൽ AOX1 മിക്കവാറും പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല എന്നാണ് (ചിത്രം 3E). ഈ അപ്രതീക്ഷിത ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകളിൽ നിന്നോ ട്യൂമറുകളിൽ നിന്നോ TME-യിലെ അടുത്തുള്ള ടി കോശങ്ങളിലേക്ക് MNA സ്രവിക്കപ്പെടാം എന്നാണ്.
ലയിക്കുന്ന കാരിയർ 22 (SLC22) കുടുംബം (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3) എൻകോഡ് ചെയ്‌ത 1 മുതൽ 3 വരെയുള്ള ഓർഗാനിക് കാറ്റേഷൻ ട്രാൻസ്‌പോർട്ടറുകളുടെ (OCT1, OCT2, OCT3) കുടുംബം സ്ഥാനാർത്ഥികളിൽ ഉൾപ്പെടുന്നുവെങ്കിലും, MNA യുടെ സാധ്യതയുള്ള ട്രാൻസ്‌പോർട്ടറുകൾ ഇപ്പോഴും നിർവചിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല (28). ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാവിന്റെ ടി കോശങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള mRNA യുടെ QPCR SLC22A1 ന്റെ കുറഞ്ഞ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ കാണിച്ചു, പക്ഷേ SLC22A2 ന്റെ കണ്ടെത്താനാകാത്ത ലെവലുകൾ കാണിച്ചു, ഇത് മുമ്പ് സാഹിത്യത്തിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ടെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 3F) (29). ഇതിനു വിപരീതമായി, SK-OV-3 അണ്ഡാശയ ട്യൂമർ സെൽ ലൈൻ രണ്ട് ട്രാൻസ്‌പോർട്ടറുകളുടെയും ഉയർന്ന അളവ് പ്രകടിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 3F).
വിദേശ MNA ആഗിരണം ചെയ്യാനുള്ള കഴിവ് T കോശങ്ങൾക്ക് ഉണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതയിലുള്ള MNA കളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാവിന്റെ T കോശങ്ങൾ 72 മണിക്കൂർ കൾച്ചർ ചെയ്തു. ബാഹ്യ MNA യുടെ അഭാവത്തിൽ, MNA യുടെ കോശ ഉള്ളടക്കം കണ്ടെത്താൻ കഴിയില്ല (ചിത്രം 3G). എന്നിരുന്നാലും, ബാഹ്യ MNA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച സജീവമാക്കിയ T കോശങ്ങൾ കോശങ്ങളിലെ MNA ഉള്ളടക്കത്തിൽ 6 mM MNA വരെ ഡോസ്-ആശ്രിത വർദ്ധനവ് കാണിച്ചു (ചിത്രം 3G). ട്രാൻസ്പോർട്ടർ എക്സ്പ്രഷന്റെ താഴ്ന്ന നിലയും ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ MNA മെറ്റബോളിസത്തിന് ഉത്തരവാദിയായ പ്രധാന എൻസൈമിന്റെ അഭാവവും ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, TIL ഇപ്പോഴും MNA എടുക്കുമെന്ന് ഈ ഫലം സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
രോഗികളുടെ ടി സെല്ലുകളിലെയും ഇൻ വിട്രോ എംഎൻഎ ആഗിരണം പരീക്ഷണങ്ങളിലെയും മെറ്റബോളൈറ്റുകളുടെ സ്പെക്ട്രം, കാൻസർ-അസോസിയേറ്റഡ് ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകൾ (സിഎഎഫ്) എംഎൻഎ സ്രവിക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ ട്യൂമർ കോശങ്ങൾ ടിഐഎല്ലിന്റെ ഫിനോടൈപ്പിനെയും പ്രവർത്തനത്തെയും നിയന്ത്രിക്കും. ടി കോശങ്ങളിൽ എംഎൻഎയുടെ സ്വാധീനം നിർണ്ണയിക്കാൻ, ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാവിന്റെ ടി കോശങ്ങളെ എംഎൻഎയുടെ സാന്നിധ്യത്തിലോ അഭാവത്തിലോ ഇൻ വിട്രോയിൽ സജീവമാക്കി, അവയുടെ വ്യാപനവും സൈറ്റോകൈൻ ഉൽപാദനവും വിലയിരുത്തി. ഏറ്റവും ഉയർന്ന അളവിൽ എംഎൻഎ ചേർത്ത 7 ദിവസത്തിനുശേഷം, ജനസംഖ്യ ഇരട്ടിപ്പിക്കൽ സംഖ്യ മിതമായി കുറഞ്ഞു, അതേസമയം എല്ലാ ഡോസുകളിലും ഓജസ്സ് നിലനിർത്തി (ചിത്രം 4എ). കൂടാതെ, എക്സോജനസ് എംഎൻഎ ചികിത്സ ട്യൂമർ നെക്രോസിസ് ഫാക്ടർ-α പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന സിഡി4 +, സിഡി8 + ടി കോശങ്ങളുടെ അനുപാതത്തിൽ വർദ്ധനവിന് കാരണമായി (ടിഎൻഎഫ്α; ചിത്രം 4ബി). ഇതിനു വിപരീതമായി, സിഡി4 + ടി കോശങ്ങളിൽ ഐഎഫ്എൻ-γ ​​യുടെ ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ഉത്പാദനം ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു, പക്ഷേ സിഡി8 + ടി കോശങ്ങളിൽ അല്ല, ഇന്റർല്യൂക്കിൻ 2 ൽ കാര്യമായ മാറ്റമൊന്നും ഉണ്ടായില്ല (ഐഎൽ-2; ചിത്രം 4, സി, ഡി). അതിനാൽ, ഈ MNA- ചികിത്സിച്ച T സെൽ കൾച്ചറുകളിൽ നിന്നുള്ള സൂപ്പർനേറ്റന്റുകളുടെ എൻസൈം-ലിങ്ക്ഡ് ഇമ്മ്യൂണോസോർബന്റ് അസ്സേ (ELISA) TNFα-യിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവ് കാണിച്ചു, IFN-γ-ൽ കുറവുണ്ടായി, IL-2-ൽ മാറ്റമൊന്നും കാണിച്ചില്ല (ചിത്രം 4, E മുതൽ G വരെ). . IFN-γ-ന്റെ കുറവ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് T കോശങ്ങളുടെ ആന്റി-ട്യൂമർ പ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്നതിൽ MNA ഒരു പങ്കു വഹിച്ചേക്കാം എന്നാണ്. T സെൽ-മധ്യസ്ഥ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റിയിൽ MNA യുടെ പ്രഭാവം അനുകരിക്കുന്നതിന്, ഫോളേറ്റ് റിസപ്റ്റർ α, ഗ്രീൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ (GFP) -CAR-T) കോശങ്ങളാൽ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്ന ചിമെറിക് ആന്റിജൻ റിസപ്റ്റർ T (FRα-CAR-T) കോശങ്ങൾ ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാവിന്റെ പെരിഫറൽ ബ്ലഡ് മോണോ ന്യൂക്ലിയർ സെല്ലുകൾ (PBMC) എന്നിവയാൽ ഉത്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു. MNA-യുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ 24 മണിക്കൂർ CAR-T കോശങ്ങളെ കൾച്ചർ ചെയ്തു, തുടർന്ന് 10:1 എന്ന ലക്ഷ്യ അനുപാതത്തിൽ ഫോളേറ്റ് റിസപ്റ്റർ α പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന മനുഷ്യ SK-OV-3 അണ്ഡാശയ ട്യൂമർ കോശങ്ങളുമായി സഹ-കൾച്ചർ ചെയ്തു. MNA ചികിത്സ FRα-CAR-T കോശങ്ങളുടെ കൊലയാളി പ്രവർത്തനത്തിൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടാക്കി, ഇത് അഡിനോസിൻ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കപ്പെടുന്ന FRα-CAR-T കോശങ്ങളുടേതിന് സമാനമാണ് (ചിത്രം 4H).
(എ) 7-ാം ദിവസം കൾച്ചറിൽ നിന്ന് നേരിട്ട് ലഭിച്ച ആകെ विजालाल കോശ എണ്ണവും ജനസംഖ്യ ഇരട്ടിപ്പിക്കലും (PD). ബാർ ഗ്രാഫ് ആറ് ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാക്കളുടെ ശരാശരി + SEM പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. കുറഞ്ഞത് n = 3 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. (ബി മുതൽ ഡി വരെ) CD3/CD28, IL-2 എന്നിവ 7 ദിവസത്തേക്ക് അവയുടെ യഥാക്രമം MNA സാന്ദ്രതയിൽ T കോശങ്ങളെ സജീവമാക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു. വിശകലനത്തിന് മുമ്പ്, 4 മണിക്കൂർ ഗോൾഗിസ്റ്റോപ്പിനൊപ്പം PMA/ionomycin ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങളെ ഉത്തേജിപ്പിച്ചു. ടി കോശങ്ങളിലെ TNFα (B) എക്സ്പ്രഷൻ. ജീവനുള്ള കോശങ്ങളിലെ TNFα എക്സ്പ്രഷന്റെ ഉദാഹരണ ചിത്രം (ഇടത്) ടാബുലാർ ഡാറ്റയും (വലത്). ടി കോശങ്ങളിലെ IFN-γ (C), IL-2 (D) എക്സ്പ്രഷൻ. സൈറ്റോകൈനുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി ഉപയോഗിച്ചാണ് അളന്നത്. ബാർ ഗ്രാഫ് ശരാശരി (n = 6 ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാക്കൾ) + SEM പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. P മൂല്യം നിർണ്ണയിക്കാൻ വേരിയൻസിന്റെയും ആവർത്തിച്ചുള്ള അളവുകളുടെയും (*P<0.05, **P<0.01) വൺ-വേ വിശകലനം ഉപയോഗിക്കുക. കുറഞ്ഞത് n = 3 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. (E മുതൽ G വരെ) CD3/CD28, IL-2 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 7 ദിവസത്തേക്ക് അവയുടെ MNA സാന്ദ്രതയിൽ T കോശങ്ങളെ സജീവമാക്കി. PMA/ionomycin ഉത്തേജനത്തിന് 4 മണിക്കൂർ മുമ്പും ശേഷവും മീഡിയം ശേഖരിച്ചു. TNFα (E), IFN-γ (F), IL-2 (G) എന്നിവയുടെ സാന്ദ്രത ELISA അളന്നു. ബാർ ഗ്രാഫ് ശരാശരി (n = 5 ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാക്കൾ) + SEM പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. വേരിയൻസിന്റെ വൺ-വേ വിശകലനവും ആവർത്തിച്ചുള്ള അളവുകളും ഉപയോഗിച്ച് നിർണ്ണയിക്കുന്ന P മൂല്യം (*P<0.05). ഡോട്ട് ഇട്ട രേഖ കണ്ടെത്തലിന്റെ കണ്ടെത്തൽ പരിധിയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. (H) സെൽ ലിസിസ് അസ്സേ. FRα-CAR-T അല്ലെങ്കിൽ GFP-CAR-T കോശങ്ങളെ 24 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് അഡിനോസിൻ (250μM) അല്ലെങ്കിൽ MNA (10 mM) ഉപയോഗിച്ച് ക്രമീകരിച്ചു, അല്ലെങ്കിൽ ചികിത്സിച്ചില്ല (Ctrl). SK-OV-3 കോശങ്ങളുടെ ശതമാനം കൊല്ലൽ അളന്നു. വെൽച്ച് t ടെസ്റ്റ് (*P<0.5 ഉം **P<0.01 ഉം) വഴി P മൂല്യം നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു.
MNA- ആശ്രിത TNFα എക്സ്പ്രഷൻ റെഗുലേഷനെക്കുറിച്ച് ഒരു മെക്കാനിക്കൽ ധാരണ നേടുന്നതിനായി, MNA- ചികിത്സിച്ച T സെല്ലുകളുടെ TNFα mRNA-യിലെ മാറ്റങ്ങൾ വിലയിരുത്തി (ചിത്രം 5A). MNA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാവ് T സെല്ലുകൾ TNFα ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ലെവലുകളിൽ ഇരട്ടി വർദ്ധനവ് കാണിച്ചു, ഇത് MNA TNFα ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ റെഗുലേഷനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഈ സാധ്യമായ റെഗുലേറ്ററി മെക്കാനിസം അന്വേഷിക്കുന്നതിന്, TNFα നിയന്ത്രിക്കുന്ന രണ്ട് അറിയപ്പെടുന്ന ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങൾ, അതായത് സജീവമാക്കിയ T സെൽ ന്യൂക്ലിയർ ഫാക്ടർ (NFAT), നിർദ്ദിഷ്ട പ്രോട്ടീൻ 1 (Sp1), പ്രോക്സിമൽ TNFα പ്രൊമോട്ടറുമായി MNA ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിന്റെ പ്രതികരണമായി വിലയിരുത്തി (30). TNFα പ്രൊമോട്ടറിൽ 6 തിരിച്ചറിഞ്ഞ NFAT ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകളും 2 Sp1 ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകളും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഒരു സൈറ്റിൽ ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്നു [-5'cap-ൽ നിന്ന് 55 ബേസ് ജോഡികൾ (bp)] (30). MNA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുമ്പോൾ, TNFα പ്രൊമോട്ടറുമായി Sp1-ന്റെ ബൈൻഡിംഗ് മൂന്ന് മടങ്ങ് വർദ്ധിച്ചതായി ക്രോമാറ്റിൻ ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷൻ (ChIP) കാണിച്ചു. NFAT-യുടെ സംയോജനവും വർദ്ധിക്കുകയും പ്രാധാന്യത്തിലേക്ക് അടുക്കുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം 5B). ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, Sp1 ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ വഴി TNFα യുടെ എക്സ്പ്രഷനെ MNA നിയന്ത്രിക്കുന്നു എന്നാണ്, കൂടാതെ ഒരു പരിധിവരെ NFAT യുടെ എക്സ്പ്രഷനും.
(എ) എംഎൻഎ ഇല്ലാതെ കൾച്ചർ ചെയ്ത ടി സെല്ലുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, എംഎൻഎ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച ടി സെല്ലുകളിലെ ടിഎൻഎഫ്α എക്സ്പ്രഷന്റെ മടക്ക മാറ്റം. എസ്ഇഎം ഉപയോഗിച്ചുള്ള എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേൺ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (n = 5 ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാക്കൾ). കുറഞ്ഞത് n = 3 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. (ബി) NFAT, Sp1 എന്നിവയ്ക്ക് ശേഷം 8 mM MNA ഉപയോഗിച്ചോ അല്ലാതെയോ ചികിത്സിച്ച ടി സെല്ലുകളുടെ TNFα പ്രൊമോട്ടർ 4 മണിക്കൂർ (Ctrl) ഉം PMA/ionomycin ഉത്തേജനവുമായി സംയോജിപ്പിച്ചു. ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷനായി ഇമ്മ്യൂണോഗ്ലോബുലിൻ G (IgG), H3 എന്നിവ യഥാക്രമം നെഗറ്റീവ്, പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണങ്ങളായി ഉപയോഗിച്ചു. നിയന്ത്രണവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ MNA-ചികിത്സിച്ച കോശങ്ങളിലെ TNFα പ്രൊമോട്ടറുമായി Sp1, NFAT എന്നിവയുടെ ബൈൻഡിംഗ് നിരവധി മടങ്ങ് വർദ്ധിച്ചതായി ChIP യുടെ അളവ് കാണിച്ചു. കുറഞ്ഞത് n = 3 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. ഒന്നിലധികം ടി-ടെസ്റ്റുകൾ നിർണ്ണയിക്കുന്ന പി മൂല്യം (*** P <0.01). (സി) HGSC യുടെ അസൈറ്റുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ട്യൂമറിൽ ടിഎൻഎഫിന്റെ വർദ്ധിച്ച എക്സ്പ്രഷൻ ടിഎൻഎഫ് കാണിച്ചു. നിറങ്ങൾ വ്യത്യസ്ത രോഗികളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന കോശങ്ങളെ ക്രമരഹിതമായി 300 ആയി സാമ്പിൾ ചെയ്യുകയും അമിതമായി വരയ്ക്കുന്നത് പരിമിതപ്പെടുത്താൻ ഇളകുകയും ചെയ്തു (** Padj = 0.0076). (D) അണ്ഡാശയ കാൻസറിനുള്ള MNA യുടെ നിർദ്ദിഷ്ട മാതൃക. TME-യിലെ ട്യൂമർ കോശങ്ങളിലും ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകളിലും MNA ഉത്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, ഇത് T കോശങ്ങളാൽ ആഗിരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു. TNFα പ്രൊമോട്ടറുമായി Sp1 ന്റെ ബന്ധനം MNA വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് TNFα ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും TNFα സൈറ്റോകൈൻ ഉൽപാദനവും വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. MNA IFN-γ യിലും കുറവുണ്ടാക്കുന്നു. T സെൽ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ തടസ്സം കൊല്ലാനുള്ള കഴിവ് കുറയ്ക്കുന്നതിനും ട്യൂമർ വളർച്ച ത്വരിതപ്പെടുത്തുന്നതിനും കാരണമാകുന്നു.
റിപ്പോർട്ടുകൾ പ്രകാരം, TNFα-യ്ക്ക് മുന്നിലും പിന്നിലും ആശ്രയിക്കുന്ന ആന്റി-ട്യൂമർ, ആന്റി-ട്യൂമർ ഇഫക്റ്റുകൾ ഉണ്ട്, എന്നാൽ അണ്ഡാശയ കാൻസറിന്റെ വളർച്ചയും മെറ്റാസ്റ്റാസിസും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിൽ ഇതിന് അറിയപ്പെടുന്ന പങ്കുണ്ട് (31-33). റിപ്പോർട്ടുകൾ പ്രകാരം, അണ്ഡാശയ കാൻസറുള്ള രോഗികളിൽ അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമർ ടിഷ്യൂകളിലും TNFα യുടെ സാന്ദ്രത ശൂന്യമായ ടിഷ്യൂകളേക്കാൾ കൂടുതലാണ് (34-36). മെക്കാനിസത്തിന്റെ കാര്യത്തിൽ, വെളുത്ത രക്താണുക്കളുടെ സജീവമാക്കൽ, പ്രവർത്തനം, വ്യാപനം എന്നിവ നിയന്ത്രിക്കാനും കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ ഫിനോടൈപ്പ് മാറ്റാനും TNFα-യ്ക്ക് കഴിയും (37, 38). ഈ കണ്ടെത്തലുകൾക്ക് അനുസൃതമായി, ഡിഫറൻഷ്യൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് അസൈറ്റുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ട്യൂമർ ടിഷ്യൂകളിലെ ടി കോശങ്ങളിൽ TNF ഗണ്യമായി ഉയർന്നതായി കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 5C). സൈറ്റോടോക്സിക് അല്ലാത്ത ഫിനോടൈപ്പ് ഉള്ള ടി സെൽ പോപ്പുലേഷനുകളിൽ മാത്രമേ TNF എക്സ്പ്രഷനിലെ വർദ്ധനവ് പ്രകടമായിട്ടുള്ളൂ (ചിത്രം S5A). ചുരുക്കത്തിൽ, HGSC-യിൽ MNA-യ്ക്ക് ഇരട്ട രോഗപ്രതിരോധ ശേഷി കുറയ്ക്കുന്നതും ട്യൂമർ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതുമായ ഇഫക്റ്റുകൾ ഉണ്ടെന്ന വീക്ഷണത്തെ ഈ ഡാറ്റ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.
ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫ്ലൂറസെന്റ് ലേബലിംഗ് TIL മെറ്റബോളിസത്തെക്കുറിച്ച് പഠിക്കുന്നതിനുള്ള പ്രധാന രീതിയായി മാറിയിരിക്കുന്നു. പെരിഫറൽ ബ്ലഡ് ലിംഫോസൈറ്റുകളുമായോ ദ്വിതീയ ലിംഫോയിഡ് അവയവങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള ടി കോശങ്ങളുമായോ താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, മ്യൂറിൻ, ഹ്യൂമൻ ടിഐഎൽ എന്നിവയ്ക്ക് ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം ചെയ്യാനുള്ള ഉയർന്ന പ്രവണതയുണ്ടെന്നും (4, 39) മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ ക്രമാനുഗതമായ നഷ്ടം (19, 40) ഉണ്ടെന്നും ഈ പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. ഈ പഠനത്തിൽ സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, പ്രധാന വികസനം ട്യൂമർ കോശങ്ങളുടെയും ടിഐഎല്ലിന്റെയും മെറ്റബോളിസത്തെ അതേ വേർതിരിച്ച ട്യൂമർ ടിഷ്യുവിൽ നിന്ന് താരതമ്യം ചെയ്യുക എന്നതാണ്. ഈ മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളിൽ ചിലതിന് അനുസൃതമായി, അസൈറ്റുകളിൽ നിന്നും ട്യൂമറുകളിൽ നിന്നുമുള്ള ട്യൂമർ (CD45-EpCAM +) കോശങ്ങൾക്ക് CD8 +, CD4 + T കോശങ്ങളേക്കാൾ ഉയർന്ന ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം ഉണ്ട്, ഇത് ട്യൂമർ കോശങ്ങളുടെ ഉയർന്ന ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം ടി കോശങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്താമെന്ന് പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. ടി സെൽ മത്സരം എന്ന ആശയം. TME. എന്നിരുന്നാലും, ട്യൂമർ കോശങ്ങളുടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം CD8 + T കോശങ്ങളേക്കാൾ കൂടുതലാണ്, പക്ഷേ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം CD4 + T കോശങ്ങളുടേതിന് സമാനമാണ്. ട്യൂമർ കോശങ്ങൾക്ക് ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് മെറ്റബോളിസം പ്രധാനമാണെന്ന ഉയർന്നുവരുന്ന പ്രമേയത്തെ ഈ ഫലങ്ങൾ ശക്തിപ്പെടുത്തുന്നു (41, 42). CD4 + T കോശങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച് CD8 + T കോശങ്ങൾ ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് പ്രവർത്തന വൈകല്യത്തിന് കൂടുതൽ സാധ്യതയുള്ളതാകാമെന്നും, അല്ലെങ്കിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം നിലനിർത്താൻ CD4 + T കോശങ്ങൾ ഗ്ലൂക്കോസ് ഒഴികെയുള്ള കാർബൺ സ്രോതസ്സുകൾ ഉപയോഗിച്ചേക്കാമെന്നും അവർ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു (43, 44). CD4 + T ഇഫക്റ്ററുകൾ, T ഇഫക്റ്റർ മെമ്മറി, അസൈറ്റുകളിലെ T സെൻട്രൽ മെമ്മറി സെല്ലുകൾ എന്നിവയ്ക്കിടയിൽ ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം അല്ലെങ്കിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനത്തിൽ വ്യത്യാസമൊന്നും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചില്ല എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്. അതുപോലെ, ട്യൂമറുകളിലെ CD8 + T കോശങ്ങളുടെ വ്യത്യാസ അവസ്ഥ ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം മാറ്റങ്ങളുമായി യാതൊരു ബന്ധവുമില്ല, ഇത് ഇൻ വിട്രോയിൽ സംസ്കരിച്ച ടി സെല്ലുകളും ഇൻ വിവോയിലെ മനുഷ്യ TIL ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രധാന വ്യത്യാസം എടുത്തുകാണിക്കുന്നു (22). പക്ഷപാതമില്ലാത്ത ഓട്ടോമാറ്റിക് സെൽ പോപ്പുലേഷൻ അലോക്കേഷൻ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഈ നിരീക്ഷണങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചത്, ട്യൂമർ കോശങ്ങളേക്കാൾ ഉയർന്ന ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം എന്നിവയുള്ള CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + സെല്ലുകൾ വ്യാപകമാണെന്നും എന്നാൽ മെറ്റബോളിക് ആക്റ്റീവ് സെൽ പോപ്പുലേഷനുണ്ടെന്നും ഇത് വെളിപ്പെടുത്തി. scRNA-seq വിശകലനത്തിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ മൈലോയ്ഡ് സപ്രസ്സർ സെല്ലുകളുടെയോ പ്ലാസ്മസൈറ്റോയിഡ് ഡെൻഡ്രിറ്റിക് സെല്ലുകളുടെയോ സാധ്യതയുള്ള ഉപജനസംഖ്യയെ ഈ ജനസംഖ്യ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. ഇവ രണ്ടും മനുഷ്യ അണ്ഡാശയ മുഴകളിൽ [45] റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, അവയ്ക്ക് ഇനിയും കൂടുതൽ പഠനങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്. ഈ മൈലോയ്ഡ് ഉപജനസംഖ്യയെ വിവരിക്കുക എന്നതാണ്.
ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള രീതികൾക്ക് കോശ തരങ്ങൾക്കിടയിലുള്ള ഗ്ലൂക്കോസിലും ഓക്‌സിഡേറ്റീവ് മെറ്റബോളിസത്തിലുമുള്ള പൊതുവായ വ്യത്യാസങ്ങൾ വ്യക്തമാക്കാൻ കഴിയുമെങ്കിലും, TME-യിലെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മെറ്റബോളിസത്തിനായി ഗ്ലൂക്കോസോ മറ്റ് കാർബൺ സ്രോതസ്സുകളോ ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്ന കൃത്യമായ മെറ്റബോളിറ്റുകളെ ഇതുവരെ നിർണ്ണയിച്ചിട്ടില്ല. നൽകിയിരിക്കുന്ന TIL ഉപസെറ്റിലേക്ക് മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ സാന്നിധ്യമോ അഭാവമോ നൽകുന്നതിന്, എക്‌സൈസ് ചെയ്ത ടിഷ്യുവിൽ നിന്ന് സെൽ പോപ്പുലേഷന്റെ ശുദ്ധീകരണം ആവശ്യമാണ്. അതിനാൽ, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച ഞങ്ങളുടെ സെൽ സമ്പുഷ്ടീകരണ രീതി, രോഗികളുടെ സാമ്പിളുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നതിൽ ടി സെല്ലുകളിലും ട്യൂമർ സെൽ പോപ്പുലേഷനുകളിലും വ്യത്യസ്തമായി സമ്പുഷ്ടമാക്കപ്പെടുന്ന മെറ്റബോളിറ്റുകളെക്കുറിച്ചുള്ള ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകാൻ കഴിയും. ഫ്ലൂറസെൻസ്-ആക്ടിവേറ്റഡ് സെൽ സോർട്ടിംഗിനെക്കാൾ ഈ രീതിക്ക് ഗുണങ്ങളുണ്ടെങ്കിലും, അന്തർലീനമായ സ്ഥിരതയും/അല്ലെങ്കിൽ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള വിറ്റുവരവ് നിരക്കും കാരണം ചില മെറ്റബോളിറ്റ് ലൈബ്രറികളെ ബാധിച്ചേക്കാം (22). എന്നിരുന്നാലും, സാമ്പിൾ തരങ്ങൾക്കിടയിൽ അവ വളരെയധികം വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതിനാൽ, അഡിനോസിൻ, കൈനൂറൈൻ എന്നീ രണ്ട് അംഗീകൃത ഇമ്മ്യൂണോസപ്രസീവ് മെറ്റബോളിറ്റുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഞങ്ങളുടെ രീതിക്ക് കഴിഞ്ഞു.
ട്യൂമറുകളുടെയും TIL ഉപവിഭാഗങ്ങളുടെയും മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ പങ്കിനെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങളുടെ മെറ്റബോളിക് വിശകലനം കൂടുതൽ ഉൾക്കാഴ്ച നൽകുന്നു. ഒന്നാമതായി, ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി ഉപയോഗിച്ച്, ട്യൂമറുകൾക്കും CD4 + T സെല്ലുകൾക്കും ഇടയിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനത്തിൽ വ്യത്യാസമില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, LC-MS/MS വിശകലനം ഈ ജനസംഖ്യയിലെ മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ സമൃദ്ധിയിൽ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തി, TIL മെറ്റബോളിസത്തെയും അതിന്റെ മൊത്തത്തിലുള്ള മെറ്റബോളിക് പ്രവർത്തനത്തെയും കുറിച്ചുള്ള നിഗമനങ്ങൾക്ക് ശ്രദ്ധാപൂർവ്വമായ വ്യാഖ്യാനം ആവശ്യമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. രണ്ടാമതായി, ട്യൂമറുകളല്ല, അസൈറ്റുകളിലെ CD45-കോശങ്ങൾക്കും ടി സെല്ലുകൾക്കും ഇടയിൽ ഏറ്റവും വലിയ വ്യത്യാസമുള്ള മെറ്റബോളിറ്റാണ് MNA. അതിനാൽ, കമ്പാർട്ടുമെന്റലൈസേഷനും ട്യൂമർ സ്ഥാനവും TIL മെറ്റബോളിസത്തിൽ വ്യത്യസ്ത ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കിയേക്കാം, ഇത് ഒരു നിശ്ചിത സൂക്ഷ്മ പരിതസ്ഥിതിയിൽ സാധ്യമായ വൈവിധ്യത്തെ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. മൂന്നാമതായി, MNA-ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന എൻസൈം NNMT യുടെ പ്രകടനമാണ് പ്രധാനമായും CAF-ൽ പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നത്, ഇത് ഒരു പരിധിവരെ ട്യൂമർ കോശങ്ങളാണ്, പക്ഷേ കണ്ടെത്താവുന്ന MNA ലെവലുകൾ ട്യൂമർ-ഉത്ഭവിച്ച T കോശങ്ങളിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു. അണ്ഡാശയ CAF-ൽ NNMT യുടെ അമിതപ്രയോഗത്തിന് അറിയപ്പെടുന്ന ഒരു കാൻസർ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്ന ഫലമുണ്ട്, ഭാഗികമായി CAF മെറ്റബോളിസം, ട്യൂമർ അധിനിവേശം, മെറ്റാസ്റ്റാസിസ് എന്നിവയുടെ പ്രോത്സാഹനം മൂലമാണ് (27). TIL ന്റെ മൊത്തത്തിലുള്ള അളവ് മിതമാണെങ്കിലും, CAF ലെ NNMT യുടെ പ്രകടനത്തിന് കാൻസർ ജീനോം അറ്റ്ലസ് (TCGA) മെസെൻചൈമൽ ഉപവിഭാഗവുമായി അടുത്ത ബന്ധമുണ്ട്, ഇത് മോശം രോഗനിർണയവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (27, 46, 47). അവസാനമായി, MNA ഡീഗ്രഡേഷന് കാരണമായ AOX1 എന്ന എൻസൈമിന്റെ പ്രകടനവും CAF പോപ്പുലേഷനിൽ മാത്രമായി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു, ഇത് T കോശങ്ങൾക്ക് MNA മെറ്റബോളൈസ് ചെയ്യാനുള്ള കഴിവില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഈ കണ്ടെത്തൽ പരിശോധിക്കാൻ കൂടുതൽ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ആവശ്യമാണെങ്കിലും, T കോശങ്ങളിലെ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള MNA ഒരു രോഗപ്രതിരോധ ശേഷി കുറയ്ക്കുന്ന CAF മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിന്റെ സാന്നിധ്യത്തെ സൂചിപ്പിക്കാമെന്ന ആശയത്തെ ഈ ഫലങ്ങൾ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.
MNA ട്രാൻസ്പോർട്ടറുകളുടെ കുറഞ്ഞ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലും MNA മെറ്റബോളിസത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന പ്രധാന പ്രോട്ടീനുകളുടെ കണ്ടെത്താനാകാത്ത അളവും കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, ടി സെല്ലുകളിൽ MNA യുടെ സാന്നിധ്യം അപ്രതീക്ഷിതമാണ്. രണ്ട് സ്വതന്ത്ര കൂട്ടങ്ങളുടെ scRNA-seq വിശകലനത്തിലൂടെയും ടാർഗെറ്റുചെയ്‌ത qPCR വഴിയും NNMT അല്ലെങ്കിൽ AOX1 എന്നിവ കണ്ടെത്താനായില്ല. ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് MNA ടി സെല്ലുകളാൽ സമന്വയിപ്പിക്കപ്പെടുന്നില്ല, മറിച്ച് ചുറ്റുമുള്ള TME യിൽ നിന്ന് ആഗിരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു എന്നാണ്. ഇൻ വിട്രോ പരീക്ഷണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് ടി സെല്ലുകൾ ബാഹ്യ MNA ശേഖരിക്കാൻ പ്രവണത കാണിക്കുന്നു എന്നാണ്.
ഞങ്ങളുടെ ഇൻ വിട്രോ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് എക്സോജനസ് MNA, T കോശങ്ങളിൽ TNFα യുടെ പ്രകടനത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കുകയും TNFα പ്രൊമോട്ടറുമായി Sp1 ന്റെ ബന്ധനം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു എന്നാണ്. TNFα ന് ആന്റി-ട്യൂമർ, ആന്റി-ട്യൂമർ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഉണ്ടെങ്കിലും, അണ്ഡാശയ കാൻസറിൽ, TNFα അണ്ഡാശയ കാൻസറിന്റെ വളർച്ചയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കും (31-33). അണ്ഡാശയ ട്യൂമർ സെൽ കൾച്ചറിൽ TNFα യുടെ ന്യൂട്രലൈസേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ മൗസ് മോഡലുകളിൽ TNFα സിഗ്നൽ ഇല്ലാതാക്കുന്നത് TNFα- മധ്യസ്ഥതയുള്ള ഇൻഫ്ലമേറ്ററി സൈറ്റോകൈൻ ഉത്പാദനം മെച്ചപ്പെടുത്തുകയും ട്യൂമർ വളർച്ചയെ തടയുകയും ചെയ്യും (32, 35). അതിനാൽ, ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, TME- ഉത്ഭവിച്ച MNA, ഓട്ടോക്രൈൻ ലൂപ്പിലൂടെ TNFα- ആശ്രിത സംവിധാനത്തിലൂടെ ഒരു പ്രോ-ഇൻഫ്ലമേറ്ററി മെറ്റാബോലൈറ്റായി പ്രവർത്തിക്കും, അതുവഴി അണ്ഡാശയ കാൻസറിന്റെ സംഭവവും വ്യാപനവും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു (31). ഈ സാധ്യതയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, അണ്ഡാശയ കാൻസറിനുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള ചികിത്സാ ഏജന്റായി TNFα ഉപരോധം പഠിക്കുന്നു (37, 48, 49). കൂടാതെ, MNA അണ്ഡാശയ ട്യൂമർ കോശങ്ങളിലേക്ക് CAR-T കോശങ്ങളുടെ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റിയെ ദുർബലപ്പെടുത്തുന്നു, ഇത് MNA- മധ്യസ്ഥതയുള്ള രോഗപ്രതിരോധ അടിച്ചമർത്തലിന് കൂടുതൽ തെളിവുകൾ നൽകുന്നു. മൊത്തത്തിൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ട്യൂമറുകളും CAF കോശങ്ങളും MNA യെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ TME യിലേക്ക് സ്രവിക്കുന്ന ഒരു മാതൃകയാണ്. (i) TNF-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് അണ്ഡാശയ കാൻസർ വളർച്ചാ ഉത്തേജനം, (ii) MNA-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ടി സെൽ സൈറ്റോടോക്സിക് ആക്റ്റിവിറ്റി ഇൻഹിബിഷൻ എന്നിവയിലൂടെ, ഇതിന് ഇരട്ട ട്യൂമർ പ്രഭാവം ഉണ്ടാകാം (ചിത്രം 5D).
ഉപസംഹാരമായി, ദ്രുത കോശ സമ്പുഷ്ടീകരണം, സിംഗിൾ-സെൽ സീക്വൻസിംഗ്, മെറ്റബോളിക് പ്രൊഫൈലിംഗ് എന്നിവയുടെ സംയോജനം പ്രയോഗിച്ചുകൊണ്ട്, എച്ച്ജിഎസ്സി രോഗികളിൽ ട്യൂമറുകൾക്കും അസൈറ്റ്സ് കോശങ്ങൾക്കും ഇടയിലുള്ള വലിയ ഇമ്മ്യൂണോമെറ്റബോളോമിക് വ്യത്യാസങ്ങൾ ഈ പഠനം വെളിപ്പെടുത്തി. ടി കോശങ്ങൾക്കിടയിൽ ഗ്ലൂക്കോസ് ആഗിരണം, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം എന്നിവയിൽ വ്യത്യാസങ്ങളുണ്ടെന്ന് ഈ സമഗ്ര വിശകലനം കാണിച്ചു, കൂടാതെ എം‌എൻ‌എയെ നോൺ-സെൽ ഓട്ടോണമസ് ഇമ്മ്യൂൺ റെഗുലേറ്ററി മെറ്റാബോലൈറ്റായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു. മനുഷ്യ കാൻസറുകളിൽ ടി സെൽ മെറ്റബോളിസത്തെ ടിഎംഇ എങ്ങനെ ബാധിക്കുന്നു എന്നതിനെ ഈ ഡാറ്റ സ്വാധീനിക്കുന്നു. ടി കോശങ്ങൾക്കും കാൻസർ കോശങ്ങൾക്കും ഇടയിലുള്ള പോഷകങ്ങൾക്കായുള്ള നേരിട്ടുള്ള മത്സരം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ട്യൂമർ പുരോഗതിയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിനും എൻഡോജെനസ് രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങളെ അടിച്ചമർത്തുന്നതിനും മെറ്റബോളിറ്റുകൾക്ക് പരോക്ഷ റെഗുലേറ്ററുകളായി പ്രവർത്തിക്കാൻ കഴിയും. ഈ റെഗുലേറ്ററി മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ പ്രവർത്തനപരമായ പങ്കിനെക്കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ വിവരണം, ആന്റി-ട്യൂമർ രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ബദൽ തന്ത്രങ്ങൾ തുറന്നേക്കാം.
കനേഡിയൻ ടിഷ്യു റിപ്പോസിറ്ററി നെറ്റ്‌വർക്ക് സാക്ഷ്യപ്പെടുത്തിയ ബിസി കാൻസർ ട്യൂമർ ടിഷ്യു റിപ്പോസിറ്ററി വഴിയാണ് രോഗിയുടെ സാമ്പിളുകളും ക്ലിനിക്കൽ ഡാറ്റയും ലഭിച്ചത്. ബിസി കാൻസർ റിസർച്ച് എത്തിക്സ് കമ്മിറ്റിയും ബ്രിട്ടീഷ് കൊളംബിയ സർവകലാശാലയും (H07-00463) അംഗീകരിച്ച പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്, എല്ലാ രോഗികളുടെയും സാമ്പിളുകളും ക്ലിനിക്കൽ ഡാറ്റയും രേഖാമൂലമുള്ള സമ്മതം നേടുകയോ ഔപചാരികമായി അവരുടെ സമ്മതം ഒഴിവാക്കുകയോ ചെയ്തു. സാമ്പിളുകൾ സർട്ടിഫൈഡ് ബയോബാങ്കിൽ (BRC-00290) സൂക്ഷിക്കുന്നു. വിശദമായ രോഗി സവിശേഷതകൾ പട്ടികകൾ S1, S5 എന്നിവയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ക്രയോപ്രിസർവേഷനായി, രോഗിയുടെ ട്യൂമർ സാമ്പിൾ യാന്ത്രികമായി വിഘടിപ്പിക്കാനും തുടർന്ന് ഒരു സെൽ സസ്പെൻഷൻ ലഭിക്കുന്നതിന് 100-മൈക്രോൺ ഫിൽട്ടറിലൂടെ തള്ളാനും ഒരു സ്കാൽപെൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു. കോശങ്ങൾ പെല്ലറ്റ് ചെയ്യാനും സൂപ്പർനേറ്റന്റ് നീക്കം ചെയ്യാനും രോഗിയുടെ അസൈറ്റുകൾ 1500 ആർ‌പി‌എമ്മിൽ 10 മിനിറ്റ് 4°C-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. ട്യൂമർ, അസൈറ്റുകൾ എന്നിവയിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച കോശങ്ങൾ 50% ചൂട്-നിർജ്ജീവമാക്കിയ ഹ്യൂമൻ എബി സെറം (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്), 40% ആർ‌പി‌എം‌ഐ-1640 (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്), 10% ഡൈമെഥൈൽ സൾഫോക്സൈഡ് എന്നിവയിൽ ക്രയോപ്രിസേർവ് ചെയ്തു. ഈ സംരക്ഷിത സിംഗിൾ സെൽ സസ്പെൻഷനുകൾ ഉരുക്കി താഴെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന മെറ്റബോളോമിക്സിനും മെറ്റബോളൈറ്റ് നിർണ്ണയത്തിനും ഉപയോഗിച്ചു.
പൂർണ്ണ മാധ്യമത്തിൽ 0.22 μm ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത 50:50 സപ്ലിമെന്റഡ് RPMI 1640: AimV അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) 10% ഹീറ്റ്-ഇനാക്റ്റിവേറ്റഡ് ഹ്യൂമൻ AB സെറം (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, 1 x പെൻസിലിൻ സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (PenStrep) ലായനി (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്), 50 μMB-മെർകാപ്റ്റോഎത്തനോൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. AimV (ഇൻവിട്രോജൻ) 20 mM Hepes (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്), 2 mM l-glutamine (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റഡ് ചെയ്യുന്നു. ഫ്ലോ സൈറ്റോമീറ്റർ സ്റ്റെയിനിംഗ് ബഫറിൽ 0.22μm ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫേർഡ് സലൈൻ (PBS; ഇൻവിട്രോജൻ) 3% ഹീറ്റ്-ഇനാക്റ്റിവേറ്റഡ് AB ഹ്യൂമൻ സെറം (സിഗ്മ) ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റഡ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. സെൽ സമ്പുഷ്ടീകരണ ബഫറിൽ 0.22μm ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത PBS അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ 0.5% ചൂട്-നിർജ്ജീവമാക്കിയ ഹ്യൂമൻ AB സെറം (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ചേർത്തിരിക്കുന്നു.
37°C പൂർണ്ണ മാധ്യമത്തിൽ, 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 10 nM MT DR ഉം 100 μM 2-NBDG ഉം ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകൾ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. അടുത്തതായി, 4°C ൽ 15 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് കോശങ്ങൾ വയാബിലിറ്റി ഡൈ eF506 ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. FC ബ്ലോക്കിലെയും (eBioscience) ബ്രില്യന്റ് സ്റ്റെയിൻ ബഫറിലെയും (BD ബയോസയൻസസ്) സെല്ലുകൾ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുക, ഫ്ലോ സൈറ്റോമീറ്റർ സ്റ്റെയിനിംഗ് ബഫറിൽ (നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച്) നേർപ്പിക്കുക, മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 10 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. 4°C ൽ ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി സ്റ്റെയിനിംഗ് ബഫറിൽ 20 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് ഒരു കൂട്ടം ആന്റിബോഡികൾ (ടേബിൾ S2) ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകൾ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുക. വിശകലനത്തിന് മുമ്പ് ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി സ്റ്റെയിനിംഗ് ബഫറിൽ (സൈടെക് അറോറ; 3L-16V-14B-8R കോൺഫിഗറേഷൻ) സെല്ലുകൾ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുക. സെൽ കൗണ്ട് ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്യാൻ സ്പെക്ട്രോഫ്ലോയും ഫ്ലോജോ V10 ഉം ഉപയോഗിക്കുക, ഡാറ്റ സൃഷ്ടിക്കാൻ ഗ്രാഫ്പാഡ് പ്രിസം 8 ഉപയോഗിക്കുക. 2-NBDG, MT DR എന്നിവയുടെ മീഡിയൻ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത (MFI) ലോഗ്-നോർമലൈസ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് പൊരുത്തപ്പെടുന്ന രോഗികളെ കണക്കാക്കുന്നതിനായി സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനത്തിനായി ഒരു ജോടിയാക്കിയ ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചു. വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് 40-ൽ താഴെ ഇവന്റുകളുള്ള എല്ലാ പോപ്പുലേഷനുകളും നീക്കം ചെയ്യുക; സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനവും ഡാറ്റ വിഷ്വലൈസേഷനും നടത്തുന്നതിന് മുമ്പ് ഏതെങ്കിലും നെഗറ്റീവ് മൂല്യങ്ങൾക്ക് 1 എന്ന MFI മൂല്യം നൽകുക.
മുകളിലുള്ള പ്രോസസ് പാനലിന്റെ മാനുവൽ ഗേറ്റിംഗ് തന്ത്രത്തിന് അനുബന്ധമായി, ഫ്ലോജോയിലെ മൃതകോശങ്ങൾ ഇല്ലാതാക്കിയ ശേഷം, പോപ്പുലേഷനിലേക്ക് സെല്ലുകൾ സ്വയമേവ അസൈൻ ചെയ്യുന്നതിന്, ഷേപ്പ് റെസ്ട്രിക്ഷൻ ട്രീ (FAUST) (21) പ്രകാരമുള്ള പൂർണ്ണമായ അനോട്ടേഷൻ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. തെറ്റായി വിഭജിച്ചതായി തോന്നുന്ന പോപ്പുലേഷനുകളും (PD1+ നെ PD1-ട്യൂമർ സെല്ലുകളുമായി സംയോജിപ്പിക്കുന്നു) നിലനിർത്തിയ പോപ്പുലേഷനുകളും ലയിപ്പിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ ഔട്ട്‌പുട്ട് സ്വമേധയാ കൈകാര്യം ചെയ്യുന്നു. ഓരോ സാമ്പിളിലും ആകെ 11 പോപ്പുലേഷനുകൾക്ക് ശരാശരി 2% ൽ കൂടുതൽ സെല്ലുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.
ലുക്കോസൈറ്റ് സെപ്പറേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് PBMC യെ വേർതിരിക്കാൻ Ficoll ഗ്രേഡിയന്റ് ഡെൻസിറ്റി സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ ഉപയോഗിച്ചു (STEMCELL ടെക്നോളജീസ്). നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച്, CD8 + T സെല്ലുകളെ PBMC യിൽ നിന്ന് CD8 മൈക്രോബീഡ്സ് (മിൽറ്റെനി) ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ച് 2 ആഴ്ചത്തേക്ക് TransAct (മിൽറ്റെനി) ഉപയോഗിച്ച് പൂർണ്ണ മാധ്യമത്തിൽ വികസിപ്പിച്ചു. IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) അടങ്ങിയ പൂർണ്ണ മാധ്യമത്തിൽ കോശങ്ങളെ 5 ദിവസം നിൽക്കാൻ അനുവദിച്ചു, തുടർന്ന് TransAct ഉപയോഗിച്ച് വീണ്ടും ഉത്തേജിപ്പിച്ചു. 7-ാം ദിവസം, നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച്, തുടർച്ചയായ മൂന്ന് റൗണ്ടുകളിൽ കോശങ്ങളെ സമ്പുഷ്ടമാക്കാൻ മനുഷ്യ CD45 മൈക്രോബീഡുകൾ (മിൽറ്റെനി) ഉപയോഗിച്ചു. ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി വിശകലനത്തിനായി സെല്ലുകളെ അലിക്വോട്ട് ചെയ്തു (മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ), LC-MS/MS വിശകലനത്തിനായി ഒരു ദശലക്ഷം സെല്ലുകളെ മൂന്ന് തവണ അലിക്വോട്ട് ചെയ്തു. താഴെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ LC-MS/MS ആണ് സാമ്പിളുകൾ പ്രോസസ്സ് ചെയ്തത്. 1,000 എന്ന അയോൺ സംഖ്യ ഉപയോഗിച്ച് നഷ്ടപ്പെട്ട മെറ്റാബോലൈറ്റ് മൂല്യം ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കി. വിശകലനത്തിന് മുമ്പ് ഓരോ സാമ്പിളും മൊത്തം അയോൺ നമ്പർ (TIC) ഉപയോഗിച്ച് നോർമലൈസ് ചെയ്യുന്നു, ലോഗരിതം അനുസരിച്ച് പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുകയും മെറ്റാബോഅനലിസ്റ്റ്ആർ-ൽ യാന്ത്രികമായി നോർമലൈസ് ചെയ്യപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു.
ഓരോ രോഗിയുടെയും സിംഗിൾ സെൽ സസ്പെൻഷൻ ഉരുക്കി 40 μm ഫിൽട്ടർ വഴി പൂർണ്ണ മാധ്യമത്തിലേക്ക് (മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ) ഫിൽട്ടർ ചെയ്തു. നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്, മൈക്രോബീഡ്സ് (മിൽറ്റെനി) ഉപയോഗിച്ച് മാഗ്നറ്റിക് ബീഡ് വേർതിരിക്കൽ വഴി തുടർച്ചയായി മൂന്ന് റൗണ്ട് പോസിറ്റീവ് സെലക്ഷൻ നടത്തി CD8+, CD4+, CD45- സെല്ലുകൾ (ഐസിൽ) എന്നിവയ്ക്കുള്ള സാമ്പിളുകൾ സമ്പുഷ്ടമാക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, കോശങ്ങളെ സെൽ എൻറിച്ച്മെന്റ് ബഫറിൽ (മിൽറ്റെനി) വീണ്ടും സമ്പുഷ്ടമാക്കി എണ്ണുന്നു. 4°C താപനിലയിൽ മനുഷ്യ CD8 ബീഡുകൾ, മനുഷ്യ CD4 ബീഡുകൾ അല്ലെങ്കിൽ മനുഷ്യ CD45 ബീഡുകൾ (മിൽറ്റെനി) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 15 മിനിറ്റ് നേരം കോശങ്ങളെ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് സെൽ എൻറിച്ച്മെന്റ് ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി. സാമ്പിൾ LS കോളത്തിലൂടെ (മിൽറ്റെനി) കടത്തിവിടുകയും പോസിറ്റീവ്, നെഗറ്റീവ് ഭിന്നസംഖ്യകൾ ശേഖരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ദൈർഘ്യം കുറയ്ക്കുന്നതിനും സെൽ വീണ്ടെടുക്കൽ ഘട്ടം പരമാവധിയാക്കുന്നതിനും, CD8-ഫ്രാക്ഷൻ CD4+ സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിന്റെ രണ്ടാം റൗണ്ടിനായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, തുടർന്നുള്ള CD45-സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിനായി CD4-ഫ്രാക്ഷൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു. വേർതിരിക്കൽ പ്രക്രിയയിലുടനീളം ലായനി ഐസിൽ സൂക്ഷിക്കുക.
മെറ്റാബോളൈറ്റ് വിശകലനത്തിനായി സാമ്പിളുകൾ തയ്യാറാക്കാൻ, കോശങ്ങൾ ഐസ്-കോൾഡ് ഉപ്പ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് ഒരിക്കൽ കഴുകി, ഓരോ സാമ്പിളിലും 1 മില്ലി 80% മെഥനോൾ ചേർത്ത്, പിന്നീട് വോർടെക്സ് ചെയ്ത് ദ്രാവക നൈട്രജനിൽ ഫ്രീസ് ചെയ്തു. സാമ്പിളുകൾ മൂന്ന് തവണ ഫ്രീസ്-ഥാ സൈക്കിളുകൾക്ക് വിധേയമാക്കി, 14,000 ആർ‌പി‌എമ്മിൽ 15 മിനിറ്റ് 4°C താപനിലയിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. മെറ്റാബോളൈറ്റുകൾ അടങ്ങിയ സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ഉണങ്ങുന്നത് വരെ ബാഷ്പീകരിക്കപ്പെടുന്നു. മെറ്റാബോളൈറ്റുകൾ 50 μl 0.03% ഫോർമിക് ആസിഡിൽ വീണ്ടും ലയിപ്പിച്ചു, മിശ്രിതമാക്കാൻ വോർടെക്സ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് അവശിഷ്ടങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യാൻ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു.
മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ മെറ്റബോളൈറ്റുകളെ വേർതിരിച്ചെടുക്കുക. മെറ്റബോളോമിക്സ് ഗവേഷണത്തിനായി സൂപ്പർനേറ്റന്റിനെ ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള ഒരു ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി കുപ്പിയിലേക്ക് മാറ്റുക. ബാച്ച് ഇഫക്റ്റുകൾ തടയുന്നതിന് ഓരോ സാമ്പിളിലും സമാനമായ എണ്ണം കോശങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കാൻ ഒരു റാൻഡം ട്രീറ്റ്മെന്റ് പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗിക്കുക. AB SCIEX QTRAP 5500 ട്രിപ്പിൾ ക്വാഡ്രുപോൾ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ (50) മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച ആഗോള മെറ്റബോളൈറ്റുകളുടെ ഒരു ഗുണപരമായ വിലയിരുത്തൽ ഞങ്ങൾ നടത്തി. മൾട്ടിക്വാന്റ്റ് പതിപ്പ് 2.1 സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (അപ്ലൈഡ് ബയോസിസ്റ്റംസ് SCIEX) ഉപയോഗിച്ചാണ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിക് വിശകലനവും പീക്ക് ഏരിയ ഇന്റഗ്രേഷനും നടത്തിയത്.
കാണാതായ മെറ്റാബോലൈറ്റ് മൂല്യം കണക്കാക്കാൻ 1000 എന്ന അയോൺ കൗണ്ട് ഉപയോഗിച്ചു, സാമ്പിൾ പ്രോസസ്സിംഗിൽ നിന്ന് ഇൻസ്ട്രുമെന്റൽ വിശകലനം അവതരിപ്പിച്ച മാറ്റങ്ങൾ ശരിയാക്കാൻ ഓരോ സാമ്പിളിന്റെയും TIC ഉപയോഗിച്ചു, കണ്ടെത്തിയ ഓരോ മെറ്റാബോലൈറ്റിന്റെയും നോർമലൈസ്ഡ് പീക്ക് ഏരിയ കണക്കാക്കി. TIC നോർമലൈസ് ചെയ്ത ശേഷം, ലോഗരിഥമിക് പരിവർത്തനത്തിനും ഓട്ടോമാറ്റിക് നോർം ലൈൻ സ്കെയിലിംഗിനും MetaboAnalystR(51) (ഡിഫോൾട്ട് പാരാമീറ്റർ) ഉപയോഗിക്കുന്നു. സാമ്പിൾ തരങ്ങൾക്കിടയിലുള്ള മെറ്റബോളോം വ്യത്യാസങ്ങളുടെ പര്യവേക്ഷണ വിശകലനം നടത്താൻ ഞങ്ങൾ വീഗൻ ആർ പാക്കേജുള്ള പിസിഎ ഉപയോഗിച്ചു, രോഗികളെ വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഭാഗിക ആവർത്തന വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചു. സാമ്പിളുകൾക്കിടയിലുള്ള യൂക്ലിഡിയൻ ദൂരം ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്യുന്നതിന് ഒരു ഹീറ്റ് മാപ്പ് ഡെൻഡ്രോഗ്രാം നിർമ്മിക്കാൻ വാർഡ് രീതി ഉപയോഗിക്കുക. മുഴുവൻ സെൽ തരത്തിലും മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിലും വ്യത്യസ്തമായി സമൃദ്ധമായ മെറ്റാബോലൈറ്റുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ സ്റ്റാൻഡേർഡ് മെറ്റാബോലൈറ്റ് അബണ്ടൻസിയിൽ ഞങ്ങൾ ലിംമ (52) ഉപയോഗിച്ചു. വിശദീകരണം ലളിതമാക്കുന്നതിന്, മോഡൽ വ്യക്തമാക്കാൻ ഞങ്ങൾ ഗ്രൂപ്പ് ശരാശരി പാരാമീറ്റർ ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിലെ സെൽ തരങ്ങളെ ഓരോ ഗ്രൂപ്പായും പരിഗണിക്കുന്നു (n = 6 ഗ്രൂപ്പുകൾ); സിഗ്നിഫിക്കൻസ് ടെസ്റ്റിനായി, ഓരോ മെറ്റബോളൈറ്റിനും ഞങ്ങൾ മൂന്ന് ആവർത്തിച്ചുള്ള അളവുകൾ നടത്തി. തെറ്റായ റെപ്ലിക്കേഷൻ ഒഴിവാക്കാൻ, രോഗിയെ ലിംമ ഡിസൈനിൽ ഒരു തടസ്സമായി ഉൾപ്പെടുത്തി. വ്യത്യസ്ത രോഗികൾക്കിടയിലുള്ള മെറ്റബോളൈറ്റുകളിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, രോഗികളെ ഉൾപ്പെടുത്തി ലിമ്മ മോഡൽ ഒരു നിശ്ചിത രീതിയിൽ ക്രമീകരിച്ചു. പാഡ്ജിന്റെ സെൽ തരത്തിനും സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതിക്കും ഇടയിലുള്ള മുൻകൂട്ടി വ്യക്തമാക്കിയ വ്യത്യാസത്തിന്റെ പ്രാധാന്യം ഞങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു <0.05 (ബെഞ്ചമിനി-ഹോച്ച്ബർഗ് തിരുത്തൽ).
മിൽറ്റെനി ഡെഡ് സെൽ റിമൂവൽ കിറ്റ് (> 80% വയബിലിറ്റി) ഉപയോഗിച്ച് വീര്യം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ശേഷം, 10x 5′ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗിച്ച് മൊത്തം ലൈവ് ഫ്രോസൺ അസൈറ്റുകളിലും ട്യൂമർ സാമ്പിളുകളിലും സിംഗിൾ-സെൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം സീക്വൻസിംഗ് നടത്തി. പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ട്യൂമറുകളും അസൈറ്റുകളും ഉള്ള അഞ്ച് കേസുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു, എന്നിരുന്നാലും ഒരു ട്യൂമർ സാമ്പിളിൽ നിന്നുള്ള കുറഞ്ഞ വയബിലിറ്റി അതിന്റെ ഉൾപ്പെടുത്തലിനെ തടഞ്ഞു. രോഗികളുടെ ഒന്നിലധികം തിരഞ്ഞെടുപ്പുകൾ നേടുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ 10x ക്രോമിയം കൺട്രോളറിന്റെ ലെയ്‌നുകളിൽ ഓരോ രോഗിയുടെയും സാമ്പിളുകൾ സംയോജിപ്പിച്ചു, കൂടാതെ അസൈറ്റുകളും ട്യൂമർ സൈറ്റുകളും വെവ്വേറെ വിശകലനം ചെയ്തു. സീക്വൻസിംഗിന് ശേഷം [ഇല്ലുമിന ഹൈസെക് 4000 28×98 ബിപി പെയർഡ് എൻഡ് (PE), ക്യൂബെക്ക് ജീനോം; ട്യൂമറിനും അസൈറ്റിനും യഥാക്രമം 73,488 ഉം 41,378 ഉം റീഡുകൾ]], ഞങ്ങൾ CellSNP ഉം Vireo ഉം ഉപയോഗിച്ചു (CellSNP അടിസ്ഥാനമാക്കി GRCh38 നൽകുന്ന സാധാരണ മനുഷ്യ SNP (VCF) ന് ഒരു ദാതാവിന്റെ ഐഡന്റിറ്റി നൽകിയിരിക്കുന്നു. ഡ്യൂപ്ലെക്സുകളായി തിരിച്ചറിഞ്ഞ അസൈൻ ചെയ്യാത്ത കോശങ്ങളും കോശങ്ങളും അസൈറ്റുകൾക്കും ട്യൂമർ സാമ്പിളുകൾക്കും ഇടയിൽ പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ദാതാക്കളും ഒഴികെ, രോഗിയുടെ ജനിതകരൂപ നിലയുടെ (IBS) ഏറ്റവും അടുത്ത ഐഡന്റിറ്റി (IBS) അനുമാനിക്കാൻ ഞങ്ങൾ SNPRelate ഉപയോഗിക്കുന്നു (54). ഈ ടാസ്‌ക്കിന്റെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ, ഡൌൺസ്‌ട്രീം വിശകലനത്തിനായി ട്യൂമറിലും അസൈറ്റുകളിലും സമൃദ്ധമായ സെൽ പ്രാതിനിധ്യമുള്ള മൂന്ന് കേസുകൾ ഞങ്ങൾ നിലനിർത്തി. സ്‌കാറ്റർ (55), സ്‌ക്രാൻ (56) ബയോകണ്ടക്ടർ പാക്കേജിംഗിൽ ഒരു മാസ് ഫിൽട്രേഷൻ ഘട്ടം നടത്തിയ ശേഷം, വിശകലനത്തിനായി ഇത് 6975 സെല്ലുകൾ (യഥാക്രമം ട്യൂമറിലും അസൈറ്റുകളിലും നിന്ന് 2792 ഉം 4183 കോശങ്ങൾ) നൽകി. പങ്കിട്ട ഏറ്റവും അടുത്തുള്ള അയൽക്കാരൻ നെറ്റ്‌വർക്കിന്റെ (SNN) igraph-ന്റെ (57) Louvain ക്ലസ്റ്ററിംഗ് ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ജാക്കാർഡ് ക്ലസ്റ്റർ സെല്ലുകളിലേക്കുള്ള ദൂരത്തെ എക്സ്പ്രഷൻ അനുസരിച്ച് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്. മാർക്കർ ജീൻ എക്സ്പ്രഷനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള അനുമാന സെൽ തരങ്ങളിലേക്ക് ക്ലസ്റ്ററുകളെ സ്വമേധയാ വ്യാഖ്യാനിക്കുകയും ടി-എസ്എൻഇ ഉപയോഗിച്ച് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുകയും ചെയ്തു. കുറഞ്ഞ റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷനുള്ള സബ്ക്ലസ്റ്ററുകൾ ഒഴികെ, സിഡി 8 എ, ജിഇസഡ്എംഎ എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷനിലൂടെ സൈറ്റോടോക്സിക് ടി സെല്ലുകൾ നിർവചിക്കപ്പെടുന്നു. ഇസാർ തുടങ്ങിയവരുടെ (16) പ്രസിദ്ധീകരിച്ച ഡാറ്റ ഞങ്ങൾ ആക്‌സസ് ചെയ്‌തു, അവയുടെ ടി-എസ്എൻഇ എംബെഡിംഗ് ഉൾപ്പെടെ, രോഗപ്രതിരോധ സെൽ മാർക്കറുകൾക്കും എൻഎൻഎംടി എക്സ്പ്രഷനും ഇടയിലുള്ള എക്സ്പ്രഷൻ ഓവർലാപ്പ് നിയന്ത്രിക്കാൻ കഴിയും.
ഫിക്കോൾ ഗ്രേഡിയന്റ് ഡെൻസിറ്റി സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ല്യൂക്കോസൈറ്റ് സെപ്പറേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് (STEMCELL ടെക്നോളജീസ്) PBMC വേർതിരിച്ചു. CD3 ബീഡുകൾ (മിൽറ്റെനി) ഉപയോഗിച്ച് CD3 + സെല്ലുകൾ PBMC യിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചു. MNA യുടെ സാന്നിധ്യത്തിലോ അഭാവത്തിലോ, പ്ലേറ്റ്-ബൗണ്ട് CD3 (5μg/ml), ലയിക്കുന്ന CD28 (3μg/ml), IL-2 (300 U/ml; Proleukin) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് CD3+ സെല്ലുകൾ സജീവമാക്കി. വികാസത്തിന്റെ അവസാന ദിവസം, ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി വഴി വയബിലിറ്റി (ഫിക്സബിൾ വയബിലിറ്റി ഡൈ eFluor450, eBioscience), പ്രൊലിഫറേഷൻ (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) എന്നിവ വിലയിരുത്തി. ഗോൾഗിസ്റ്റോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് PMA (20 ng/ml), അയണോമൈസിൻ (1μg/ml) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങളെ 4 മണിക്കൂർ ഉത്തേജിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് എഫക്റ്റർ പ്രവർത്തനം വിലയിരുത്തുക, കൂടാതെ CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend), TNFα-ഫ്ലൂറസെൻ ഐസോത്തിയോസയനേറ്റ് (FITC) (MAb11, BD) എന്നിവ നിരീക്ഷിക്കുക. PMA (20 ng/ml), അയണോമൈസിൻ (1μg/ml) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് qPCR, ChIP കോശങ്ങളെ 4 മണിക്കൂർ ഉത്തേജിപ്പിക്കുക. PMA (20 ng/ml), അയണോമൈസിൻ (1 μg/ml) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പും ശേഷവും 4 മണിക്കൂർ ELISA സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ശേഖരിച്ചു.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ഉപയോഗിച്ച് RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ പിന്തുടരുക. സാമ്പിൾ ഏകീകരിക്കാൻ QIAshredder (QIAGEN) ഉപയോഗിക്കുക. പൂരക DNA (cDNA) സമന്വയിപ്പിക്കാൻ ഉയർന്ന ശേഷിയുള്ള RNA മുതൽ cDNA കിറ്റ് (Thermo Fisher Scientific) ഉപയോഗിക്കുക. ഇനിപ്പറയുന്ന പ്രോബുകൾ ഉപയോഗിച്ച് (നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്) ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ അളക്കാൻ TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ഉപയോഗിക്കുക: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)], Hs01010726_m1 (SLC22A2). മൈക്രോആമ്പ് ഒപ്റ്റിക്കൽ ഫിലിം ഉപയോഗിച്ച് മൈക്രോആമ്പ് ഫാസ്റ്റ് ഒപ്റ്റിക്കൽ 96-വെൽ റിയാക്ഷൻ പ്ലേറ്റിൽ (അപ്ലൈഡ് ബയോസിസ്റ്റംസ്) സ്റ്റെപ്പ് വൺപ്ലസ് റിയൽ-ടൈം പിസിആർ സിസ്റ്റത്തിൽ (അപ്ലൈഡ് ബയോസിസ്റ്റംസ്) (അപ്ലൈഡ് ബയോസിസ്റ്റംസ്) സാമ്പിളുകൾ പ്രവർത്തിപ്പിച്ചു. 35 കവിയുന്ന ഏതൊരു സിടി മൂല്യവും ഡിറ്റക്ഷൻ ത്രെഷോൾഡിന് മുകളിലായി കണക്കാക്കപ്പെടുകയും കണ്ടെത്താനാകാത്തതായി അടയാളപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്തു.
മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ChIP നടത്തുക (58). ചുരുക്കത്തിൽ, കോശങ്ങളെ ഫോർമാൽഡിഹൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുകയും (അന്തിമ സാന്ദ്രത 1.42%) മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 10 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. 10 മിനിറ്റ് ഐസിൽ സപ്ലിമെന്റഡ് സ്വീലിംഗ് ബഫർ (25 mM ഹെപ്പസ്, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.1% NP-40) ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് വിവരിച്ചതുപോലെ ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷൻ ബഫറിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുക (58). തുടർന്ന് സാമ്പിൾ ഇനിപ്പറയുന്ന സൈക്കിളുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സോണിക്കേറ്റ് ചെയ്തു: 10 സൈക്കിളുകൾ (20 1-സെക്കൻഡ് പൾസുകൾ) കൂടാതെ 40 സെക്കൻഡ് സ്റ്റാറ്റിക് സമയം. ChIP-ഗ്രേഡ് ഇമ്യൂണോഗ്ലോബുലിൻ G (സെൽ സിഗ്നലിംഗ് ടെക്നോളജി; 1μl), ഹിസ്റ്റോൺ H3 (സെൽ സിഗ്നലിംഗ് ടെക്നോളജി; 3μl), NFAT (ഇൻവിട്രോജൻ; 3μl), SP1 (സെൽ സിഗ്നലിംഗ് ടെക്നോളജി; 3μl) ആന്റിബോഡികൾ 4°CC ഷേക്കിൽ സാമ്പിളിനൊപ്പം രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. പ്രോട്ടീൻ എ ബീഡുകൾ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) 4°C-ൽ സാമ്പിളിൽ 1 മണിക്കൂർ നേരിയ കുലുക്കത്തോടെ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് ഡിഎൻഎയെ സമ്പുഷ്ടമാക്കാൻ ചെലെക്സ് ബീഡുകൾ (ബയോ-റാഡ്) ഉപയോഗിക്കുക, പ്രോട്ടീൻ ദഹനത്തിനായി പ്രോട്ടീനേസ് കെ (തെർമോ ഫിഷർ) ഉപയോഗിക്കുക. പിസിആർ വഴി ടിഎൻഎഫ്α പ്രൊമോട്ടർ കണ്ടെത്തി: ഫോർവേഡ്, ജിജിജി ടിഎടി സിസിടി ടിജിഎ ടിജിഎ ടിജിടി; നേരെമറിച്ച്, ജിടിജി സിസിഎ എസിഎ എസിജി ജിസിസി ടിടിടി എടിഎ ടിജി (207-ബിപി ഉൽപ്പന്നം). ഇമേജ് ലാബ് (ബയോ-റാഡ്) നിർമ്മിച്ച ചിത്രങ്ങൾ ഇമേജ് ജെ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് അളവ് നിർണ്ണയിച്ചു.
മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ സെൽ കൾച്ചർ സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ശേഖരിച്ചു. മനുഷ്യ TNFα ELISA കിറ്റ് (ഇൻവിട്രോജൻ), മനുഷ്യ IL-2 ELISA കിറ്റ് (ഇൻവിട്രോജൻ), മനുഷ്യ IFN-γ ELISA കിറ്റ് (Abcam) എന്നിവയുടെ നിർമ്മാതാവിന്റെ നടപടിക്രമങ്ങൾക്കനുസൃതമായാണ് നിർണ്ണയം നടത്തിയത്. നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്, TNFα, IL-2 എന്നിവ കണ്ടെത്തുന്നതിന് സൂപ്പർനേറ്റന്റ് 1:100 എന്ന അനുപാതത്തിലും IFN-γ കണ്ടെത്താൻ 1:3 എന്ന അനുപാതത്തിലും നേർപ്പിച്ചു. 450 nm-ൽ ആഗിരണം അളക്കാൻ EnVision 2104 മൾട്ടിലേബൽ റീഡർ (പെർക്കിൻഎൽമർ) ഉപയോഗിക്കുക.
ഫിക്കോൾ ഗ്രേഡിയന്റ് ഡെൻസിറ്റി സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ല്യൂക്കോസൈറ്റ് സെപ്പറേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് (STEMCELL ടെക്നോളജീസ്) PBMC വേർതിരിച്ചു. CD3 ബീഡുകൾ (മിൽറ്റെനി) ഉപയോഗിച്ച് CD3 + സെല്ലുകൾ PBMC യിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചു. MNA യുടെ സാന്നിധ്യത്തിലോ അഭാവത്തിലോ, CD3+ സെല്ലുകളെ പ്ലേറ്റ്-ബൗണ്ട് CD3 (5μg/ml), ലയിക്കുന്ന CD28 (3μg/ml), IL-2 (300 U/ml; Proleukin) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 3 ദിവസത്തേക്ക് സജീവമാക്കി. 3 ദിവസത്തിനുശേഷം, കോശങ്ങൾ ശേഖരിച്ച് 0.9% സലൈൻ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, പെല്ലറ്റ് സ്നാപ്പ് ഫ്രീസ് ചെയ്തു. 123 കൗണ്ട് eBeads ഉപയോഗിച്ച് ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി (സൈടെക് അറോറ; 3L-16V-14B-8R കോൺഫിഗറേഷൻ) വഴി സെൽ കൗണ്ട് നടത്തി.
മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ മെറ്റബോളൈറ്റുകളെ വേർതിരിച്ചെടുക്കുക. ഉണങ്ങിയ സത്ത് 4000 സെൽ തുല്യത/μl സാന്ദ്രതയിൽ പുനഃസംഘടിപ്പിച്ചു. റിവേഴ്‌സ്ഡ്-ഫേസ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി (1290 ഇൻഫിനിറ്റി II, അജിലന്റ് ടെക്നോളജീസ്, സാന്താ ക്ലാര, CA) ഉം CORTECS T3 കോളം (2.1×150 mm, കണികാ വലിപ്പം 1.6-μm, പോർ സൈസ് 120-Å; #186008500, വാട്ടേഴ്‌സ്) ഉം ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിൾ വിശകലനം ചെയ്യുക. പോളാർ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ (6470, അജിലന്റ്), ഇതിൽ ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോണൈസേഷൻ പോസിറ്റീവ് മോഡിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു. മൊബൈൽ ഘട്ടം A 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡ് (H2O ൽ), മൊബൈൽ ഘട്ടം B 90% അസെറ്റോണിട്രൈൽ, 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡ് എന്നിവയാണ്. 100% A ന് 0 മുതൽ 2 മിനിറ്റ് വരെയും, 99% B ന് 2 മുതൽ 7.1 മിനിറ്റ് വരെയും, 99% B ന് 7.1 മുതൽ 8 മിനിറ്റ് വരെയും ആണ് LC ഗ്രേഡിയന്റ്. തുടർന്ന് 0.6 മില്ലി/മിനിറ്റ് എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ മൊബൈൽ ഫേസ് A ഉപയോഗിച്ച് 3 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് വീണ്ടും സന്തുലിതമാക്കുക. ഫ്ലോ റേറ്റ് 0.4 മില്ലി/മിനിറ്റ് ആണ്, കോളം ചേമ്പർ 50°C ലേക്ക് ചൂടാക്കുന്നു. നിലനിർത്തൽ സമയവും (RT) പരിവർത്തനവും (RT = 0.882 മിനിറ്റ്, പരിവർത്തനം 1 = 137→94.1, പരിവർത്തനം 2 = 137→92 , പരിവർത്തനം 3 = 137→78) സ്ഥാപിക്കാൻ MNA യുടെ പ്യുവർ കെമിക്കൽ സ്റ്റാൻഡേർഡ് (M320995, ടൊറന്റോ റിസർച്ച് കെമിക്കൽ കമ്പനി, നോർത്ത് യോർക്ക്, ഒന്റാറിയോ, കാനഡ) ഉപയോഗിക്കുക. മൂന്ന് സംക്രമണങ്ങളും ശരിയായ നിലനിർത്തൽ സമയത്ത് സംഭവിക്കുമ്പോൾ, പ്രത്യേകത ഉറപ്പാക്കാൻ അളവെടുപ്പിനായി സംക്രമണം 1 ഉപയോഗിക്കുന്നു. സ്റ്റോക്ക് ലായനിയുടെ (1 mg/ml) ആറ് സീരിയൽ നേർപ്പിക്കലുകൾ നടത്തി യഥാക്രമം 0.1, 1.0, 10, 100 ng/ml, 1.0, 10μg/ml എന്നീ മാനദണ്ഡങ്ങൾ നേടിയാണ് MNA (ടൊറന്റോ റിസർച്ച് കെമിക്കൽ കമ്പനി) യുടെ സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് സൃഷ്ടിച്ചത്. യഥാക്രമം ദ്രാവകം 0.1, 1.0, 100 ng/ml, 1.0, 10μg/ml എന്നീ മാനദണ്ഡങ്ങൾ ലഭിച്ചു. കണ്ടെത്തൽ പരിധി 1 ng/ml ആണ്, രേഖീയ പ്രതികരണം 10 ng/ml നും 10μg/ml നും ഇടയിലാണ്. LC/MS വിശകലനത്തിനായി രണ്ട് മൈക്രോലിറ്റർ സാമ്പിളിന്റെയും സ്റ്റാൻഡേർഡിന്റെയും ഓരോ കുത്തിവയ്പ്പും ഉപയോഗിക്കുന്നു, വിശകലന പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിന്റെ സ്ഥിരത ഉറപ്പാക്കാൻ ഓരോ എട്ട് കുത്തിവയ്പ്പുകളിലും ഒരു മിക്സഡ് ക്വാളിറ്റി കൺട്രോൾ സാമ്പിൾ പ്രവർത്തിപ്പിക്കുന്നു. എല്ലാ MNA- ചികിത്സിച്ച സെൽ സാമ്പിളുകളുടെയും MNA പ്രതികരണങ്ങൾ അസ്സെയുടെ രേഖീയ പരിധിക്കുള്ളിലായിരുന്നു. MassHunter ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് അനാലിസിസ് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (v9.0, Agilent) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡാറ്റ വിശകലനം നടത്തിയത്.
രണ്ടാം തലമുറ αFR-CAR നിർമ്മാണം സോങ്ങ് തുടങ്ങിയവരിൽ നിന്ന് എടുത്തതാണ് (59). ചുരുക്കത്തിൽ, നിർമ്മാണത്തിൽ ഇനിപ്പറയുന്ന ഉള്ളടക്കങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു: CD8a ലീഡർ സീക്വൻസ്, ഹ്യൂമൻ αFR-നിർദ്ദിഷ്ട സിംഗിൾ-ചെയിൻ വേരിയബിൾ ഫ്രാഗ്മെന്റ്, CD8a ഹിഞ്ച് ആൻഡ് ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ മേഖല, CD27 ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്ൻ, CD3z ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്ൻ. പൂർണ്ണമായ CAR ശ്രേണി GenScript ഉപയോഗിച്ച് സമന്വയിപ്പിച്ചു, തുടർന്ന് ട്രാൻസ്ഡക്ഷൻ കാര്യക്ഷമത വിലയിരുത്താൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന GFP എക്സ്പ്രഷൻ കാസറ്റിന്റെ അപ്‌സ്ട്രീമിലെ രണ്ടാം തലമുറ ലെന്റിവൈറൽ എക്സ്പ്രഷൻ വെക്റ്ററിലേക്ക് ക്ലോൺ ചെയ്തു.
HEK293T കോശങ്ങളുടെ ട്രാൻസ്ഫെക്ഷൻ വഴിയാണ് ലെന്റിവൈറസ് ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നത് [അമേരിക്കൻ ടൈപ്പ് കൾച്ചർ കളക്ഷൻ (ATCC); 10% ഫീറ്റൽ ബോവിൻ സെറം (FBS), 1% പെൻസ്ട്രെപ്പ് എന്നിവ അടങ്ങിയ ഡൽബെക്കോയുടെ പരിഷ്കരിച്ച ഈഗിൾ മീഡിയത്തിൽ വളർത്തിയതും CAR-GFP വെക്റ്റർ ഉപയോഗിക്കുന്നതും പാക്കേജിംഗ് പ്ലാസ്മിഡുകൾ (psPAX2, pMD2.G, ആഡ്ജീൻ) ലിപ്പോഫെക്ഷൻ അമിൻ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ഉപയോഗിക്കുന്നതുമാണ്. ട്രാൻസ്ഫെക്ഷൻ കഴിഞ്ഞ് 48, 72 മണിക്കൂറുകൾക്ക് ശേഷം വൈറസ് അടങ്ങിയ സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ശേഖരിച്ച്, ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത്, അൾട്രാസെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി സാന്ദ്രീകരിച്ചു. ട്രാൻസ്ഡക്ഷൻ വരെ സാന്ദ്രീകൃത വൈറൽ സൂപ്പർനേറ്റന്റിനെ -80°C-ൽ സൂക്ഷിക്കുക.
ഫിക്കോൾ ഗ്രേഡിയന്റ് ഡെൻസിറ്റി സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ആരോഗ്യമുള്ള ദാതാവിന്റെ ല്യൂക്കോസൈറ്റ് സെപ്പറേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് (STEMCELL ടെക്നോളജീസ്) PBMC വേർതിരിക്കുന്നു. PBMC യിൽ നിന്ന് CD8+ കോശങ്ങളെ വേർതിരിക്കാൻ പോസിറ്റീവ് സെലക്ഷൻ CD8 മൈക്രോബീഡുകൾ (Miltenyi) ഉപയോഗിക്കുക. TransAct (Miltenyi) ഉപയോഗിച്ചും TexMACS മീഡിയത്തിലും T കോശങ്ങളെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുക [Miltenyi; 3% ചൂട്-നിർജ്ജീവമാക്കിയ മനുഷ്യ സെറം, 1% PenStrep, IL-2 (300 U/ml) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്തു]. ഉത്തേജനത്തിന് ഇരുപത്തിനാല് മണിക്കൂറിന് ശേഷം, ലെന്റിവൈറസ് (106 സെല്ലുകളിൽ 10 μl സാന്ദ്രീകൃത വൈറസ് സൂപ്പർനേറ്റന്റ്) ഉപയോഗിച്ച് T സെല്ലുകളെ ട്രാൻസ്ഡ്യൂസ് ചെയ്തു. Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ എന്നിവയിൽ ട്രാൻസ്ഡക്ഷൻ കഴിഞ്ഞ് 1 മുതൽ 3 ദിവസം വരെ, കുറഞ്ഞത് 30% ട്രാൻസ്ഡക്ഷൻ കാര്യക്ഷമത തെളിയിക്കാൻ കോശങ്ങളുടെ GFP എക്സ്പ്രഷൻ വിലയിരുത്തുക.
ഇമ്മ്യൂണോകൾട്ടിൽ (STEMCELL ടെക്നോളജീസ്; 1% പെൻസ്ട്രെപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്തത്) 24 മണിക്കൂർ CAR-T സെല്ലുകൾ കൾച്ചർ ചെയ്തു, ഇനിപ്പറയുന്ന വ്യവസ്ഥകളിൽ: ചികിത്സിക്കാതെ, 250 μM അഡിനോസിൻ അല്ലെങ്കിൽ 10 mM MNA ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു. പ്രീട്രീറ്റ്മെന്റിന് ശേഷം, CAR-T സെല്ലുകൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി 20,000 SK-OV-3 സെല്ലുകളുമായി സംയോജിപ്പിച്ചു [ATCC; മക്കോയ് 5A മീഡിയത്തിൽ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) 10% FBS ഉം 1% പെൻസ്ട്രെപ്പും 10-ൽ ചേർത്തു: സപ്ലിമെന്റഡ് ഇമ്മ്യൂണോകൾട്ട് മീഡിയത്തിൽ 1 എന്ന ലക്ഷ്യ അനുപാതത്തിന്റെ ഇഫക്റ്റർ ട്രിപ്പിളിക്കേറ്റായി ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തു. ഡിജിറ്റലിസ് സാപ്പോണിൻ (0.5mg/ml; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ഉപയോഗിച്ച് ലൈസ് ചെയ്ത SK-OV-3 സെല്ലുകളും SK-OV-3 സെല്ലുകളും യഥാക്രമം നെഗറ്റീവ്, പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണങ്ങളായി ഉപയോഗിച്ചു. 24 മണിക്കൂർ സഹ-കൃഷിക്ക് ശേഷം, സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ശേഖരിക്കുകയും നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി ലാക്റ്റേറ്റ് ഡീഹൈഡ്രജനേസ് (LDH) അളക്കുകയും ചെയ്തു (LDH ഗ്ലോ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി അസ്സേ കിറ്റ്, പ്രോമെഗ). LDH സൂപ്പർനേറ്റന്റ് LDH ബഫറിൽ 1:50 എന്ന അനുപാതത്തിൽ ലയിപ്പിച്ചു. കൊല്ലുന്നതിന്റെ ശതമാനം ഇനിപ്പറയുന്ന ഫോർമുല ഉപയോഗിച്ച് അളന്നു: കൊല്ലുന്നതിന്റെ ശതമാനം = തിരുത്തലിന്റെ ശതമാനം / പരമാവധി കൊല്ലൽ നിരക്ക് x 100%, ഇവിടെ തിരുത്തലിന്റെ ശതമാനം = സഹ-കൾച്ചർ-ടി കോശങ്ങൾ മാത്രം, പരമാവധി കൊല്ലൽ നിരക്ക് = പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണം-നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണം.
വാചകത്തിലോ മെറ്റീരിയലുകളിലോ രീതികളിലോ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനത്തിനായി ഗ്രാഫ്പാഡ് പ്രിസം 8, മൈക്രോസോഫ്റ്റ് എക്സൽ അല്ലെങ്കിൽ ആർ v3.6.0 എന്നിവ ഉപയോഗിക്കുക. ഒരേ രോഗിയിൽ നിന്ന് ഒന്നിലധികം സാമ്പിളുകൾ ശേഖരിക്കുകയാണെങ്കിൽ (അസൈറ്റുകൾ, ട്യൂമർ പോലുള്ളവ), ഞങ്ങൾ ഒരു ജോടിയാക്കിയ ടി ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു അല്ലെങ്കിൽ ഉചിതമായ രീതിയിൽ ഒരു ലീനിയർ അല്ലെങ്കിൽ സാമാന്യവൽക്കരിച്ച മോഡലിൽ രോഗിയെ റാൻഡം ഇഫക്റ്റായി ഉൾപ്പെടുത്തുന്നു. മെറ്റബോളമിക് വിശകലനത്തിന്, പ്രാധാന്യ പരിശോധന മൂന്ന് തവണയാണ് നടത്തുന്നത്.
ഈ ലേഖനത്തിനായുള്ള അനുബന്ധ വസ്തുക്കൾക്ക്, ദയവായി http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 കാണുക.
ക്രിയേറ്റീവ് കോമൺസ് ആട്രിബ്യൂഷൻ-നോൺ-കൊമേഴ്‌സ്യൽ ലൈസൻസിന്റെ നിബന്ധനകൾക്ക് കീഴിൽ വിതരണം ചെയ്യുന്ന ഒരു ഓപ്പൺ ആക്‌സസ് ലേഖനമാണിത്, അന്തിമ ഉപയോഗം വാണിജ്യ നേട്ടത്തിനായിട്ടല്ലാത്തിടത്തോളം, യഥാർത്ഥ കൃതി ശരിയാണെന്നാണ് അടിസ്ഥാനം എങ്കിൽ, ഏത് മാധ്യമത്തിലും ഉപയോഗിക്കാനും വിതരണം ചെയ്യാനും പുനർനിർമ്മിക്കാനും ഇത് അനുവദിക്കുന്നു. റഫറൻസ്.
കുറിപ്പ്: നിങ്ങൾ പേജിലേക്ക് ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന വ്യക്തിക്ക് ഇമെയിൽ കാണണമെന്ന് നിങ്ങൾ ആഗ്രഹിക്കുന്നുണ്ടെന്നും അത് സ്പാം അല്ലെന്നും അറിയാൻ വേണ്ടി മാത്രമേ നിങ്ങളുടെ ഇമെയിൽ വിലാസം നൽകാൻ ഞങ്ങൾ ആവശ്യപ്പെടുകയുള്ളൂ. ഞങ്ങൾ ഒരു ഇമെയിൽ വിലാസവും പിടിച്ചെടുക്കില്ല.
നിങ്ങൾ ഒരു സന്ദർശകനാണോ എന്ന് പരിശോധിക്കുന്നതിനും സ്വയമേവയുള്ള സ്പാം സമർപ്പിക്കൽ തടയുന്നതിനും ഈ ചോദ്യം ഉപയോഗിക്കുന്നു.
മാരിസ കെ. കിൽഗൂർ (മരിസ കെ. കിൽഗോർ), സാറാ മാക്‌ഫെർസൺ (സാറ മാക്‌ഫെർസൺ), ലോറൻ ജി. സക്കറിയാസ് (ലോറൻ ജി. സക്കറിയാസ്), അബിഗെയ്ൽ എലി ആരിസ് ജി. വാട്‌സൺ (എച്ച്. വാട്‌സൺ), ജോൺ സ്റ്റാഗ് (ജോൺ സ്‌റ്റാഗ്), ബ്രാഡ് എച്ച്. (റാൽഫ് ജെ. ഡിബെറാർഡിനിസ്), റസ്സൽ ജി ജോൺസ് (റസ്സൽ ജി ജോൺസ്), ഫിനാസ് ടി ഹാമിൽട്ടൺ (ഫിനിയസ് ടി.
ടി കോശങ്ങളുടെ രോഗപ്രതിരോധ അടിച്ചമർത്തലിന് MNA സംഭാവന നൽകുന്നു, കൂടാതെ മനുഷ്യ ക്യാൻസർ ചികിത്സയ്ക്കുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള ഇമ്മ്യൂണോതെറാപ്പി ലക്ഷ്യത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
മാരിസ കെ. കിൽഗൂർ (മരിസ കെ. കിൽഗോർ), സാറാ മാക്‌ഫെർസൺ (സാറ മാക്‌ഫെർസൺ), ലോറൻ ജി. സക്കറിയാസ് (ലോറൻ ജി. സക്കറിയാസ്), അബിഗെയ്ൽ എലി ആരിസ് ജി. വാട്‌സൺ (എച്ച്. വാട്‌സൺ), ജോൺ സ്റ്റാഗ് (ജോൺ സ്‌റ്റാഗ്), ബ്രാഡ് എച്ച്. (റാൽഫ് ജെ. ഡിബെറാർഡിനിസ്), റസ്സൽ ജി ജോൺസ് (റസ്സൽ ജി ജോൺസ്), ഫിനാസ് ടി ഹാമിൽട്ടൺ (ഫിനിയസ് ടി.
ടി കോശങ്ങളുടെ രോഗപ്രതിരോധ അടിച്ചമർത്തലിന് MNA സംഭാവന നൽകുന്നു, കൂടാതെ മനുഷ്യ ക്യാൻസർ ചികിത്സയ്ക്കുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള ഇമ്മ്യൂണോതെറാപ്പി ലക്ഷ്യത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
©2021 അമേരിക്കൻ അസോസിയേഷൻ ഫോർ ദി അഡ്വാൻസ്‌മെൻ്റ് ഓഫ് സയൻസ്. എല്ലാ അവകാശങ്ങളും നിക്ഷിപ്തം. HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef, COUNTER എന്നിവയുടെ പങ്കാളിയാണ് AAAS. സയൻസ് അഡ്വാൻസസ് ISSN 2375-2548.